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Estudo temporal da expressão genica de Fas, Fas-ligante, Bcl-w e citocinas Th1 em ilhotas pancreaticas, sangue e baço de camundongo NOD (diabetico não obeso)

Oliveira, Danielle Ventura de 23 August 2002 (has links)
Orientador: Ricardo de Lima Zollner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:51:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_DanielleVenturade_M.pdf: 26410248 bytes, checksum: 3438fd3666c623d712c3840ceb6c21e5 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: o diabetes mellitus do tipo I resulta da destruição autoimune das células ~ da ilhota pancreática. O camundongo NOD desenvolve o diabetes tipo I espontaneamente sendo utilizado como modelo para a expressão auto-imune dessa doença em humanos. O processo inflamatório das ilhotas pancreáticas (insulite), que precede a destruição das células ~, tem início por volta da 4a semana de vida tanto em machos quanto em fêmeas. Nestes animais a incidência do diabetes é predominante em fêmeas (com início ao redor da lSa semana) variando entre 60-90% e 10-20% em machos até 30 semanas de vida. A infiltração das ilhotas pancreáticas por células do sistema imune, seguida pela perda das célul~s ~produtoras de insulina é o aspecto histológico característico do diabetes tipo 1. Este pode envolver o contato entre células efetoras (linfócitos T CD4+ e CD8+) e célulasalvo (ilhota) resultando na liberação de mediadores solúveis. Citocinas produzidas pelas células ativadas no infiltrado inflamatório são os prováveis agentes da perda de função e destruição das células da ilhota e do diabetes. Linfócitos Thl produzem citocinas próinflamatórias como IL-2, IFN-y TNF-a contribuindo para patogênese do diabetes tipo I. Além disso, a apoptose das células ~tem sido associada com a manifestação do diabetes tanto em modelos experimentais como em humanos. Vários estudos implicam Fas, Fas-L, perforinas e TNF-a como efetores da morte por apoptose das ilhotas. No presente trabalho analisamos a expressão gênica de citocinas e componentes apoptóticos em ilhotasisoladas,pâncreas, sangueperiféricoe baço de camundongosNODnão diabéticos com idades entre 2-28 semanas de vida e diabéticos. Camundongos da linhagem CBA/j foram usados como controle. A detecção de apoptose in situ foi realizada pelas técnicas de Feu1gene TUNEL, morfometria para análise dos graus de insulite e imunoistoquímica para identificação do infiltrado inflamatório. Os resultados confirmam a presença de citocinas pró-inflamatórias em ilhotas isoladas por todo período de vida do animal. Estes dados foram correlacionados com a presença de apoptose (detectada pelas técnicas de Feulgen e TUNEL), análise da extensão da insulite e fenotipagem do infiltrado com o avanço do processo inflamatório e envelhecimento do animal. Além disso, o aumento da expressão de Fas, Fas-L e Bc1-wnos animais com intenso processo inflamatório sugere a apoptose como ocorrência de mecanismos efetores que, associada à expressão de citocinas pró-inflamatórias, correlacionam-se com o avanço dos estágios do processo inflamatório na ilhota pancreática no camundongoNOD / Abstract: Type 1 diabetes results from specific autoimmune destruction of beta cells in pancreatic islets. Non obese diabetic (NOD) mice develop type 1 diabetes spontaneously and is used as animal model for human insulin dependent diabetes mellitus. Inflammation of pancreatic islet (insulitis) that precedes beta cell destruction begins at about 4 weeks of age in both female and male NOD mice. However, there is a remarkable gender disparity in the cumulative incidence ofdiabetes: 60-90% offemales and only 10-20% ofmales by 30 weeks of age. Diabetes-prone female NOD mice develop diabetes from as early 15 weeks of age. Infiltration of pancreatic islet by immune/inflammatory cells (insulitis), followed by loss of the insulin producing beta cells is the histological feature of type 1 diabetes. This may involve direct contacts between infiltrating monocytic/lymphocytic cells (effectors), inc1udingCD4+ and CD8+ T cells and islet beta cells (targets) and/or may result from the release of soluble mediators from effector cells. Cytokines produced by infiltrating activated cells are candidate mediators of impaired function and destruction of islet beta cells. Thl cells produce interleukin 2 (IL-2), interferon y (IFN-y) and tumor necrosis factor a (TNF-a) contributing to the pathogenesis of type 1 diabetes. Moreover, p-cell apoptosis has been associated with diabetes onset in both animaIs models and recently diagnosed diabetic patients. Several apoptotic pathways have been implicated in islet destruction, inc1uding Fas, perforins, and TNF-a. Many studies have altematively considered Fas-ligand (Fas-L), perforins, or TNF- a as effectors of apoptotic islet cell death. Therefore, we anaIyzed by reverse transcriptase reaction (RT-PCR) whether the gene expression of these cytokines and apoptotic components is detectable in pancreatic islets of NOD mice aging 2 to 28 weeks (prediabetic), using isolated islet of CBA/j as a non related animal controI. Our results confirm the presence of TNF-a and IFN-y message in NOD islets at the very early stage of inflammation correIating the enhancement of their expression with destructive insulitis. Furthermore, Fas, Fas-L and Bc1-wgenes in islets ofNOD mice were detectable at 2 weeks of age and enhance oftheir gene expression was associated with increase of islet infiItrating cells. On the other hand, these apoptotic components were expressed at low levels in islet of CBA/j. These results suggest that expression of mRNA for Fas, Fas-L and Bc1-wcorrelates with the stages of the islet inflammation in NOD mice / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica
