Orientador: Maria Beatriz Puzzi, Maria Helena Stangler Kraemer / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:54:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souto_LuisRicardoMartinhao_M.pdf: 2402921 bytes, checksum: a79b6ae181ce1b24d01ec608815d8bf7 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A obtenção de uma pele humana que apresente derme e epiderme, reconstruída a partir de células isoladas de pacientes, possibilita a realização de enxertos autólogos de pele reconstruída em laboratório (in vitro) em pacientes com áreas doadoras escassas além de permitir ensaios com substâncias químicas e drogas in vitro e não mais in vivo. A partir da cultura de fibroblastos humanos, é possível obter um número suficiente de células que podem ser injetadas em uma matriz de colágeno bovino tipo I que, mantida imersa em meio de cultura, específico para fibroblastos, permite a formação de uma derme humana reconstruída in vitro. Sobre essa derme, através de cultura de queratinócitos e melanócitos humanos, forma-se uma epiderme diferenciada levando à formação de uma pele humana reconstruída in vitro, constituída de derme e epiderme associadas. Essa pele humana formada é, histologicamente, semelhante à pele humana in vivo. Na derme, identifica-se o tecido colágeno, com suas células, e a matriz extracelular organizados paralelamente à epiderme. Esta se desenvolve em várias camadas. Não há distinção entre derme e epiderme no experimento controle, onde não foi utilizado o colágeno bovino tipo I / Abstract: The technique to obtain human skin presenting dermis and epidermis reconstructed from cells isolated from patients allows the performance of autologous grafts of skin reconstructed in laboratory (in vitro) on patients with scarce donor sites, in addition to permitting trials with chemical substances and drugs no more in vivo, but in vitro. It is possible to obtain a sufficient number of cells from human fibroblast culture that can be injected in bovine collagen type I matrix and kept submerged in a specific culture medium for fibroblasts. This will permit the formation of human dermis reconstructed in vitro. On this dermis, through culture of human keratinocytes and melanocytes, a differentiated epidermis is formed, leading to the creation of human skin reconstructed in vitro, composed of associated dermis and epidermis. This human skin is histologically formed in the same way as human skin in vivo. Collagen tissue can be identified in the dermis, with its cells and extracellular matrix organized in parallel to the epidermis, which is developed in several layers / Mestrado / Patologia Clinica / Mestre em Ciências Médicas

O presente trabalho tem como objetivo investigar a influência de materiais utilizados na prática odontológica (Single Bond, HEMA, Vitrebond, Ketac Molar e Dycal) na resposta inflamatória de fibroblastos cultivados de polpa dental humana de dentes permanentes em relação à expressão e produção de mediadores da inflamação. As culturas primárias de fibroblastos foram estabelecidas a partir do tecido pulpar de terceiros molares hígidos. Após a quarta passagem, os fibroblastos foram estimulados pelos materiais e pelos materiais seguidos por LPS de E. coli pelos tempos de 6 e 24 horas. Os testes utilizados foram: MTT, Trypan Blue, Análise de Griess, PCR quantitativo e ELISA. Os dados foram analisados estatisticamente aplicando-se o teste ANOVA a 1 critério e pós-teste de Tukey e ANOVA a 2 critérios e teste de correção de Bonferroni (p<0,05). Os materiais SB10 (Single Bond 1:100) e DY (Dycal) afetaram a viabilidade celular com diminuição do metabolismo. Os materiais SB1 (Single Bond 1:1.000), SB10 (Single Bond 1:100) e VB (Vitrebond) seguidos de LPS de E. coli diminuíram o metabolismo celular de maneira estatisticamente significativa. Os níveis de óxido nítrico produzidos foram diminuídos quando os fibroblastos foram estimulados pelo KM (Ketac Molar). A expressão gênica para pró-colágeno tipo I foi diminuída quando os fibroblastos foram estimulados pelos materiais SB10 (Single Bond 1:100), SB (Single Bond polimerizado) e DY (Dycal). Para o SDF-1_/CXCL12 houve um aumento da expressão para o grupo estimulado apenas por LPS de E. coli, SB10 (Single Bond 1:100) e DY (Dycal). Para o IL-6 