Orleâncio Gomes Ripardo. Papel protetor do gene humano APOE4 em camundongos transgênicos submetidos pela desnutrição e infecção pelo Criptosporidium parvum. 2012. 185 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-06-18T11:13:59Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_ograzevedo.pdf: 6153764 bytes, checksum: 5bbc0cccb42e25c0dff6f9bd0ea5c042 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-06-18T15:36:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_ograzevedo.pdf: 6153764 bytes, checksum: 5bbc0cccb42e25c0dff6f9bd0ea5c042 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-18T15:36:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_ograzevedo.pdf: 6153764 bytes, checksum: 5bbc0cccb42e25c0dff6f9bd0ea5c042 (MD5) Previous issue date: 2012 / The vicious cycle of enteric infections and malnutrition during childhood is a major public health problem with devastating consequences and its effects are not fully elucidated. Oria and colleagues in 2005 showed that children with heavy diarrhea burdens when carrying the APOE 4 gene had a better cognitive performance. The aim of this study was to evaluate the protective role of APOE 4 gene in C57BL6J mice challenged by malnutrition induced by a 2% protein diet and intestinal infection caused by Cryptosporidium parvum. We used male C57BL6J mice weighing in average 14g, challenged by malnutrition for a period of 14 days compound with 7 days of C. parvum infection through a single dose of 107 oocysts given by gavage. Study animals were separated according to their genotype, as following: wild-type, APOE knock-out, APOE 3/3 (carriers of the human APOE 3 gene) and APOE 4/4 (carriers of human APOE 4 gene). Control animals received PBS by gavage. Body weight of the animals was monitored daily. Mice were sacrificed in CO2 chamber with posterior cervical dislocation after 14 days from the beginning of the protocol. During the post-infection period, stools samples were collected from the infected mice every other day for real time quantitative PCR (qPCR) assays in order to quantify C. parvum oocysts released in the stools. Ileal samples were immediately frozen in liquid nitrogen and then stored in a freezer at -80°C for molecular analyses. Other samples were fixed in buffered paraformaldehyde (4%) for histological processing. Morphometric parameters were evaluated for villus height and crypt depth in the ileal segments. For detection of a proinflammatory cytokine panel (IL- 1β, IFN-γ, TNF-α, and IL-17), we used the multiplex assay (Luminex xMAP). In addition by qPCR, the cationic amino acid transporter (CAT-1), arginase 1, iNOS, and TLR9 were assessed. Regarding weight, we found a greater adaptation to weight loss in APOE 4 animals in the 2nd and 3rd days of malnutrition (p<0.05) and in the postinfection time there was a significant difference on the 2nd day (p<0.05) compared to all groups. In the morphometric analyses, we found villus blunting and crypt disorganization in APOE knockout mice. We found APOE 4 protection against these alterations compared to all groups (p<0.05). The C. parvum oocyst shedding data indicate an increase in the pro-inflammatory state and anti-parasitic effects seen in the APOE Ko and APOE 4/4 mice, as confirmed by a significant reduction of the C. parvum released in the stools. In addition, we found increased levels of the intestinal pro-inflammatory cytokine (IL-1β) (p<0.05) in the APOE Ko when compared with APOE3/3 and APOE4/4, higher levels of IFN-γ (p<0.05) when compared with wild-type and undernourished APOE Ko controls. The APOE Ko undernourished mice have increased intestinal levels of IL-17 compared with APOE Ko undernourished infected mice. qPCR data demonstrate that the presence of the APOE4 genotype in mice increased the primary transcripts of CAT-1 and arginase 1 in comparison to wild types, APOE Ko, and APOE 3/3 (p<0.05). Furtermore, APOE knockout mice had higher iNOS expression in comparison to all groups (p<0.05). The APOE 4 mice showed significant increase in the expression of TLR9 mRNA in the ileum when compared to APOE Ko mice (p<0.05). Altogether we concluded that the APOE 4 carriers have a balanced pro-inflammatory response, benefiting the C. parvum control, as seen by reduction of the parasite DNA released in the stools, and by improvements in the growth rates in the mice challenged malnutrition/infection, suggesting that the hosts carrying the APOE4 genotype have a better protection against the intestinal alterations induced by the compound challenge of C. parvum infection and malnutrition. / O ciclo vicioso de doenças entéricas na infância é um problema de saúde pública com consequências graves e seus efeitos no desenvolvimento infantil não estão totalmente elucidados. Oriá e colaboradores, em 2005, demonstraram que crianças portadoras do gene APOE 4 com alta morbidade de diarreia apresentavam um melhor desempenho em testes cognitivos. O objetivo desse trabalho foi avaliar o papel protetor do gene APOE 4 em camundongos C57BL6J submetidos à desnutrição induzida por uma ração pobre em proteína (2%) e pela infecção intestinal