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Efeito do condicionamento com nicotina e cotinina na morfologia, densidade e viabilidade de fibroblastos. Estudo in vitro

Traverso Martínez, Aurora Esmeralda [UNESP] 20 February 2002 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2002-02-20Bitstream added on 2014-06-13T19:57:19Z : No. of bitstreams: 1 traversomartinez_ae_me_arafo.pdf: 1364919 bytes, checksum: 540ee729754fa3c858f9af1879a4860d (MD5) / O objetivo do estudo foi avaliar in vivo o efeito do condicionamento com nicotina ou cotinina sobre a morfologia, densidade e viabilidade de fibroblastos. Na avaliação da morfologia e densidade, também foi determinado se a raspagem mecânica das superfícies condicionadas modifica estes resultados. Foram formados dois grupos experimentais : Apenas condicionamento e Raspagem após condicionamento. No grupo Apenas condicionamento, as amostras foram incluídas em placas para cultivo celular e subdivididas em 3 subgrupos segundo a substância testada: Nicotina, Cotinina e Controle negativo. No primeiro subgrupo cada orifício recebeu 2ml de solução de Nicotina (concentrações de 100ng, 1ug, 100 ug, 1mg/ml). No segundo subgrupo cada orifício recebeu 2 ml de solução de Cotinina (concentrações de 50ng, 100ng, 500ng, 1ug/ml). O terceiro subgrupo foi o controle. Após 24 horas de condicionamento as amostras foram lavadas com tampão fosfato e adicionado a 1ml de meio de cultura + 1 ml de meio de cultura contendo 1x10 células/ml. Para o grupo Raspagem após condicionamento, foram empregadas as mesmas concentrações de nicotina e cotinina descritas. O condicionamento foi realizado da mesma forma seguido de raspagem manual. As amostras obtidas foram fixadas, desidratadas, metalizadas e levadas ao microscópio eletrônico de varredura para exame e fotografias. Para a avaliação da viabilidade foram formados dois grupos experimentais, segundo a dose de nicotina: 0-controle, 10ug, 100ug, 0.5mg, 1mg; e segundo o tempo de condicionamento : 1 e 24 hora. Para a cotinina os valores de concentração e tempo de condicionamento foram: 0-controle, 50ng, 100ng, 500ng, 1ug/ml; e 1, 24 e 48 horas respectivamente. Cada um dos orifícios de uma placa para cultura celular recebeu 1 mL de meio de Eagle, 1 ml de Eagle contendo a nicotina ou cotinina nas diferentes... . / The aim of this study was to evaluate in vitro the effect of nicotine or cotinine, on the morphology, density and viability of fibroblasts. In was also assessed if performing root planing on conditioned root surface would alter the results. Exposure to nicotine or cotinine and Root planning after the exposure to nicotine or cotinine. In the first group, the specimens were set in plates for cellular cultures and divided in three subgroups according to the substance tested: nicotine, cotinine, and control (negative). In the firs subgroup each well received 2ml of nicotine solution (100mg, 1ug, 100ug, 1mg/ml). In the second subgroup each well received 2ml of solution of cotinine (50ng, 100ng, 500ng, 1ug/ml). The third group was control. After 24 hours, the specimens were washed with phosphate buffer and 1ml of a cell suspension containing 1x15 cells/ml was added to each well. For the group of root planning after the exposure there were used the same concentrations of nicotine and cotinine of the first group. The exposure was made with the same procedure of root planning. The specimens obtained were fixed, dehidratated, sputter coated with gold, photographed and observed to the eletronic microscope. For the viability, two experimental groups were formed according to drug dosage: 0- control, 10 ug, 100 ug, 0.5 mg, 1 mg and to drug exposure time 1 and 24 hours for the nicotine group. For the cotinine group, concentration values were: 0- control, 50 ng, 100 ng, 500 ng, and 1 ug/ml, the exposure times were 1, 24 and 48 hours. Twelve well microplates were used. Each well received 1 ml of culture medium containing nicotine or cotinine in different concentrations. One milliliter of culture medium containing 1 x 10 cells/ml was also added to each well. After the drug exposure period, the cells were colored with trypan blue 0.4%. Stained non... (Complete abstract, click electronic address below).
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Matrizes nanoestruturadas bioativas para aplicação na regeneração de nervos periféricos

De Prá, Manuel Adalberto Alfaro January 2017 (has links)
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-11-14T03:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348743.pdf: 4711943 bytes, checksum: 2e1d0c81e25c50e4748910ac8f45346a (MD5) Previous issue date: 2017 / A eletrofiação é uma promissora técnica à geração de sistemas de liberação de fármacos e engenharia de tecidos. Este trabalho descreve o desenvolvimento de matrizes nanoestruturadas permissivas à diferenciação de células neuronais. Inicialmente, o efeito dos parâmetros processuais da eletrofiação e da configuração do coletor na arquitetura das fibras foi estudado. O processo foi otimizado para obtenção de nanofibras randomizadas e alinhadas. Nanofibras de policaprolactona (PCL) foram produzidas usando três configurações de coletor: um cilindro metálico rotatório, fios de cobre e um mandril rotatório. O coletor cilíndrico gerou uma nanomatriz com estrutura típica tridimensional, na qual a velocidade de rotação mecanicamente promoveu a redução do diâmetro e alinhamento das fibras. Um padrão de fibras randomizadas com um diâmetro médio de 1142 ± 391 nm foi observado a 0 rpm, enquanto nanofibras alinhadas com um diâmetro médio de 663 ± 334 nm foram produzidas a 2000 rpm. Os cabos de cobre originaram um novo padrão de matriz, cujo grau de orientação das fibras relacionou-se à distribuição do campo elétrico no coletor. Por sua vez, o coletor de mandril deu origem a uma matriz tubular constituída de fibras com diâmetro médio de 606 ± 329 nm. Em seguida, avaliou-se a influência do efeito do polietilenoglicol (PEG) em nanofibras compostas por blendas de PEG e PCL. Três tipos de PEG consoante à massa molecular (400, 1500, e 35000 Da) e três concentrações (1, 5, e 10% em relação à PCL) foram estudados. As matrizes foram caracterizadas quanto a sua arquitetura por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e propriedades mecânicas por teste de tração uniaxial, utilizando um analisador de textura. Em presença de PEG houve uma redução do diâmetro e da resistência mecânica das fibras. Estudos de cultura celular demonstraram a ausência de citotoxicidade destes biomateriais. A adequação do uso do PEG para prolongar a liberação de NGF foi demonstrada. A bioatividade do NFG incorporado nas matrizes foi avaliada através da diferenciação de células PC12. As matrizes constituídas de nanofibras alinhadas promoveram o alinhamento de neuritos e a presença de PEG influenciou positivamente o perfil de liberação do NGF e a