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Avaliação de citotoxicidade e indução de diferenciação e apoptose em celulas de leucemia (HL60) pela dimetilamida-crotonina

Anazetti, Maristella Conte 07 July 2003 (has links)
Orientadores: Nora Marcela Haun Quiros, Patricia da Silva Melo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:32:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anazetti_MaristellaConte_M.pdf: 6470098 bytes, checksum: e8af921549af2ef3a2641ca1d869e984 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Atualmente, morte celular por apoptose é objeto de intensa pesquisa devido à susceptibilidade de células tumorais, incluindo linhagens de células de leucemia e de linfoma, a sofrerem este tipo de morte celular em resposta a determinados agentes anti tumorais. O estresse oxidativo induzido, entre outros fatores, pela diminuição dos níveis de glutationa intracelular, está envolvido no mecanismo de ação de vários compostos, sinalizando as células ao processo apoptótico, envolvendo eventos mediados por cisteino proteases (caspases). Neste estudo, nós examinamos a indução de diferenciação morfológica e morte celular por apoptose pela dimetilamida-crotonina (DCR) em células da leucemia promielocítica humana HL60. A DCR é um derivado sintético da desidrocrotonina (DHC), uma diterpeno lactona extraída das cascas de Croton cajucara, uma planta da região amazônica. A DCR apresentou um efeito inibitório similar ao composto original conforme avaliado por diferentes parâmetros de citotoxicidade e ambos os compostos induziram diferenciação fenotípica em células HL60. Em contraste, não foram observadas citotoxicidade ou alterações morfológicas associadas com apoptose em linfócitos de sangue periférico humano após tratamento com os compostos em estudo nas concentrações utilizadas (O - 400flM). Com base nas alterações morfológicas, no padrão de &agmentação de DNA e na análise de simetria de membrana de células marcadas com anexina V liodeto de propídeo por citometria de fluxo, DHC e DCR induziram apoptose em células HL60 com a mesma eficiência. Ambos os compostos promoveram a ativação de caspases-2, -6 e -9. A ativação de caspase-9 pela DHC e DCR em células HL60 sugere indução de apoptose através da via mitocondrial. Com o intuito de analisar o possível envolvimento do estresse oxidativo no mecanismo de toxicidade dos compostos, foram determinados os níveis de glutationa e ocorrência de peroxidação lipídica. O nível de GSH diminuiu cerca de 30% e a produção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) aumentou 4 vezes após o tratamento com ambos os compostos em concentrações próximas ao ICso (250 JlM). A suplementação do meio de cultura com 15 mM de GSH protegeu as células da toxicidade induzida pelos compostos em estudo. Nossos resultados indicam que a DCR e a DHC induzem apoptose em células HL60 em parte pela conjugação com GSH e indução de estresse oxidativo, o qual seria responsável pela peroxidação lipídica e ativação da cascata de caspases através da via mitocondrial. Além disso, resultados de espectroscopia UV Nis sugerem a formação de conjugados entre a GSH e o grupamento O=CH-CH=CH2, presente na DHC e na DCR. Desta forma, os compostos estudados possuem características almejadas para quimioterápicos desencadeando indução de diferenciação morfológica e de apoptose em células da leucemia HL60 / Abstract: Apoptosis is subject of intense research due to the susceptibility of tumor cells, including leukemia and lymphom celllines that have been found to undergo this kind of cell death in response to antitumor agents. The oxidative stress induced, by others factors, by the decrease of glutathione levels is involved in the action mechanism of several compounds, signalIing the celIs to apoptotic process, involving events mediated by cystein proteases (caspases). In this study, we evaluated the morphological differentiation and celI death by apoptosis induction by dimethylamide-crotonin (DCR) in human HL60 promylocitic leukemia cells. The DCR is a synthetic derivative of dehydrocrotonin (DHC), a diterpene lactone isolated ftom the Croton cajucara, an Amazonian planto The dimethylamide crotonin presented a similar inhibitory effect that its parent compound evaluated by different endpoints of cytotoxicity and both compounds induced morphological differentiation on HL60 cells. In contrast, no cytotoxicity or morphological alterations associated with apoptosis were observed in human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) after treatment with these studied compounds in the concentrations used (0-400 flM). Based on morphological changes and the pattem of DNA ftagmentation and the symmetry analysis of cell membrane labelIed with annexin V /propidium iodide by flow cytometry, DHC and DCR induced apoptosis on HL60 cells with similar efficiency. Both compounds were effective in triggering the activation of