notou-se uma diminuição significativa para o grupo estimulado por H1000 (HEMA 1000 nM) e um aumento para o grupo SB10 (Single Bond 1:100). A expressão gênica de IL- 8/CXCL8 diminuiu para os fibroblastos estimulados pelas três concentrações de HEMA e de Single Bond, VB (Vitrebond) e DY (Dycal) no período de 6 horas e houve um aumento para os materiais SB10 (Single Bond 1:100) e VB (Vitrebond) no período de 24 horas. Houve diminuição na secreção de SDF-1_/CXCL12 para as três concentrações de HEMA e DY (Dycal) e uma tendência de diminuição para os demais materiais testados. A produção de IL-6 foi aumentada para os materiais VB (Vitrebond) e KM (Ketac Molar). A produção de IL- 8/CXCL8 foi aumentada para SB1 (Single Bond 1:1.000), VB (Vitrebond) e KM (Ketac Molar) e diminuída para SB10 (Single Bond 1:100) e DY (Dycal). O Single Bond e o HEMA, em várias concentrações, diminuíram a expressão e produção de moléculas envolvidas no processo inflamatório e, por causa de seu efeito citotóxico, devem ser vistos com cautela quando em íntimo contato com o órgão pulpar. O hidróxido de cálcio causou intensa morte celular e não estimulou a produção dos mediadores da inflamação avaliados neste trabalho, mas esse evento parece ser fundamental para o processo de reparo do tecido pulpar e formação de barreira mineralizada. Os cimentos de ionômeros de vidro utilizados aumentaram a produção de quimiocinas relacionadas ao processo inflamatório, portanto, esses materiais, embora não tenham causado morte de grande número celular, devem ser utilizados com restrições. / The aim of the present study is to investigate the influence of dental materials (Single Bond, HEMA, Vitrebond, Ketac Molar e Dycal) in the inflammatory response of human dental pulp fibroblasts from permanent teeth in relation to inflammatory mediators expression. and production. Primary cultures were established from third molars pulp tissue. After the fourth passage, the fibroblasts were stimulated only by materials and also by the materials followed by LPS from E. coli for 6 and 24 hours. Data were statistically analyzed using Oneway ANOVA and Tukey post-test and Two-way ANOVA followed by Bonferroni post-test (p<0.05). SB10 (Single Bond 1: 100) and DY (Dycal) affected cell viability and consequently decreased cell metabolism. SB1 (Single Bond 1:1,000), SB10 (Single Bond 1:100) and VB (Vitrebond) followed by LPS E. coli decreased cell metabolism. Nitric oxide levels were reduced when fibroblasts were stimulated by KM (Ketac Molar). Pro-collagen type I expression was reduced when fibroblasts were stimulated by SB10 (Single Bond 1:100), SB (polymerized Single Bond) and DY (Dycal). SDF-1_/CXCL12 expression was increased for the group stimulated only by LPS from E. coli, SB10 (Single Bond 1:100) and DY (Dycal). IL-6 expression had a significant decrease in the group stimulated by H1000 (HEMA 1000 nM) and an increase for SB10 (Single Bond 1:100) group. The expression of IL-8/CXCL8 decreased when fibroblasts were stimulated by the three concentrations of HEMA and of Single Bond, VB (Vitrebond) and DY (Dycal) at 6 hours and increased for SB10 (Single Bond 1:100) and VB (Vitrebond) at 24 hours. There was decrease in SDF-1_/CXCL12 production for the three concentrations of HEMA and DY (Dycal) and a declining trend for the other materials tested. The production of IL-6 was increased by VB (Vitrebond) and KM (Ketac Molar). The production of IL-8/CXCL8 increased by SB1 (Single Bond 1:1,000), VB (Vitrebond) and KM (Ketac Molar) and decreased by SB10 (Single Bond 1:100) and DY (Dycal). Single Bond and HEMA, in different concentrations, decreased the production and the expression of molecules involved in the inflammatory process and, because of its cytotoxic, should be viewed with caution when in intimate contact with the pulp tissue. Calcium hydroxide caused intense cell death and did not stimulate the production of inflammatory mediators evaluated, but this event seems to be essential to the pulp tissue repair process and mineralized barrier formation. The glass ionomer cements used increased the production of chemokines related to the inflammatory process, therefore, these materials, although they have not caused death of many cells, must be used with restrictions.