degradabilidade das matrizes. Por fim, foi produzido um sistema de liberação prolongado de NGF constituído por uma matriz tubular de nanofibras randomizadas na camada externa e alinhadas no lúmen. Os resultados obtidos indicam que as matrizes desenvolvidas, constituídas de nanofibras de PCL e PEG, apresentam potencial de aplicação como sistema de liberação de NGF e no estudo da regeneração nervosa periférica. / Abstract : Electrospinning is a promising technique to generate scaffolds for delivery systems and nerve tissue engineering. This study describes the development of a nanostructured matrix permissive to neural cell differentiation. Firstly, the effect of setting up parameters and collector design on the alignment and architecture of electrospinning fibers was studied. The process was optimized to obtain randomized and aligned nanofibers. Polycaprolactone (PCL) fibers were produced using three collectors: metallic rotating drum, copper wires, and a rotating mandrel. The drum collector produced a typical tridimensional structure whereby the rotational speed mechanically stretches fibers and affects their diameter and alignment. Randomly oriented fibers with an average diameter of 1142 ± 391 nm were obtained at 0 rpm, while aligned fibers with an average diameter of 663 ± 334 nm were produced at 2000 rpm. Static copper wires produced a novel fiber pattern in which the degree of orientation of the fibers was related to the electrical field distribution along the collector. Mandrel collector produced a tubular mat composed by nanofibers with an average diameter of 606 ± 329 nm. In a second series of experiments, the influence of polyethyleneglycol (PEG) on nanofibers composed of PCL and PEG blends was evaluated. Three types of PEG with t molecular weights (400, 1500, and 35000 Da) and concentrations (1, 5, and 10% ratio to PCL) were studied. Mats were characterized in terms of architecture by Scanning Electron Microscopy (SEM) and mechanical properties by uniaxial tensile tests using a texture analyser. The presence of PEG decreased the diameter and mechanical resistance of fibers. Cell culture studies have demonstrated the absence of cytotoxicity of these biomaterials. The suitability of using polyethylene glycol (PEG) to prolong the delivery of NGF incorporated into PCL electrospinning nanofibers was demonstrated. The effect of released nerve growth factor (NGF) from the mats was evaluated by neuronal differentiation using PC12 cells. Electrospun scaffolds composed by aligned nanofibers promoted alignment and neurite outgrowth of PC12 cells along the axis of the aligned nanofibers. PEG influenced positively the release profile of NGF and mats degradability. Finally, a sustained NGF deliver system composed by a tubular matrix of randomized nanofiber in the outer layer and aligned nanofibers in the lumen was produced. Therefore, the results obtained indicate that the developed matrix, composed by PCL and PEG nanofibers, present potential application as a NGF delivery system and in the study of the peripheral nervous regeneration.
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Análise da expressão e atividade da Metaloprotease - 9 em Fibroblastos do tipo selvagem e nocaute para a Proteína Príon Celular.

Pereira, Sofia Isabel Ribeiro 28 June 2011 (has links)
No description available.
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Estudo da função de CD90 na proliferação e diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas

Moraes, Daniela Abreu de 08 September 2016 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-11-21T17:09:44Z No. of bitstreams: 1 2016_DanielaAbreudeMoraes.pdf: 10204740 bytes, checksum: ed1d4a82672c2fbd2b778a4152cd90cc (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-30T20:35:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DanielaAbreudeMoraes.pdf: 10204740 bytes, checksum: ed1d4a82672c2fbd2b778a4152cd90cc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-30T20:35:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DanielaAbreudeMoraes.pdf: 10204740 bytes, checksum: ed1d4a82672c2fbd2b778a4152cd90cc (MD5) / Introdução: Células-tronco mesenquimais (MSCs) são células progenitoras multipotentes potencial fonte para várias terapias celulares. MSCs são caracterizadas pela expressão dos marcadores celulares CD73, CD90 e CD105, e ausência de expressão dos marcadores CD34, CD45, CD11a, CD19 e HLA-DR. CD90 é uma glicoproteína presente na membrana de MSC, várias células adultas e células-tronco de câncer. A função de CD90 em MSC ainda é pouco elucidada. Objetivo: Obter MSCs com expressão reduzida de CD90 para investigar a função desse marcador na morfologia, proliferação e diferenciação de MSCs humanas. Metodologia: Foi avaliada a função de CD90 na morfologia, proliferação, supressão da proliferação de células T e diferenciação osteogênica e adipogênica de MSCs por meio da redução da expressão desse marcador, usando vetores lentivirais que expressam shRNA contra CD90. Resultados: O estudo mostrou que a redução da expressão de CD90 resultou em maior eficiência das diferenciações osteogênica e adipogênica de MSCs in vitro e, inesperadamente, resultou também no decréscimo da expressão dos marcadores CD44 e CD166. Conclusão: O estudo sugere que CD90 controla a diferenciação de MSCs e possa agir como um obstáculo a ser superado para que haja diferenciação e a manipulação de CD90, na presença de um correto estímulo para a diferenciação pode levar a taxas de diferenciação in vitro de MSCs mais eficientes. / Introduction: Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are multipotent progenitor cells used in several cellular therapies. MSCs are characterized by the expression of CD73, CD90 and CD105 cell markers, and the absence of CD34, CD45, CD11a, CD19 and HLA-DR cell markers. CD90 is a glycoprotein present in the MSC membranes, various adult cells and cancer stem cells. The role of CD90 in MSCs remains unknown. Here, we sought to analyse the role of CD90 plays in the characteristic properties of in vitro-expanded human MSCs. Methodology: We investigated the function of CD90 in: the morphology; proliferation rate; suppression of T cell proliferation; and osteogenic/adipogenic differentiation of MSCs by reducing the expression of this marker using CD90 target shRNAs lentiviral vectors. Results: The present study shows that a reduction in CD90 expression enhances the osteogenic and adipogenic differentiation of MSCs in vitro and, unexpectedly, causes a reduction the expression of CD44 and CD166. Conclusion: Our study suggests that CD90 controls the differentiation of MSCs by acting as an obstacle in the pathway of differentiation commitment which may be overcome, in the presence of the correct differentiation stimuli, supporting the idea that CD90 level manipulation may lead to more efficient differentiation rates in vitro.