caspase-2, -6 and -9. The caspase 9 activation by DHC and DCR on leukemic cells suggests apoptosis induction by the mitochondrial pathway. In attempt to analyse the possible involvement of oxidative stress on the toxicity action mechanism of these compounds, we determined the GSH levels and lipid peroxidation occurrence. The glutathione levels decreased around 30% and the thiobarbituric acid substance reactive (TBARS) increased 4 times after treatment with both compounds in concentrations around the IC50 value (250 1lM). The culture medium supplementation with 15-mM GSH protected the cells :tIom the toxicity induced by both compounds. The results indicate that DHC and DCR induce apoptosis on HL60 cells in part by conjugation with GSH and oxidative stress induction, which could be responsible for lipid peroxidation and caspases activation by the mitochondrial pathway. Moreover, the spectroscopic analyses of DHC or DCR in the presence of GSH 15 mM suggest the conjugate formation between GSH and O=CH-CH=CH2 of DHC or DCR In this way, the studied compounds have the desirable hemotherapic characteristics, triggering cell differentiation and apoptosis / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular
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Ação citotoxica e transformante do antineoplasico tamoxifeno sobre celulas da linhagem vero

Barbieri, Grazieli Nogueira Farias 05 November 2004 (has links)
Orientador: Selma Candelaria Genari / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:12:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbieri_GrazieliNogueiraFarias_M.pdf: 1438246 bytes, checksum: be15c30fb4ec573590a0b5c9f593b5da (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: O tamoxifeno é um agente anti-estrógeno não esteróide utilizado como adjuvante no tratamento do câncer de mama e atualmente também no tratamento preventivo de mulheres com elevado risco potencial para o desenvolvimento dessa doença. Tal medicamento, a despeito da comprovada ação antineoplásica no tecido mamário, está associado ao aumento da incidência de câncer endometrial nas pacientes tratadas, dentre outros efeitos colaterais. Portanto, existe a necessidade que as ações do tamoxifeno nas propriedades dos diferentes tipos celulares sejam amplamente investigadas para a melhor compreensão das mesmas. Células da linhagem Vero, consideradas não tumorais, foram utilizadas devido as suas características de crescimento e comportamento, sendo recomendadas para estudos de citotoxicidade e transformação celular. Portanto, este trabalho teve como objetivo analisar as ações do tamoxifeno in vitro, em cultura de células Vero, com maior enfoque na transformação celular. As células Vero foram expostas a diversas concentrações de tamoxifeno e este exerceu ações citotóxica e transformante, de forma dose dependente. Em resposta imediata ao tratamento com 5?M de TAM por 24 horas as células Vero apresentaram um aumento da proliferação celular enquanto um efeito citotóxico foi evidenciado em concentrações mais elevadas. O tratamento com 30?M / 24 horas demonstrou ser a menor dose transformante e a linhagem celular originada por esse tratamento, denominada Vero T30, foi estabelecida para os estudos subseqüentes. Essa concentração de tamoxifeno pode causar morte em células Vero por apoptose, sendo que células remanescentes apresentaram, diferentemente do controle, crescimento em múltiplas camadas, comportamento esse relacionado à transformação celular in vitro. O padrão de distribuição de fibronectina das células normais e transformadas é aparentemente semelhante, porém as diferenças nas taxas de apoptose, aliadas à perda de inibição de crescimento por contato podem indicar que realmente trata-se de duas populações celulares distintas. Portanto, o tamoxifeno por um processo relacionado à sua toxicidade pode causar transformação morfológica em células Vero in vitro, fenômeno este que pode estar relacionado ao desenvolvimento neoplásico in vivo / Abstract: Tamoxifen is a non-steroidal antiestrogen agent used as an adjuvant in the treatment of breast cancer and also in the preventive treatment of women with high potential risk to develop this disease. This medicament, despite its proved breast antineoplasic action, is associated to the increase of endometrial cancer, among others side effects. Therefore, there is the need of a wide investigation on the actions of the tamoxifen in the properties of different cellular types for a better comprehension of those actions. Vero cells line, which is non-tumoral, was used due to their growth and behavior pattern, being recommended for studies of cytotoxicity and cellular transformation. Hence, this work aimed to analyze the in vitro actions of the tamoxifen on Vero cells in culture, focusing cellular transformation. Vero cells were exposed at several tamoxifen concentrations, which has had cytotoxic and transformer actions, in a dose dependent manner. In immediate response to the treatment with 5?M tamoxifen / 24 hours Vero cells presented an increase in cellular proliferation whereas was observed a cytotoxic effect in more elevated concentrations. Treatment with 30?M tamoxifen/ 24 hours demonstrated to be the lower transformer dose and the cell line originated through this treatment, named Vero T30, was established for subsequent studies. This latter tamoxifen concentration can cause death by apoptosis in Vero cells but the remaining cells presented, differently from control, multi-layered growth; which is a behavior related to in vitro cellular transformation. The pattern of fibronectin distribution on normal and transformed cells was similar but the differences in the apoptosis rates, associated to the lost of contact inhibition can really indicate that there are two different cellular populations. Therefore, tamoxifen can cause in vitro morphological transformation, a phenomenon that can be related to in vivo neoplasic development by a process related to its toxicity / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural
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Estudo citoquimico, imunocitoquimico e de analise de imagem de celulas fibroblasticas em proliferação e apoptose na ausencia e presença de colageno tipo I hiperpolimerizado

Maria-Engler, Silvya Stuchi 15 October 1998 (has links)
Orientador: Benedicto de Campos Vidal / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T06:41:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria_SilvyaStuchi_D.pdf: 6365323 bytes, checksum: 6d4c28f92f74ac737d03b7a3634c42cf (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: o presente trabalho é composto de dois estudos, o primeiro que trata a respeito da análise da morte celular por apoptose em células fibroblásticasem culturas confluentes e o segundo, sobre a influênciado substrato à base de colágeno tipo I hiperpolimerizado no crescimento e apoptose de células fibroblásticascultivadas por longo período. As células BHK21 em apoptose, submetidas à reação de Feulgen e a seguir à análise de imagem, demonstraram menor conteúdo de DNA, representado pela diminuição dos valores de IOD (densidade óptica integrada). Após a reação de ConcanavalinaA (Com A), os núcleos apoptóticos exibiram uma maior positividade de reação que os núcleos normais, o que demonstra a presença de glicoproteínas, possivelmente da matriz nuclear, rearranjadas e complexadas ao DNA do núcleo apoptótico. O arranjo ordenado da complexação de glicoproteínas ao DNA foi confirmado através de coloração com ATCEC (azul de toluidina-concentração crítica de eletrólitos), a qual diferencia DNA de RNA, seguida por observação em microscopia de polarização. Células fibroblásticasV79, submetidas à reação de Feulgen e estudadas por análise de imagem, mostraram em culturas confluentes três fenótipos diferentes classificados como normal, suspeito de apoptose e apoptótico. Tal classificação foi feita aliando análise morfológica e avaliação de parâmetros como conteúdo de DNA (IOD), condensação cromatínica em termos de densidade óptica e medidas de área nuclear. Nossos resultados revelaram que a condensação cromatínica aumentou quando comparados os três fenótipos entre si. Foi observado decréscimo nos valores Feulgen-DNA em células apoptóticas e em células suspeitas de apoptose, revelando-se perda de DNA. Em conclusão, destacou-se a importância do método utilizado para caracterizar fases iniciaisdo processo apoptótico e a possibilidade de diagnóstico inequívoco de apoptose, ao utilizar esta metodologia, desde que associada a outras, quer citoquímicas, imunocitoquímicasou bioquímicas. No último estudo, células fibroblásticas V79 foram cultivadas em substrato de colágeno tipo I hiperpolimerizado. Este substrato apresenta características especiais de auto-agregação e é uma estrutura ordenada que mimetiza a estrutura apresentada pelos tendões in vivo. O cultivo celular de longa duração sobre este substrato foi caracterizado por análise de proliferação, diferenciação e morte celular por apoptose, comparado ao crescimento das células sobre lamínulas. A reação de Feulgen, associada à análise de imagem demonstrou que as células apresentaram um aumento no conteúdo de DNA e da condensação cromatínica quando crescidas em substrato colagênico. A proliferação das células V79 sobre colágeno foi menor, refletindo uma fase de latência neste substrato e após o método de TUNEL, específico para detecção de apoptose, observou-se que a morte celular ocorria, porém em tempos de cultivo superiores aqueles observados para células que cresceram sobre lamínula. Demonstrou-se que o substrato colagênico altera o desenvolvimento proliferativo e metabólico dos fibroblastos, características que sugerem a diferenciação celular, e também atrasa, mas não previne o processo apoptótico / Abstract: matrix which were disorganized and complexed to the DNA of apoptotic nuclei. The ordered arrangement of glycoproteins on the DNA was confirmed by TB-CEC (Toluidine blue-critical electrolyte concentration) which diferentiatesDNA ftom RNA after polarization mycroscopy analyses. V79 fibroblast cells submitted to the Feulgen reaction and image analysis of confluent cultures showed three different nuclear phenotypes classified as normal, suspected of apoptosis and apoptotic. This classification were done using morphological analysis and consideration of parameters such as DNA content (IOD), chromatin condensation in terms of optical density (OD) and nuclear area. The results showed that chromatin condensation increased when the three phenotypes were compared. A decrease of Feulgen-DNA values was observed in apoptotic cells and in cells suspected of apoptosis, revealing loss of DNA. In