Fibroblastos são células essenciais na cicatrização da derme, sintetizando e degradando matriz extracelular (MEC) e sua função é alterada pela hiperglicemia. Demonstramos previamente uma deficiência na migração de fibroblastos de ratos diabéticos, acompanhada de dilatação das cisternas do retículo endoplasmático (RE) e aumento no número de mitocôndrias. Neste estudo avaliamos se a glicose elevada (HG) induz estresse do RE, resultando na ativação da via UPR (Unfolded Protein Response). Conforme observado por microscopia eletrônica de transmissão, fibroblastos NIH-3T3 expostos por 3 dias a HG apresentaram dilatação do RE e alteração na morfologia das mitocôndrias. A expressão dos marcadores de estresse do RE: BiP, XBP1 spliced (XBP1s) e CHOP não foi alterada pela HG. Resultados semelhantes foram observados em fibroblastos de ratos diabéticos. A marcação com um indicador fluorescente do potencial de membrana mitocondrial não foi modificada pela glicose elevada. Esses resultados sugerem que a disfunção de fibroblastos frente à HG não está relacionada a estresse de RE. / Fibroblasts are essential cells during dermis wound healing, synthesizing and degrading extracellular matrix (ECM); their function is altered by hyperglycemia. We have previously demonstrated an impairment of migration of fibroblasts derived from diabetic rats, accompanied by the enlargement of endoplasmic reticulum (ER) cisternae and an increase in the number of mitochondria. This study assessed whether high glucose (HG) induces stress of ER, resulting in the activation of UPR (Unfolded Protein Response). As observed by transmission electron microscopy, NIH-3T3 fibroblasts exposed for 3 days to HG showed enlargement of the ER cisternae and changes in the morphology of mitochondria. The expression of the ER stress markers: BiP, spliced XBP1 (XBP1s) and CHOP was not altered by HG. Similar results were observed in fibroblasts derived from diabetic rats. Labeling with a fluorescent indicator of mitochondrial membrane potential was not altered by high glucose. These results suggest that dysfunction of fibroblasts exposed to HG is not related to ER stress.

A terapia de fotobiomodulação tem sido vastamente utilizada em cultura de fibroblastos com o objetivo de se verificar seu real efeito na cicatrização de feridas e de se estabelecer os melhores parâmetros de luz. Pacientes com síndrome de Down (SD) possuem alta prevalência da doença periodontal (DP) e importantes alterações imunológicas, as quais podem interferir no processo de cicatrização. O objetivo do presente estudo foi de avaliar os efeitos da utilização de Laser e LED em fibroblastos gengivais de pacientes com e sem SD (FSD e FGH, respectivamente), verificando a viabilidade celular e o processo In vitro de cicatrização de feridas. As células foram cultivadas em placas de 96 poços (1x103 célula/poço) e colocadas em estado de aquiescência (meio DMEM com 1% de soro fetal bovino) 24h antes da irradiação e retomando sua condição inicial de 10% de soro fetal bovino (SFB) instantes antes da aplicação de Laser (AlGaAs - 660nm e AlGaInP - 810nm) e LED (637 ±15nm) com exceção do controle negativo (C-) que continuou com 1% de SFB. Os grupos foram divididos em: C+ (sem irradiação, 10% SFB), C- (sem irradiação, 1% SFB), LIV5 (5 J/cm2 por 3s), LIV8 (8 J/cm2 por 5s), LV5 (5 J/cm2, por 3s), LV8 (8 J/cm2 por 5s), LED3 (0,03 J/cm2 por 3s) e LED5 (0,05J/cm2 por 5s). A potência utilizada foi a mesma tanto para o Laser como para o LED (40mW). A viabilidade celular foi avaliada através dos testes colorimétricos MTT e Cristal Violeta, nos períodos de 24,48,72 e 96h. O teste de cicatrização de feridas In vitro (placas de 24 poços) para avaliação da migração dos fibroblastos, foi nos períodos de 12, 24, 36 e 48h. A análise estatística foi realizada através do teste ANOVA de medidas repetidas complementado pelo teste de Tukey (p<0,05). Os grupos experimentais, em grande parte dos períodos, obtiveram melhor viabilidade celular em relação ao C+, com exceção do grupo LIV8 que apresentou crescimento celular próximo de zero, em todos os períodos. Para FSD os melhores resultados foram com LIV5, LED3 e LED5 (p<0,05), enquanto que para FGH, foi o LV5 (p>0,05). No ensaio de cicatrização de feridas os melhores resultados foram LIV5 para FGH (p<0,05) e todos os tratamentos com exceção do LIV8 para FSD (p<0,05). Os FSD apresentaram maior fechamento da ferida em relação ao FGH nos períodos de 24 e 36h (p<0,05). Como conclusão, a fotobiomodulação por Laser e LED mostrou ser efetiva para viabilidade