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Efeitos da erupção alterada, por desimpedimento e pela vimblastina, nos fibroblastos de regiões e compartimentos do ligamento periodontal de incisivos de ratos, estudo morfometrico ultraestrutural

Novaes, Pedro Duarte, 1960- 19 August 1996 (has links)
Orientador: Jose Merzel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-21T11:24:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Novaes_PedroDuarte_D.pdf: 2205146 bytes, checksum: d897b9dd1a4486951091014408089991 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: As densidades volumétricas (Vv) de estruturas da face mesial do ligamento periodontal (LPD) de incisivos inferiores de ratos foram analisadas em dentes em condições de erupção: impedida (CI), que serviu de controle, desimpedida (CD), cuja erupção é acelerada, e sob a ação da vimblastina (VI e VD), que retarda a erupção. Seis ratos machos tiveram seus incisivos inferiores esquerdos seccionados a cada dois dias e mantidos em erupção desimpedida, enquanto que os contralaterais erupcionaram em oc1usão com os superiores. No 72 dia, três animais foram injetados, intraperitonealmente, com uma dose única de vimblastina (2 mg/Kg de peso) e os três restantes receberam volume equivalente de salina. Os animais, foram perfundidos, por via intracardíaca, com solução de Karnovsky e as hemimandíbulas dissecadas e imersas no mesmo fixador por mais 3 horas. As hemimandíbulas, após descalcificação em EDT A, foram divididas em cinco regiões transversais~ a porção entre a crista alveolar do ,incisivo e a face mesial do primeiro molar foi dividida em dois segmentos de igual extensão (RI e R2)~ os três segmentos restantes foram relacionados a cada um dos molares (R3, R4 e R5). O material foi pós-fixado em tetróxido de ósmio e processado para microscopia eletrônica de transmissão e cortes ultrafinos, no sentido transversal, foram obtidos de cada região. Para avaliação morfométrica foram usadas três eletronmicrografias no aumento final de 6. OOOx e três no aumento final de 47.730x, dos compartimentos junto ao dente, junto ao osso alveolar e um intermediário entre os dois, de cada região do LPD. No aumento de 6.000x, utilizando-se um retículo de 100 pontos, foram determinadas as V v de fibroblastos (V vf) e da matriz extracelular (Vvme). No aumento de 47.730 x, utilizando-se um retículo de 400 pontos, as Vv em relação a Vvf de: mitocôndrias, Golgi, lisosomas, retículo endoplasmático granular, microtúbulos, junções celulares e vesículas de colágeno. Nos animais controle com erupção impedida (CI), a Vvf e Vvme não se alteraram ao longo do dente, com exceção do compartimento intermediário, onde, em R2 e R3, Vvf foi maior e a Vvme menor que nas demais regiões. O desimpedimento aumentou a Vvf e diminuiu a Vvme , ificativamente, nos compartimentos intermediário e junto ao osso das regiões 4 e 5 (e.g., no compartimento intermediário da R4, a Vvf de CI foi de 0,322 e de CD, 0,532; a Vvme de CI foi 0,678 e de CD, 0,468). A vimblastina provocou algumas diferenças opostas entre dentes impedidos e desimpedidos em relação aos controles. Onde, por exemplo, a Vv aumentou nos primeiros, diminuiu nos últimos (e.g., no compartimento junto ao dente da RI, a Vvme em CI foi 0,623 e em VI, 0,718, enquanto que, em CD foi 0,746 e em VD, 0,440). Entre as estruturas citoplasmáticas, a alteração mais marcante foi a relacionada aos microtúbulos, cuja Vv aumentou nos dentes desimpedidos, principalmente, nos compartimentos junto ao dente e junto ao osso da R 1 e R2 e diminuiu, de modo generalizado, nos dois grupos (impedidos e desimpedidos) tratados com vimblastina (e.g., no compartimento junto ao dente da RI, a Vvmt de CI foi 0,0014 e em CD, 0,0073; e em VI foi 0,00 e em VD, 0,0018. Estes resultados parecem indicar que o ligamento periodontal do incisivo de rato não se comporta por igual em relação a fatores que alteram o processo de erupção, tanto nos compartimentos como nas regiões em que foi dividido / Abstract: The volume density (Vv) of structures at the mesial face of the rat lower incisor periodontal ligament (PDL) were determined in control and vimblastine treated, impeded (CI and VI) and unimpeded teeth (CD and VD). Six adult male rats had their left lower incisors shortened at every other day to erupt in an unimpeded condition, while the right ones erupted impeded. On the ih day, three animais were injected, intraperitoneally, with a single dose of vinblastine (2mg/K of b.w.) while the other three received an injection of an equivalent volume of saline. Under ether anesthesia, the animaIs were perfused, through the left ventricle, with Karnovsky's solution; the hemimandibles were dissected out, and left in the same solution for 3 more hours. After decalcification with EDT A, each hemimandible was divided in five transversal regions: between th~ alveolar crest and the mesial face of the 1st M, it was divided in two halves - RI and R2; the three folloWing Iregions, R3, R4 and Rs were related to each of the lower molar teeth. The pieces were pos-fixed with osmium tetroxide, processed for electron microscopy and transversal ultrathin sections were made from each region. For morphometric analysis, three electronmicroghaphs, at fmal magnification of 6.000x and three at 47.300x, were taken from the toothrelated compartment, alveolar bone-related compartment and from a midle one, between the former two, of each PDL region. At 6. OOOx, using a test system oí 100 points, the Vv oí fibroblasts (V vr) and extracellular matrix (Vvme) were determined. At 47.7 30x, using a test system of a 400 points, the Vv related to V vf oí mitochondria, Golgi, lysosomes, rough ER, microtubules, intercelIular junctions and intracelIular colIagen vesic1es, were determined. In control impeded teeth (CI), Vvf and Vvme were similar in alI regions, except in the midle compartment, where in R2 and R3, Vvf was higher and Vvme lower than the other regions. In unimped teeth, Vvf increased and Vvme decreased in the midle and alveolar bone-related parts of R4 and R5 (e.g. in midle compartment of R4, Vvf of CI was 0.322 and of CD, 0.532; Vvme of CI was 0.678 and of CD, 0.468). Vinblastine induced some opposite effects between impeded and unimped teeth: where for instance the Vv increased in the fonner, decreased in the latler or vice-versa (e.g. in the tooth-re1ated compartment of R1, Vvme. of CI was 0.632 and of VI, 0.718, while of CD was 0.746 and ofVD, 0.440). Among fibroblast cytoplasmic structures the most evident effect was related to microtubules. Their V vmt showed a significant increase in unimpeded teeth, mainly in the tooth-related and alveolar bone~related compartments and a general decrease i~ both vinblastine-treated groups (e.g. in tooth-related compartment ofRI, Vvmt ofCI was 0.0014 and ofCD 0.Oq73; ofVI was 0.00 and ofVD 0.0018). These results seem to indicate that different regions and compartments of PDL did not show a similar behaviour in relation to factors that alter the eruption processo / Doutorado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Doutor em Ciências