conclusion, this pointed out the importance of this method to characterized early phases of an apoptotic process and the possibility of inequivocal apoptosis diagnosis using this methodology when associated with others, such as cytochemical, immunocytochemical or biochemicalmethods. In the other aprroach, V79 fibroblastic cells were cultured on hyperpolymerized collagen type I substrates. The substrate showed special characteristics of self-assemleyand is an ordered structure that mimics the in vivo tendon. The long-term cell culture on this substrate was characterized by proliferation, differentiation and cell death by apoptosis analysis when compared to cell growth on coverslips. The Feulgen reaction allied to image analysis demonstrated that there is an increase in DNA content and in chromatin condensation when the cells are grow on the collagen substrate. The proliferation of V79 cells on collagen was less than observed for cells grown on a coverslips, which reflects the latency of this substrate. After the apoptosis specific TUNEL method, cell death was found to occur after longer culture periods than for cells grown on coverslips. The collagen substrate alters fibroblast proliferation and morphological aspects, characteristics that suggest cellular differentiation and the delay of apoptosis but not prevent the prevention of the apoptotic processo / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências Biológicas
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Morte celular em eritrocitos nucleados

Grazziotin, Neiva Aparecida 17 May 1999 (has links)
Orientador: Maria Luiza Silveira Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T15:22:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grazziotin_NeivaAparecida_M.pdf: 2050916 bytes, checksum: 1f07c979d1e88da18d14b11bc6162c9a (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Esta investigação teve por objetivo detectar e caracterizar a freqüência de fenômenos de morte celular programada (MCP) em eritrócitos nucleados, tendo por justificativa o fato de que a concentração crítica de eletrólitos (CEC) na cromatina de eritrócitos de frango é variada, sugerindo alterações nos complexos DNAproteína de parte da população celular. Eritrócitos de ftango, pombo e rã foram analisados por citoquímica e pelo método imunocitoquímico de TUNEL para avaliação de MCP. Os resultados indicaram que a maioria da população celular se encontrava em alguma fase ativa do processo de MCP, evidenciado especialmente pela variada intensidade de resposta nuclear ao método de TUNEL e que é sugestiva de alterações químicas e de estereoarranjamento nos complexos DNA-proteína desses núcleos. A alta freqüência de MCP revelada pelo método de TUNEL estaria de acordo com os dados reportados de CEC na cromatina de eritrócitos de frango. A resposta mais intensa ao método de TUNEL nos eritrócitos de rã em relação às aves pode estar associada ao tempo de vida mais curto dos primeiros e a variantes em histona H5, que fariam com que o acesso do DNA à fragmentação por endonucleases e, conseqüentemente, ao método imunocitoquímico fossem diferentes / Abstract: The objective of this investigation is to detect and characterize the frequency of programmed cell death (PCD) phenomena in nucleated erythrocytes, having as justification the fact that the critical electrolyte concentration (CEC) in chicken erythrocytes chromatin is varied, suggesting alterations in the DNA-protein complexes in part of the cellular population. Chicken, pigeon and frog erythrocytes have been analyzed by cytochemistry and immunocytochemical TUNEL assay for PCD avaluation. The results have shown that the majority of cellular population was in some active phase of PCD process, evidenced especially by the varied intensity of nuclear response to the TUNEL assay and which suggests chemical and stereoarrangement alterations in the DNA-protein complexes of these nuclei. The high frequency of PCD revealed by the TUNEL assay would be in agreement with the reported CEC data in chicken erythrocyte chromatin. The most intense response to the TUNEL assay in frog erythrocytes regarding fowls can be associated with a shorter life span of the former and the histone H5 variants which would cause the DNA access to fragmentation by endonucleases and, consequently, to the immunocytochemical assay, to be different / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas
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Os hemocitos larvais de Anticarsia Gemmatalis (Hubner) (Lepidoptera: Noctuidae) e sua interação com baculovirus

Silveira, Eni Braga da 02 November 2005 (has links)