induzida pelo Criptosporidium parvum. Utilizamos camundongos C57BL6J machos com peso médio de 14 g, submetidos a um período de 14 dias de desnutrição e a 7 dias de infeção por C. parvum meio por meio da gavagem de 107 oocistos. Os animais foram separados segundo o genótipo: wildtype, APOE nocaute (ApoE Ko), APOE 3/3 (com gene APOE 3 humano) e APOE 4/4 (com gene APOE 4 humano). Os animais controles receberam PBS via gavagem. O peso dos animais foi monitorado diariamente. Os camundongos foram sacrificados em câmara de CO2 seguido de deslocamento cervical após 14 dias do início do protocolo. Durante o período de pós-infecção foram coletadas as fezes dos animais infectados em dias alternados, para a realização do PCR quantitativo em tempo real (qPCR) para a análise da quantidade de C. parvum liberada nas fezes. Amostras de íleo foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em freezer a -80ºC para as análises moleculares. Outras amostras foram fixadas em paraformaldeído tamponado (4%) para processamento histológico. Foram avaliados os parâmetros morfométricos de altura de vilo e profundidade de cripta nos segmentos ileais. Para a detecção de citocinas próinflamatórias de interesse (IL-1β, IFN- γ, TNF-α e IL-17), utilizou-se o ensaio multiplex (Luminex xMAP). Ainda por qPCR avaliou-se o transportador catiônico de aminoácidos (CAT-1), arginase 1, iNOS e TLR9. No peso encontramos uma maior adaptação a perda de peso nos animais APOE 4 no 2o e 3o dias de desnutrição em comparação a todos os grupos (p<0,05). No período de pós-infecção verificou-se diferença significante no 2o dia (p<0,05) em comparação a todos os grupos. Nas análises morfométricas, encontramos uma redução na altura de vilos e profundidade de criptas nos animais APOE nocautes, já nos animais APOE 4/4 ocorreu uma proteção contra esses danos em comparação a todos os grupos (p<0,05). Os dados da análise de liberação de oocistos nas fezes evidenciaram um aumento do estado pró-inflamatório e antiparasitário nos animais APOE Ko e APOE 4/4, verificado por meio de uma redução na quantidade de C. parvum liberado nas fezes de maneira significativa. Houve um aumento dos níveis intestinais das citocinas pró-inflamatórias IL-1β (p<0,05) nos animais APOE Ko desnutridos e infectados em comparação com APOE3/3 e APOE4/4, e altos níveis de IFN-γ (p<0,05) em comparação com os controles selvagens e o grupo APOE Ko desnutrido controle. Os animais desnutridos controles APOE Ko tiveram aumento dos níveis intestinais de IL-17 (p<0,05) quando comparados aos animais APOE Ko desnutridos infectados. Dados de qPCR evidenciam que a presença do genótipo APOE4 em camundongos aumenta os transcritos primários de CAT-1 e arginase - 1 no íleo em relação aos selvagens, APOE Ko e APOE3 (p<0,05) e que os animais nocautes aumentaram a expressão de iNOS em relação aos outros grupos (p<0,05). Os animais APOE 4 desnutridos e infectados apresentaram uma expressão significativamente aumentada nos níveis de mRNA para TLR9 no íleo comparado com os APOE Ko igualmente desafiados (p<0,05). A partir dos nossos achados, podemos concluir que o animais com genótipo APOE 4 possuem uma ação pró-inflamatória controlada, o que favorece o combate ao C. parvum, visto que reduz a quantidade de DNA do parasita liberado nas fezes e melhora a taxa de crescimento de animais submetidos pela desnutrição/infecção, sugerindo que hospedeiros com genótipo APOE 4 possuem uma maior proteção contra as alterações intestinais induzidas pela combinação de C. parvum e desnutrição.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-24T17:51:01Z No. of bitstreams: 1 Alberto kazuo fuzikawa.pdf: 276958 bytes, checksum: 80d1525e280d315c92a5de15284db642 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-24T17:51:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alberto kazuo fuzikawa.pdf: 276958 bytes, checksum: 80d1525e280d315c92a5de15284db642 (MD5) Previous issue date: 2007 / A apolipoproteína E (apoE) é um gene polimórfico, cujo produto protéico tem múltiplas funções no organismo humano, sobretudo no metabolismo lipídico. Tem sido investigado no contexto do envelhecimento, mas existem poucos estudos em populações bem definidas de idosos em países em desenvolvimento. Os objetivos deste trabalho foram (1) descrever a distribuição dos alelos comuns da apoE ( 2, 3, 4) e seus genótipos, numa população de 1.408 idosos (80,8% de todos os idosos com idade 60 anos) da linha de base da coorte de Bambuí, MG, Brasil, e estudar sua associação com variáveis demográficas (idade, sexo e cor da pele), (2) analisar a associação do polimorfismo da apoE com hipertensão arterial prevalente e variáveis biológicas (pressão arterial sistólica, diastólica, HDL colesterol, LDL colesterol e triglicérides), considerando potenciais fatores de confusão como idade, sexo, fatores de risco cardiovascular, ácido úrico e creatinina séricos. As amostras de DNA foram amplificadas pela reação em cadeia da polimerase e posteriormente digeridas com a enzima de restrição HhaI. O alelo 3 predominou (80,0%), seguido pelo 4 (13,5%) e 2 (6,5%). Todos os seis genótipos possíveis foram