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Estudo morfometrico dos compartimentos de varias regiões do ligamento periodontal de incisivos de ratos em condições de erupção alterada pelo desimpedimento e pela vimblastina

Silva, Miralva Aparecida de Jesus 05 June 1997 (has links)
Orientador: Jose Merzel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontrologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-22T12:47:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_MiralvaAparecidadeJesus_M.pdf: 2136112 bytes, checksum: 6a32a2df1f02f1f2704d8c0bdaaef9a1 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: As densidades volumétricas de compartimentos de várias regiões da face mesial do ligamento periodontal de incisivos inferiores de ratos foram analisadas nas condições de erupção impedida, desimpedida e sob ação da vimblastina. Nos vários compartimentos de cada região foi determinada também a densidade volumétrica de fibroblastos e matriz extracelular. Nove ratos Wistar machos tiveram seus incisivos inferiores esquerdos seccionados a cada dois dias e mantidos em erupção desimpedida, enquanto os contralaterais permaneceram em oclusão. No sétimo dia, a partir do início do corte dos incisivos, 6 animais receberam, por via intraperitoneal, uma dose única de vimblastina (2 mg/kg de peso corporal) e os restantes receberam volume equivalente de salina. Três animais tratados e os do grupo controle foram sacrificados por perfusão via intracardíaca, com solução de Karnovsky, 24 horas e os outros três, 72 horas após a injeção. Após desmineralização pelo EDTA, as hemimandíbulas foram divididas transversalmente em 5 segmentos; o segmento compreendido entre a porção mais incisal da crista alveolar e a face mesial do primeiro molar foi dividido ao meio, sendo a metade incisal denominada RI e a metade apical R2. Os outros três segmentos, denominados R3, R4 e R5 corresponderam respectivamente ao 1°, 2° e 3° molares inferiores. Os segmentos foram pós-fixados em tetróxido de ósmio 1% em tampão fosfato pH 7,3, desidratados com acetona, incluídos em araldite e cortes transversais de 1 'mu 'm de espessura foram corados com azul de metileno. Para a avaliação morfométrica foram usados 3 cortes não consecutivos de cada região. No aumento de 80X foram determinadas as densidades volumétricas do ligamento periodontal ('Vv IND. L') da face mesial e de seus compartimentos: junto ao dente ('Vv IND. T') e junto ao osso ('Vv IND. B'), este último subdividido em tecido conjuntivo ('Vv IND. C') e vasos + nervos ('Vv IND. VN'). No aumento de 800X foram determinados os volumes relativos de fibroblastos ('Vv IND. F') e de matriz extracelular ('Vv IND. ME') em cada região subdividida nos compartimentos: junto ao dente (T), junto ao osso (B) e um intermediário entre ambos (M) desimpedidos, ou seja, a 'Vv IND. C' foi, em geral, maior nos dentes impedidos e menor nos dentes desimpedidos em animais tratados com vimblastina em relação aos respectivos controles. As densidades volumétricas de tibroblastos e matriz extracelular nos diversos. No grupo controle impedido, 'Vv IND. L' , 'Vv IND. T' e 'Vv IND. C' aumentaram de apical para incisal enquanto 'Vv IND. VN' diminuiu na mesma direção. O desimpedimento promoveu, no geral, uma diminuição das 'Vv IND. L', 'Vv IND. T' , 'Vv IND. VN' e aumento da 'Vv IND. C'. Não houve diferença marcante entre os dois tempos de tratamento pela vimblastina, que provocou um aumento de 'Vv IND. L' e 'Vv IND. T' nas regiões mais apicais em comparação com os respectivos controles. Em relação à porção de tecido conjuntivo do compartimento junto ao osso ('Vv IND. C' ), a vimblastina provocou uma alteração inversa entre dentes impedidos e desimpedidos, ou seja, a 'Vv IND. C' foi, em geral, maior nos dentes impedidos e menor nos dentes desimpedidos em animais tratados com vimblastina em relação aos respectivos controles. Quanto à 'Vv IND. VN', sua tendência foi diminuir nos animais tratados, tanto nos dentes impedidos, quanto nos desimpedidos. As densidades volumétricas de tibroblastos e matriz extracelular nos diversos compartimentos e regiões do ligamento periodontal dos incisivos controles desimpedidos diferiram do que é referido na literatura e dos resultados obtidos com o mesmo material em microscopia eletrônica. Provavelmente, ao microscópio óptico, a densidade volumétnca da matriz extracelular foi superestimada, enquanto que a dos tibroblastos foi subestimada devido aos tinos prolongamentos citoplasmáticos destas células; só identiticáveis ao microscópio eletrônico. Como isto ocorreu com maior freqüência nos incisivos desimpedidos, é possível que o número de processsos tibroblásticos tenha aumentado no ligamento destes dentes. Esta hipótese só poderá ser avaliada num futuro trabalho, o que fez com que deixássemos, por ora, de considerar os dados de 'Vv IND. F' e 'Vv IND. ME' / Abstract: The volume density of the compartments of several regions at the mesial face of Periodontal ligament in lower incisors of rats, was analized in conditions such as impeded and unimpeded eruption and after treatment with vinblastine. The volume density of fibroblast and extracellular matrix in the compartments of each region was also determined. Nine male wistar rats had their lower left incisors sectioned each two days and kept in unimpeded eruption, while the contralateral ones were kept in oclusion. On the 7th day, six animals received intraperitoneally a single dose of vinblastine (2 mg/k of body weigth), while the three controls received an equivalent volume of saline. The animals were killed by intracardiac perfusion with Kamovsky's solution, 3 treated ones