Orientadores: Sonia Nair Bao, Bergamann Morais Ribeiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:39:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_EniBragada_D.pdf: 8190576 bytes, checksum: 40d63d1dc3a53a42d25cdd9abd266af0 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A família Baculoviridae é constituída por vírus de fita-dupla de DNA que infectam artrópodes, larvas de lepidópteros em sua maioria. No início da década de 90, descobriu-se que baculovírus possuem genes (p35 e iap) capazes de inibir a apoptose em células hospedeiras, uma estratégia para garantir a replicação viral. O mutante vApAg, derivado de Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) e que possui um transposon interposto no gene iap3, induz apoptose em uma linhagem celular derivada de Anticarsia gemmatalis, havendo produção de progênie viral. Já o vírus vP35del, derivado de Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e que possui o gene p35 deletado, também induz apoptose na mesma linhagem celular, porém sem sinais de produção de progênie. Neste trabalho, investigou-se a ocorrência de apoptose in vivo induzida por vApAg e pelo recombinante p35- derivado de AcMNPV ¿ vHSGFP/P35del em larvas de A. gemmatalis. Utilizou-se como modelo de estudo hemócitos infectados via injeção intrahemocélica de vírus extracelulares. Os hemócitos de A. gemmatalis foram caracterizados e o processo infeccioso de AgMNPV, vApAg, vHSGFP e vHSGFP/P35del nestas células foi estudado com base em técnicas morfológicas, tendo sido, ainda, observadas a mortalidade e alterações no desenvolvimento larval induzidas pelos vírus. Foram observados seis tipos de hemócitos: prohemócitos (pr), plasmatócitos (pl), granulócitos tipo 1 (gh1), granulócitos tipo 2 (gh2), oenocitóides (oe) e esferulócitos (sph), os quais apresentam semelhança geral com o conjunto de hemócitos de outros lepidópteros, inclusive com relação ao seu número total (CTH), às proporções dos diferentes tipos ao longo do desenvolvimento (CDH) e à atividade de fenoloxidase. A inativação do gene iap-3 de AgMNPV resulta em apoptose para um número considerável de hemócitos em até 72 horas pós-infecção, com a produção de vírus extracelulares e ocluídos. O tempo médio de morte para larvas infectadas com 100 e 1000 PFU de vApAg é cerca de 2,5 dias maior que para as mesmas doses de AgMNPV. A deleção do gene p35 de AcMNPV resulta em uma apoptose de hemócitos discreta, entre 24 e 72 horas pós-infecção, com alguma produção de vírus extracelulares, havendo redução na proporção de hemócitos infectados ao longo do tempo e redução na infectividade das larvas. Para vHSGFP, uma dose da ordem de 105 vezes maior que de AgMNPV foi necessária para causar uma mortalide próxima a 100%. Desta forma, A. gemmatalis consiste em um hospedeiro semi-permissivo a AcMNPV. Ao contrário de AgMNPV e vApAg, vHSGFP e vHSGFP/P35del, em geral, não causam liquefação dos insetos. Algumas larvas sobreviventes à infecção por vHSGFP e, principalmente, por vHSGFP/P35del, originam pupas anômalas inviáveis. Todos os tipos de hemócitos de A. gemmatalis são susceptíveis à infecção pelos quatro vírus. Pl e gh1 são mais susceptíveis enquanto gh2 raramente são infectados. Sph são especialmente tolerantes aos vírus derivados de AcMNPV, podendo constituir um dos fatores determinantes da baixa infectividade destes vírus em A. gemmatalis. Gh1 e pl fagocitam células, fragmentos celulares, corpos apoptóticos, vírus extracelulares e ocluídos. Hemócitos infectados parecem ser alvos de uma resposta citotóxica causadora de necrose. Os resultados deste trabalho reforçam a hipótese de que a apoptose constitui uma estratégia anti-viral importante em insetos, tendo em vista que os mesmos não possuem imunidade adquirida. A compreensão de aspectos da relação patógeno-hospedeiro, especialmente no que diz respeito aos mecanismos de imunidade de insetos contra vírus, pode contribuir para a otimização dos baculovírus como agentes de controle biológico de pragas e como vetores de expressão de genes heterólogos, bem como colaborar para a descoberta de novos antivirais e para o controle da transmissão de vírus por insetos / Abstract: The Baculoviridae family is composed by double-strand DNA viruses that infect arthropods, generally lepidoptera larvae. In the beginning of the 90's, it was shown that baculoviruses possess genes (p35 e iap) that inhibit apoptosis in host cells - a strategy to guarantee viral replication. The mutant vApAg, derived from Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), which has the iap-3 gene interrupted by a transposon, induces apoptosis in a cell line derived from Anticarsia gemmatalis, with progeny production. The virus vP35del, derived from Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), which has a deletion in the gene p35, also induces apoptosis in the same cell line, however there is no progeny production. In this work, we have investigated apoptosis in vivo induced by vApAg and by a p35- recombinant derived from AcMNPV - vHSGFP/P35del in A. gemmatalis larvae. Hemocytes were the model chosen for study and the infection occurred by intrahaemocoelic injection of budded viruses. The hemocytes were characterized and the infective processes of AgMNPV, vApAg, vHSGFP and vHSGFP/P35del in these cells were studied based on morphological approaches. It was also observed larval mortality and the effects on larval development caused by these viruses. Six types of hemocytes were observed: prohemocytes (pr), plasmatocytes (pl), granular hemocytes type 1 (gh1), granular hemocytes type 2 (gh2), oenocytoids (oe) and spherulocytes (sph). They presented great similarity to the hemocytes pool from other lepidoptera, including the total number of these cells in circulation (THC), the proportions of each type during larval development (DHC) and phenoloxidase activity. xix The inactivation of the iap-3 gene in AgMNPV resulted in apoptosis induction for a great number of hemocytes until 72 hours post infection, with the production of budded and occluded viruses. The mean time