observados, sendo o genótipo 3 3 o mais freqüente (63,4%). Esta distribuição é semelhante à descrita em populações ocidentais. A análise de associação com variáveis demográficas foi feita por regressão logística multinomial, usando como variáveis dependentes os três alelos, seis genótipos e o número de alelos 4 por indivíduo. O sexo não se mostrou associado ao número de alelos 4, mas a cor de pele negra apresentou forte associação com a presença de dois alelos 4 (OR ajustado para idade e sexo = 7,38; IC 95% = 1,93-28,25), mostrando que Afro-brasileiros têm alta prevalência do alelo 4, como observado em populações negras Africanas. Nenhuma associação foi encontrada entre idade e o polimorfismo da apoE, sugerindo ausência de associação entre os genótipos e mortalidade nesta população. Hipertensão arterial, definida como pressão arterial sistólica 140 mmHg e / ou diastólica 90 mmHg, ou uso de medicação anti-hipertensiva, apresentou prevalência de 61,3%. Nas análises de associação com a pressão arterial e variáveis biológicas, a variável exploratória foi o genótipo da apoE, classificada em portadores de 2 ( 2 2 e 2 3) e portadores de 4 ( 4 4 e 3 4), tendo como grupo de referência os 3 3. Foram usados modelos de regressão linear múltipla para avaliar a associação com as variáveis biológicas e modelos de regressão de Poisson para estimar as razões de prevalência da hipertensão. Comparados aos homozigotos 3 3, os portadores de 2 tinham níveis séricos mais baixos de LDL colesterol (p < 0,001) e mais altos de triglicérides (p = 0,022), enquanto os portadores de 4 tinham níveis séricos mais altos de LDL colesterol (p = 0,036). Os portadores de 2 e de 4 não mostraram associação com a hipertensão arterial prevalente (razões de prevalência ajustados = 0,94, IC 95% = 0,83-1,07 e 0,98; IC 95% = 0,89-1,07, respectivamente), fornecendo evidência epidemiológica para a ausência de associação entre os genótipos da apoE com a hipertensão arterial prevalente entre idosos. / Apolipoprotein E (apoE) is a polymorphic gene, whose protein product is involved in several key roles in the human body, especially in lipid metabolism. It has been investigated in the context of aging, but there are few studies in well defined populations from developing countries. The objectives of this study were (1) to describe the allelic and genotypic distribution of the common apoE polymorphism ( 2, 3, 4) in a population of 1,408 elderly members (80.8% of all residents 60 years of age) from the baseline of a cohort from Bambuí city, Brazil, and to evaluate its association with demographic variables such as age, gender and skin color and (2) to analyze the association of the apoE polymorphism with prevalent arterial hypertension and biological variables (systolic blood pressure, diastolic blood pressure, HDL cholesterol, LDL cholesterol and triglycerides) in this population, considering potential confounding factors such as age, gender, cardiovascular risk factors, serum uric acid and creatinine. DNA samples were amplified by polymerase chain reaction and then digested with HhaI restriction enzyme. The 3 allele was predominant (80.0%), followed by 4 (13.5%) and 2 (6.5%). All six possible genotypes were observed, with 3 3 being the most frequent (63.4%). This distribution is similar to that described in other western populations. Analysis of association with demographic variables was done by multinomial logistic regression, using as dependent variables the three alleles, six genotypes and the number of 4 alleles per individual. Gender was not associated with the number of 4 alleles, but black skin color was strongly and independently associated with the presence of two 4 alleles (OR adjusted for age and gender = 7.38, 95% CI = 1.93-28.25), showing that African-Brazilians have a high prevalence of the 4 allele, as described in black African populations. No association was found between age and apoE polymorphism, suggesting an absence of association between apoE genotypes and mortality in this population. Arterial hypertension defined as systolic blood pressure 140 mmHg and / or diastolic blood pressure 90 mmHg, or use of antihypertensive medication, was present in 61.3% of participants. For the analysis of association with prevalent arterial hypertension and biological variables the exposure variable was the apoE genotype, divided as 2 carriers ( 2 2 and 2 3) and 4 carriers ( 4 4 and 3 4), having 3 homozygotes as the reference group. Multiple linear regression models were used to study association with biological variables and Poisson regression models to estimate prevalence ratios for hypertension. Compared to the 3 homozygotes, 2 carriers had lower levels of LDL cholesterol (p < 0.001) and higher levels of triglycerides (p = 0.022), while 4 carriers had higher levels of LDL cholesterol (p = 0.036). Neither the 2 or 4 carrier status was associated with hypertension (adjusted prevalence ratios = 0.94, 95% CI = 0.83-1.07 and 0.98, 95% CI = 0.89-1.07, respectively), providing epidemiologic evidence for the lack of association of apoE genotype with prevalent hypertension in old age.