and 3 controls at 24 h, and 3 treated at 72 h after vinblastine injection. After desmineralization with EDT A, the hemimandibules were dividided tranversally in 5 segments: the segment between the most incisal- portion of alveolar crest and the mesial face of the first molar was divided in the middle, calling the incisal half as RI and the apical half as R2. The other 3 segments, denominated as R3, R4, R5 were respectively related to the first, second and third lower molars. The segments were pos-fixed with osmium tetroxide 1% in phosphate buffer pH 7.3, dehidrated with acetone, embeded in araldite and 1 'mu'-thick transversal sections were stained with methilene blue. For the morphometric evaluation, using a grid of 100 points, three non consecutive sections of each region were analysed. The volume density of the periodontalligament ('Vv IND. L' ) of the mesial face and its compartments: tooth-related ('Vv IND. R') and alveolar bone-related ('Vv IND. B'), the latter subdivided in connective tissue ('Vv IND. C') and blood-vessels plus nerves ('Vv IND. VN') was determined at a magnification of x80. At magnification of x800, using 16 points of the same grid, the relative volume of fibroblasts ('Vv IND. F') and extracellular matrix ('Vv IND. ME') was determined in each region subdivided in the following compartments: tooth-related (T), alveolar bone-related (B) and a middle one between the two (M). In the impeded control group, 'Vv IND. L' ,'Vv IND. T' and 'Vv IND. C' increased trom apical to incisal, while 'Vv IND. VN' decreased in the same direction. In general, the unimpeded controls showed decrease of 'Vv IND. L','Vv IND. T' and 'Vv IND. VN' and an increase of 'Vv IND. C' as compared to the impeded ones. There were no an increase of 'Vv IND. L' and 'Vv IND. T' in the most apical regions, as compared to the respective controls. As for 'Vv IND. C', vinblastine caused an inverse alteration between the impeded and unimpeded teeth, marked differences between the two groups of vinblastine treated animals. Vinblastine induced 'Vv IND. C' was, in general, bigger in impeded teeth and smaller in unimpeded teeth of vinblastine treated animals compared to the respective controls. The tendency Of 'Vv IND. VN' was to decrease in both impeded and unimpeded teeth of vinblastine treated rats. Our results on the volume density of periodontalligament fibroblasts and extracellular matrix: in control unimpeded incisors were different trom data related in the literature and even trom the ones yie1d by the same material 3;. the e1ectron microscope leveI. At the light I microscope the volume density of the extracellular matrix was probably superestimated, while the fibroblast volume was underestimated, probably because of the thin citoplasmatic prolongaments ofthese cells, only visualized with the electron microscope. Since this was most trequent in unimpeded incisors, the number of fibroblasts processes could have increased in the periodontal ligament of these teeth. This hypothesis should be evaluated in a future work, so we decided not to consider, for the time being, the data of 'Vv IND. F' and 'Vv IND. ME' / Mestrado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Mestre em Odontologia
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Analise do efeito autocrino do fator de crescimento transformante-B1 na proliferação celular de fibroblastos gengivais de pacientes com fibromatose gengival hereditaria

Andrade, Cleverton Roberto de 03 January 2001 (has links)
Orientador: Ricardo Della Coletta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-27T17:13:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_ClevertonRobertode_M.pdf: 4945048 bytes, checksum: bb1b214cc6a88afd54b208ac9a66daeb (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: IFGH é uma condição oral rara caracterizada por um aumento gengival generalizado com crescimento lento e progressivo. Evidências experimentais de monstram que o aumento gengival observado em pacientes com FGH pode estar associado com uma elevada capacidade proliferativa de fibroblastos residentes, um aumento na síntese de colágeno ou uma redução nos níveis de expressão, produção e secreção de MMPs. TGF-B1 é uma citocina com papel importante na patogênese de desordens fibróticas, incluindo FGH, devido a sua habilidade de estimular a síntese e reduzir a degradação de MEC. Embora tenha sido demons trado que em FGH, TGF-B1 em uma fração autócrina reduz os níveis de expressão e produção de MMPs, o papel desta citocina na modulação do crescimento celular não foi ainda estabelecido nesta doença. O objetivo deste estudo foi verificar o comportamento proliferativo de fibroblastos gengivais de 12 pacientes com FGH e determinar o papel do efeito autócrino de TGF-B1 como um estimulador do crescimento celular, através de 2 métodos bem descritos na literatura: oligonucleotídeos antisense contra a região de tradução de TGF-B1 e anticorpos neutralizantes. Quatro diferentes ensaios de análise de proliferação celular: incorporação demonstraram que os índices de proliferação foram significantemente maiores em de BrdU, expressão de PCNA, análise quantitativa de AgNORs e índice mitótico fibroblastos de FGH que em células controle. Oligonucleotídeos antisense reduziram a produção de TGF-B1 como demonstrado por ELlSA, enquanto que os níveis de expressão de RNAm para TGF-B1 não foram alterados significantemente como revelado por RT-PCR. A redução na produção e atividade de TGF-B1 acompanhadas pelo tratamento com oligonucleotídeos e anticorpos neutralizantes, respectivamente, resultaram na redução na capacidade proliferativa de fibroblastos de FGH. Estes resultados indicam a existência de um papel autócrino de TGF-B1 como um estimulador da proliferação celular de fibroblastos de FGH / Abstract: TGF-f31 autocrine stimulation regulates fibroblast proliferation in hereditary gingival fibromatosis Hereditary gingival fibromatosis (HGF) is a rare oral disease characterized by a slow and progressive enlargement of both the maxilla and mandible gingiva. Increased proliferation, elevated synthesis of extracellular matrix, particularly collagen, and reduced levels of matrix metalloproteinases seem to contribute to the pathogenesis of gingival overgrowth in HGF patients. Transforming growth factor (TGF-_1) is an important cytokine thought to play a major role in fibrotic