to death was delayed in 2.5 days in average for insects inoculated with 100 and 1000 PFU of vApAg, when compared to the same doses of AgMNPV. The deletion of p35 in AcMNPV resulted in a milder apoptosis, between 24 and 72 hours post infection, with some production of budded viruses. It caused a reduction in the proportion of infected hemocytes along the time of infection and reduced larval infectivity. For vHSGFP, a viral dose in the order of 105 times higher than for AgMNPV is needed to cause a mortality ratio around 100%. Therefore, we consider A. gemmatalis as a semi-permissive host to AcMNPV. The recombinants vHSGFP and vHSGFP/P35del generally do not cause melting of insects, what normally occurs for insects infected by AgMNPV and vApAg. Some surviving larvae infected by vHSGFP and, mainly by vHSGFP/P35del, originate anomalous pupae. All hemocytes types from A. gemmatalis were susceptible to infection by the viruses studied. Pl and gh1 are the most susceptible cells, while gh2 are rarely infected. Sph are especially resistant to AcMNPV-derived viruses. This can constitute one of the factors that determine the low infectivity of AcMNPV in A. gemmatalis larvae. Gh1 and pl phagocytose cells, cell fragments, apoptotic bodies, budded viruses and occluded viruses. Infected hemocytes appear to be targets for a cytotoxic response that causes necrosis. These results reinforce the hypothesis of apoptosis is an important anti-viral strategy in insects, which do not present acquired immunity. A better comprehension of host-pathogen relationships, specially the ones related to insect immunity against viruses, may contribute to an optimization of baculoviruses as biological control agents and heterologous expression vectors, as well as to the iscovery of new antiviral drugs and to the control of virus transmission by insect / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural
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Étude de l'effet de l'expression de la protéine virale Nef du virus de l'immunodéficience humaine sur la lymphopoïèse T

Brizzi, Fanny 27 November 2009 (has links)
La destruction du compartiment T CD4 induite par le VIH‐1 est essentiellement périphérique. Cependant, l’atteinte des précurseurs lymphocytaires T, pour laquelle existent des arguments, est encore mal connue. L’objectif de ce travail a été d’explorer le rôle de la protéine Nef, hors contexte d’infection virale, dans la différenciation lymphoïde. Nef, produite très tôt après l’infection par le VIH‐1, possède un rôle‐clé dans la pathogénie, comme en témoigne la reproduction, chez la souris transgénique pour Nef, d’une maladie proche de la maladie humaine. Dans les lymphocytes matures infectés, Nef module l’expression du récepteur CD4, des molécules du CMH de classe I et induit un état d’activation T. Nef interagit également avec de nombreux partenaires cellulaires impliqués dans des voies de signalisation cytokinique, de contrôle de l’apoptose et de l’ontogénie T. Au cours de ce travail, nous avons montré que l'expression de Nef en absence d'autres gènes viraux bloquait le potentiel T et NK des précurseurs hématopoïétiques humains par un mécanisme apoptotique indépendant des caspases et lié à une perturbation du potentiel mitochondrial. Grâce à l’utilisation du système de culture OP9‐DL1 permettant l’identification des premiers stades de différenciation des cellules T, nous avons montré que la génération de cellules T à partir de CD34+ est affectée à un stade CD3+CD5+CD1a+ qui a initié le réarrangement D‐J du TCRβ. Les stades suivant du développement T sont aussi affectés, en effet, une réduction quantitative du nombre de CD4 ISP et de DP CD4+CD8+ TCRαβ a été observée. Nef diminue aussi la génération de cellules NK CD56+ alors que la production de cellules B n’est pas affectée. Des analyses par dilution limite montrent une réduction significative de la fréquence des précurseurs T/NK parmi les cellules CD34+ exprimant Nef. Nous avons par ailleurs montré une augmentation de 15 à 25% de cellules apoptotiques dans les cellules exprimant Nef‐WT par rapport aux autres conditions. Cette apoptose n’est pas caspase dépendante et La voie Fas/Fas‐L ne semble pas entrer non plus en jeu. Nous avons par ailleurs pu déterminer que l’atteinte apoptotique des précurseurs passait par une déstabilisation mitochondriale, ceci grâce à un marquage DIOC6. L’ensemble des résultats regroupés dans de ce travail permet d’approfondir les connaissances des mécanismes d’interférence du VIH avec l’hématopoïèse et plus précisément des actions de Nef sur l’hématopoïèse humaine. / HIV-1 infection is characterized by a progressive loss of CD4 T cell leading to a severe immune deficiency. More than 20 years after the identification of HIV, the exact mechanisms by which HIV leads to the depletion of CD4 T cells are not completely understood and remain a matter of cntroversy. The purpose of this work has been to explore out of the viral context, the effect of the HIV-1 Nef protein on the T cell differentiation. The HIV-1Nef gene is essential for AIDS pathogenesis. HIV-1Nef protein is a 27‐kDa protein that is expressed early during cell infection. Nef increases viral replication in vivo and enhances viral infectivity. Nef interferes with the expression of crucial molecules at the surface of lymphocytes such as CD4, MHC