disorders, such as HGF, due to its ability to stimulate the synthesis and reduce the degradation of extracellular matrix. In HGF fibroblasts, TGF-_1 autocrine stimulation reduces expression and production of matrix metalloproteinases. However, the role of TGF-_1 in the fibroblast growth modulation has not been established in this disease. The aim of this study was confirm the increased proliferation rate of HGF fibroblast cell lines and to explore a possible autocrine role of TGF-_ 1 as a cell growth stimulator by blocking production of this endogenous cytokine using two well established systems: antisense oligonucleotides and neutralizing antibodies. Four different cellular proliferation assays: BrdU-labeling, Agnor, PCNA and mitotic indexes confirmed that tibroblasts trom HGF proliferate significantly faster than those from normal gingiva. Antisense oligonucleotides reduced TGF-_1 production as demonstrated by capture ELlSA, whereas mRNA TGF-_ 1 statement levels were not significantly modified by using RT-PCR . Blocking TGF-_1 synthesis with oligonucleotides or its activity with specific antibodies resulted in a decreased magnitude of HGF fibroblast proliferation. These results are consistent with the existence of an autocrine role of TGF-_1 as a stimulator of HGF fibroblast proliferation / Mestrado / Mestre em Biologia e Patologia Buco-Dental
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Anisotropias opticas em feixes de colageno e pesquisa de morte celular em fibroblastos de tendões durante o estabelecimento do diabetes espontaneo em camundongos não-obesos (NOD)

Rodrigues, Marcela Aldrovani 27 August 2004 (has links)
Orientadores: Benedicto de Campos Vidal, Maria Luiza Silveira Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:12:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_MarcelaAldrovani_M.pdf: 772611 bytes, checksum: 98863f8fc3e779f3b2e9d793b94fa5bb (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Camundongos NOD são ótimos modelos para estudo, uma vez que são portadores de duas importantes características: diabetes e resistência à apoptose. É desconhecido se a elevada resistência à apoptose atinge células somente do sistema imune onde foi descrita, ou se é uma característica de células de outros sistemas/tecidos. O diabetes mellitus provoca alterações na matriz extracelular (MEC) por meio da glicosilação não-enzimática das proteínas intercelulares, tal como o colágeno. No processo não-enzimático de glicosilação da proteína colagênica, o grupo aldeído da glicose reage com o grupamento amina livre de resíduos de lisina e hidroxilisina do colágeno, formando uma base Schiff reversível que origina os produtos de Amadori. Estes produtos dão origem aos produtos de glicosilação avançada (AGEs) que desencadeiam a formação de ligações cruzadas entre as moléculas de colágeno. O colágeno interage com receptores de superfície celular de modo que alterações nesta glicoproteína poderiam alterar a transdução de sinais da MEC para as células. O presente estudo visa descrever e quantificar as propriedades anisotrópicas ópticas em feixes de colágeno; buscar alterações elicitadas pelo diabetes nos proteoglicanos (PGs) da MEC; verificar a ocorrência de resíduos de glicose disponíveis no colágeno glicosilado; descrever o intumescimento e a extração de feixes de colágeno em ácido acético a 3% e comparar alguns aspectos da morte celular e do fenótipo nuclear de fibroblastos de feixes de colágeno de camundongos sadios e NOD, buscando-se alterações elicitadas pelo diabetes. Para isso, tendões do calcâneo e da cauda de 14 camundongos NOD e BALB/C (não-diabéticos) foram submetidos aos seguintes experimentos: Medidas de retardo óptico (RO) das birrefringências; digestão enzimática com hialuronidase testicular; colorações com azul de toluidina (AT) pH 4.0 e concanavalina Br (ConBr); intumescimento e extração do colágeno; reação de Feulgen, análise de imagem nuclear e teste imunocitoquímico de TUNEL. Os resultados indicam que toda a glicose incorporada não-enzimaticamente ao colágeno foi convertida a produtos de Amadori. O aumento no número de ligações cruzadas intermoleculares tornou as fibras de colágeno mais alinhadas, estáveis e com condições de empacotamento molecular mais intensas em relação às fibras de colágeno controle. A estabilidade torna o colágeno glicosilado mais resistente à extração por ácido acético a 3% e sugere a ocorrência de diminuição na taxa de remodelação tecidual de animais e/ou pacientes diabéticos. Em termos de ordem molecular (cristalinidade) dos feixes de colágeno, parece que o diabetes induz mudanças variáve is em função da estrutura, fato este que sugere a existência de significados fisio-patogênicos distintos. Quanto aos PGs da MEC, não foram observadas alterações elicitadas pelo diabetes nestas macromoléculas. Os parâmetros geométricos e densitométricos que caracterizam o fenótipo nuclear dos fibroblastos também foram alterados pelo diabetes, sendo que encontrou-se um aumento desses parâmetros ao compará-los com os observados em núcleos de fibroblastos de camundongos não-diabéticos. Não foi constatada positividade ao teste de TUNEL nos núcleos dos fibroblastos estudados / Abstract: NOD mice possess two characteristics: diabetes and resistance to various apoptosis signals. Diabetes mellitus provokes alterations in the extracellular matrix (ECM) through of the non-enzymatic glycosylation of intercellular proteins, such as the collagen. In the process of non-enzymatic glycosylation of the collagen protein, the carbonyl group of a sugar reacts with the amino group of a protein and forms a Schiffs¿ base which reacts further into a Amadori products. The products of early glycosylation undergo rearrangements resulting in the formation of irreversible products, the so-called advanced glycosylation endproducts (AGEs). AGEs formation is probably one of the main mechanisms underlying the increased arterial stiffness in diabetic patients or diabetic complications in general. The collagen interacts with cell receptors, consequently alterations in the collagen can change the signal transduction from ECM for the cells. The principal objectives of present study are: to describe the anisotropic properties of collagen bundles obtained from NOD mice and to compare some aspects of the cell death and nuclear phenotype of fibroblasts obtained from NOD and BALB/C mice. For this, calcaneal and tail tendons were submitted to the following experiments: measurements of intrinsical and textural birefringence; enzymatic digestion; staining with toluidine blue (TB) pH 4.0; Concanavalin Br method; collagen extraction; Feulgen reaction, analysis of nuclear images and TUNEL test. The results indicate that all glucose was converted the Amadori products. The increase in the number of cross-linking becomes the collagen fibers both more 16 aligned and with more intense molecular packing conditions than those of the control. In terms of molecular order (crystallinity) of collagen bundles, the diabetes induces variable changes in function of the structure, fact this that suggests the existence of different physio-pathogenics meanings. The analysis of parameters that characterize the nuclear phenotype (area, perimeter, OD, IOD, SDtd and entropy) indicate physiological differences between the fibroblasts obtained from NOD and BALB/C mice. The reply to the TUNEL test was negative in the fibroblasts / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural
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Estudo citoquimico, imunocitoquimico e de analise de imagem de celulas fibroblasticas em proliferação e apoptose na ausencia e presença de colageno tipo I hiperpolimerizado

Maria-Engler, Silvya Stuchi 15 October 1998 (has links)
Orientador: Benedicto de Campos Vidal / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T06:41:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria_SilvyaStuchi_D.pdf: 6365323 bytes, checksum: 6d4c28f92f74ac737d03b7a3634c42cf (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: o presente trabalho é composto de dois estudos, o primeiro que trata a respeito da análise da morte celular por apoptose em células fibroblásticasem culturas confluentes e o segundo, sobre a influênciado substrato à base de colágeno tipo I hiperpolimerizado no crescimento e apoptose de células fibroblásticascultivadas por longo período. As células BHK21 em apoptose, submetidas à reação de Feulgen e a seguir à análise de imagem, demonstraram menor conteúdo de DNA, representado pela diminuição dos valores de IOD (densidade óptica integrada). Após a reação de ConcanavalinaA (Com A), os núcleos apoptóticos exibiram uma maior positividade de reação que os núcleos normais, o que demonstra a presença de glicoproteínas, possivelmente da matriz nuclear, rearranjadas e complexadas ao DNA do núcleo apoptótico. O arranjo ordenado da complexação de glicoproteínas ao DNA foi confirmado através de coloração com ATCEC (azul de toluidina-concentração crítica de eletrólitos), a qual diferencia DNA de RNA, seguida por observação em microscopia de polarização. Células fibroblásticasV79, submetidas à reação de Feulgen e estudadas por análise de imagem, mostraram em culturas confluentes três fenótipos diferentes classificados como normal, suspeito de apoptose e apoptótico. Tal classificação foi feita aliando análise morfológica e avaliação de parâmetros como conteúdo de DNA (IOD), condensação cromatínica em termos de densidade óptica e medidas de área nuclear. Nossos resultados revelaram que a condensação cromatínica aumentou quando comparados os três fenótipos entre si. Foi observado decréscimo nos valores Feulgen-DNA em células apoptóticas e em células suspeitas de apoptose, revelando-se perda de DNA. Em conclusão, destacou-se a importância do método utilizado para caracterizar fases iniciaisdo processo apoptótico e a possibilidade de diagnóstico inequívoco de apoptose, ao utilizar esta metodologia, desde que associada a outras, quer citoquímicas, imunocitoquímicasou bioquímicas. No último estudo, células fibroblásticas V79 foram cultivadas em substrato de colágeno tipo I hiperpolimerizado. Este substrato apresenta características especiais de auto-agregação e é uma estrutura ordenada que mimetiza a estrutura apresentada pelos tendões in vivo. O cultivo celular de longa duração sobre este substrato foi caracterizado por análise de proliferação, diferenciação e morte celular por apoptose, comparado ao crescimento das células sobre lamínulas. A reação de Feulgen, associada à análise de imagem demonstrou que as células apresentaram um aumento no conteúdo de DNA e da condensação cromatínica quando crescidas em substrato colagênico. A proliferação das células V79 sobre colágeno foi menor, refletindo uma fase de latência neste substrato e após o método de TUNEL, específico para detecção de apoptose, observou-se que a morte celular ocorria, porém em tempos de cultivo superiores aqueles observados para células que cresceram sobre lamínula. Demonstrou-se que o substrato colagênico altera o desenvolvimento proliferativo e metabólico dos fibroblastos, características que sugerem a diferenciação celular, e também atrasa, mas não previne o processo apoptótico / Abstract: matrix which were disorganized and complexed to the DNA of apoptotic nuclei. The ordered arrangement of glycoproteins on the DNA was confirmed by TB-CEC (Toluidine blue-critical electrolyte concentration) which diferentiatesDNA ftom RNA after polarization mycroscopy analyses. V79 fibroblast cells submitted to the Feulgen reaction and image analysis of confluent cultures showed three different nuclear phenotypes classified as normal, suspected of apoptosis and apoptotic. This classification were done using morphological analysis and consideration of parameters such as DNA content (IOD), chromatin condensation in terms of optical density (OD) and nuclear area. The results showed that chromatin condensation increased when the three phenotypes were compared. A decrease of Feulgen-DNA values was observed in apoptotic cells and in cells suspected of apoptosis, revealing loss of DNA. In conclusion, this pointed out the importance of this method to characterized early phases of an apoptotic process and the possibility of inequivocal apoptosis diagnosis using this methodology when associated with others, such as cytochemical, immunocytochemical or biochemicalmethods. In the other aprroach, V79 fibroblastic cells were cultured on hyperpolymerized collagen type I substrates. The substrate showed special characteristics of self-assemleyand is an ordered structure that mimics the in vivo tendon. The long-term cell culture on this substrate was characterized by proliferation, differentiation and cell death by apoptosis analysis when compared to cell growth on coverslips. The Feulgen reaction allied to image analysis demonstrated that there is an increase in DNA content and in chromatin condensation when the cells are grow on the collagen substrate. The proliferation of V79 cells on collagen was less than observed for cells grown on a coverslips, which reflects the latency of this substrate. After the apoptosis specific TUNEL method, cell death was found to occur after longer culture periods than for cells grown on coverslips. The collagen substrate alters fibroblast proliferation and morphological aspects, characteristics that suggest cellular differentiation and the delay of apoptosis but not prevent the prevention of the apoptotic processo / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências Biológicas