class I and II, CD28, DC‐SIGN, and chemokine receptors. Nef also alters T-cell signaling pathways and immunological synapse formation. During this work, we found that Nef expression in hematopoietic precursors interfere by an apoptotic pathway in the differentiation of a T/NK progenitor. In order to study the differenciation, we used a recent model of murine stromal cells engineered to express the Notch ligand delta 1 (OP9‐DL1 system). This system allows the differentiation of hematopoietic progenitors to a DP CD4+CD8+ stage and led us to examine the effects of Nef expression on T‐cell development. For this, Nef was expressed in hematopoietic CD34+ precursors using lentiviral vectors. In this study, we demonstrate that HIV-1Nef expression in the absence of other viral genes hampers the T and NK cell potential of human hematopoietic progenitors. We show that the generation of T cells from CD34+ progenitors is affected at a CD3ε+CD5+CD1a+ precursor stage that has initiated a DJB rearrangement of the TCRB locus. Subsequent stages of T cell development were also affected with a quantitative reduction of CD4 ISP and DP CD4+CD8+ TCRαβ cells. Nef also decreased the generation of CD56+NK cells whereas B cell production was not affected. Limiting dilution analyses demonstrated a significant reduction in the frequency of T/NK progenitors among Nef‐expressing CD34+ cells. Collectively, these data indicate that Nef interferes with the differentiation of a primitive lymphoid precursor with a T/NK potential. This interference was caused by the triggering of an apoptotic pathway which triggered the mitochondrial depolarization. This study allows a better knowledge of the interference mechanisms used by HIV on the T cell hematopoïesis, more accurately on the effect of Nef on human T cell differentiation
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Synthesis and antitumor activity of aryl glycosides (glycomers)

Zhan, Lijie January 2001 (has links)
Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.
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"Modulação térmica da lesão isquêmica: estudo in vitro" / Temperature modulation of the ischemic neuronal loss in vitro

Ariga, Suely Kunimi Kubo 25 May 2005 (has links)
A isquemia cerebral causada pela parada cardíaca leva ao desapareciemnto neuronal. studamos os mecanismos de morte celular envolvidos na isquemia in vitro em linhagem de neuroblastoma.O insulto isquêmicao foi reproduzido cultivando as células sem fatores de crescimento, sem glicose e em embiente hipóxico produzido por um sistema de anaerobiose. Os resultados sugerem que a privação de oxigênio, glicose e fatores de cresciemtno do meio de cultura reproduzem o fenômeno semelhante a isquemia. INvestigamos ainda a participação de processo apoptótico e sua modulação térmica. Observams que a hipotermia produz neuroproteção, enquanto a hipertermia agrava o processo de morte celular por apoptose. / Cardiac arrest causes cerebral ischemia and neuronal disappearance. We investigate celular death mechanisms elucidated by a model of ischemia in neuroblastoma cell line. The ischemic insult was reproduced by deprivation of growth factors and glucose in a hypoxic environment produced by an anaerobiosis system. Our results validate the experimental model and revel the participation of an apoptotic process in the celular loss induced by ischemia. We also demonstrated that hypothermia can be used as a neuroprotector agent whereas hyperthermia aggavates celular damage.
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Effekte von Adipozytokinen auf INS-1E Beta-Zellen

Spinnler, Robert 23 October 2014 (has links) (PDF)
ABSTRACT Aims/hypothesis: Obesity is associated with a dysregulation of beta-cell and adipocyte function. The molecular interactions between adipose tissue and beta-cells are not yet fully elucidated. We investigated, whether or not the adipocytokine nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt), which has been associated with obesity and type 2 diabetes mellitus (T2DM) directly influences beta-cell survival and function. Methods: The effect of Nampt on viability of INS-1E cells was assessed by WST-1 assay. Apoptosis was measured by Annexin V/PI and TUNEL assay. Activation of apoptosis signaling pathways was evaluated. Adenylate kinase release was determined to assess cytotoxicity. Chronic and acute effects of the adipocytokine Nampt and its enzymatic product nicotinamide mononucleotide (NMN) on insulin secretion were assessed by glucose stimulated insulin secretion in human islets. Results: While stimulation of beta-cells with the cytokines IL-1β, TNFα and IFN-γ or palmitate significantly decreased viability, Nampt showed no direct effect on viability in INS-1E cells or in human islets, neither alone nor in the presence of pro-diabetic conditions (elevated glucose concentrations and palmitate or cytokines). At chronic conditions over 3 days of culture, Nampt and its product NMN had no effects on insulin secretion. In contrast, both Nampt and NMN potentiated glucose stimulated insulin secretion acutely during 1h incubation of human islets. Conclusion/interpretation: Nampt did influence neither beta-cell viability nor apoptosis but acutely potentiated glucose stimulated insulin secretion.

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