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Impactos do uso da s-adenosil-l-homocisteína (sah) como agente desmetilante de dna no sistema de cultivo celular de bovinos / Impacts of using s-adenosyl-l-homocysteine in bovine cell culture system

Azevedo, Juliana Mayumi de 24 May 2012 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Animais, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-04-04T10:42:28Z No. of bitstreams: 1 2012_JulianaMayumideAzevedo.pdf: 1608080 bytes, checksum: 97984e1187f9e34bece9e7abdf692322 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-09T14:39:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JulianaMayumideAzevedo.pdf: 1608080 bytes, checksum: 97984e1187f9e34bece9e7abdf692322 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-09T14:39:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JulianaMayumideAzevedo.pdf: 1608080 bytes, checksum: 97984e1187f9e34bece9e7abdf692322 (MD5) / Fatores epigenéticos são responsáveis por controlar a expressão de genes e diferenciação durante a vida celular. Dentre eles, a metilação do DNA é o mais estudado. Cada tipo celular possui um padrão epigenético altamente especializado. Após a fecundação natural ou clonagem por transferência nuclear (TNCS), um padrão epigenético préexistente deve ser apagado e restabelecido para garantir o correto desenvolvimento embrionário. Porém, nos clones, essa reprogramação é ineficiente mas é possível que o uso de substâncias desmetilantes de DNA utilizadas durante o cultivo celular de células doadoras de núcleo possa desmetilar o DNA, aumentando a eficiência da técnica. O objetivo desse estudo foi avaliar, em fibroblastos bovinos, o efeito da S-Adenosil-L-Homocisteína (SAH) na viabilidade celular, metilação de DNA e expressão do transcrito específico do gene XIST responsável pela inativação do cromossomo X. Células foram cultivadas em meio de cultivo DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium -Gibco®), suplementado com 0.5mM, 1.0mM, 1.5mM e 2.0mM de SAH (Sigma®), incubado a 39°C e 5% de CO2. O padrão de metilação do DNA foi avaliado através do sequenciamento de sequências de DNA tratadas com bissulfito de sódio, usando o kit EZ DNA methylation Kit™ (ZymoResearch®), para converter citosinas não metiladas. O RNA total das células foi extraído com o kit RNeasy Plus Micro kit (Qiagen®) e o transcrito de XIST foi quantificado por PCR em tempo real, usando GAPDH e CYC-A como controles endógenos. O número de células foi comparado entre o grupo controle e os grupos tratados com 0.5mM, 1.0mM, 1.5mM e 2.0mM de SAH e a metilação do DNA e a expressão entre o grupo controle e o grupo tratado com 2.0mM de SAH. Não houve diferença na viabilidade celular, metilação de DNA e expressão gênica entre os tratamentos. O grupo controle apresentou 100% de sequências hipermetiladas e 87,58% de metilação e o grupo tratado com 2.0mM de SAH apresentou 92,86% de sequências hipermetiladas e 82,35% de metilação. O uso do SAH como agente desmetilante no cultivo celular é uma alternativa viável que continua sendo estudada. Acredita-se que um processo de desmetilação é induzido pelo uso do SAH durante o cultivo celular, contribuindo para o aumento da eficiência da TNCS. Contudo, é necessário avaliar outras concentrações e diferentes tempos de cultivo com o SAH. _______________________________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Epigenetic factors are responsible for controlling gene expression and differentiation through the cell life. Among them, DNA methylation is the most studied. Each cell type possesses a specific and highly specialized epigenetic pattern. After natural fertilization or cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT), a pre-existing epigenetic pattern must be erased and reestablished to ensure correct embryo development. However, in cloning this reprogramming is inefficient and it is possible that the use of a DNA demethylating substance can improve the efficiency of the technique. The aim of this study was to evaluate, in bovine skin fibroblasts, the effects of S-(5’-adenosyl)-L-homocysteine (SAH) on cell viability, DNA methylation and expression of the X-inactive specific transcript (XIST) gene. Cells were cultivated in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco®) supplemented with 0.5mM, 1.0mM, 1.5mM e 2.0mM of SAH (Sigma ®) incubated at 39°C with 5% CO2 in air. The pattern of DNA methylation was assessed by bisulfite sequencing, using the EZ DNA methylation Kit™ (ZymoResearch®) to convert unmethylated cytosines. Total RNA was extracted with the RNeasy Plus Micro kit (Qiagen®) and the XIST transcript was quantified by qPCR using GAPDH and CYC-A as endogenous controls. The number of cells was compared among 0.5mM, 1.0mM, 1.5mM e 2.0mM of SAH and control groups and DNA methylation and gene expression between control and 2.0mM groups. There were no differences in cell viability, DNA methylation and gene expression among treatments. Control group showed 100% of hypermethylated sequences and 87.58% of methylation and the 2.0mM group showed 92.86% of hypermethylated sequences and 82.35% of methylation.The use of SAH as a DNA demethylating agent in cell culture is a viable alternative and still little studied. It is believed that a demethylation process is induced by the useof SAH in the culture, contributing to increase the efficiency of SCNT. However, it is necessary to evaluate other concentrations and different times of cultivation with SAH.

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