celular, tanto para o FGH como para o FSD, com exceção do Laser infravermelho de maior densidade de energia e maior tempo de exposição (LIV8). Na migração celular, a fotobiomodulação foi efetiva no maior fechamento da ferida para os FSD. Logo, a terapia de fotobiomodulação por Laser e LED, com os parâmetros adequados, parecer ser um tratamento adjuvante promissor para pacientes com SD. / The photobiomodulation therapy has been widely used in fibroblast culture in order to verify its effects on wound healing and to establish the best parameters of light. Down\'s syndrome patients (DS) present high prevalence of periodontal disease (PD) and important immunological changes, which could interfere on the wound healing process. The aim of this study was to evaluate the Laser and LED effects on gingival fibroblasts cultures from patients with or without DS (FSD and FGH, respectively), through cell viability tests and in vitro wound healing test. Cells were grown in 96-well plates (1x103 cells / well) and then, put in a quiescence environment, (DMEM medium with 1% fetal bovine serum) for 24 hours before irradiation. After that an initial condition of 10% fetal bovine serum (FBS) was set before Laser (Red -AlGaAs - 660nm and Infrared - AlGaInP - 810nm) and LED (637 ± 15nm) application, with the exception of the negative control (C-) which still remained with 1% FBS. The groups were divided in: C+ (no irradiation, 10% FBS), C (no irradiation 1% FBS), LIV5 (5J/cm2 for 3s), LIV8 (8 J / cm2 for 5s), LV5 (5J/cm2 for 3s), LV8 (8J/cm2 for 5s), LED3 (0.03J/cm2 for 3 seconds) and LED5 (0,05J / cm2 for 5s). The power output was the same for both Laser and LED (40mW). Cell viability was evaluated through MTT and Crystal Violet colorimetric tests, in periods of 24,48,72 and 96h. The in vitro wound healing assay (24 well plates), measured the fibroblasts migration, during 12, 24, 36 and 48 hours. Statistical analysis was performed using repeated measures ANOVA complemented by Tukeys test (p <0.05). The experimental groups, in most periods, presented higher cell viability compared to C+, except for the LIV8 group that exhibited cell growth near to zero, in all periods. In relation to FSD, the best results were with LIV5, LED 3 and LED 5 (p<0.05), while to FGH, the LV5 presented higher viability (p<0.05). The best results for the wound healing test were LIV5 for FGH (p<0,05) and all groups but LIV8 for FSD (p<0,05). FSD cells presented higher wound closure in relation to FGH at 24 and 36h (p<0,05). In conclusion, the Laser and LED photobiomodulation was effective for cell growth, for both FGH and FSD cells, except for the infrared laser with higher energy density and longer exposure time (LIV8). Photobiomodulation was more effective for wound closure by FSD cells. Therefore, laser and LED photobiomodulation therapy, with appropriate parameters, seems to be a promising adjunctive treatment for patients with DS.

Muitas complicações do Diabetes Mellitus, dentre elas a deficiência na cicatrização de feridas, estão associadas à hiperglicemia crônica, que promove estresse oxidativo e glicação protéica aleatória. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos de elevada contração de glicose (ECG) sobre a migração, proliferação e morte de fibroblastos cultivados, e o potencial da terapia com laser em baixa intensidade (LILT) (660 e 780 nm; 40mW; 2, 5, 10 e 30J/cm2) na prevenção desses efeitos. A ECG reduziu a proliferação em cerca de 40%, reduziu a migração em 50% e aumentou a morte celular em 30%. A irradiação diária com LILT em 660nm e 10J/cm2 mostrou-se eficaz na prevenção desses efeitos sobre a proliferação e migração celular. A ECG tambem aumentou a produção de especies reativas de oxigênio pelas células, um efeito nao observado em células irradiadas com LILT. Dessa forma, pode-se sugerir que a terapia com LILT favorece a proliferação e migração de células cultivadas sob ECG, processos essenciais para a cicatrização, possivelmente através de um efeito antioxidante. / Diabetic complications, including wound healing deficiency, are usually associated to chronic hyperglycemia, which leads to oxidative stress and aleatory protein glycation. The aim of this study was to evaluate the effects of high glucose concentrations (HGC) on proliferation, migration and death of cultured fibroblasts, as well as the potential effect of low intensity laser therapy (LILT) (660 and 780 nm; 40mW; 2, 5, 10 and 30J/cm2) preventing these effects. HGC reduced cell proliferation in about 40%, cell migration in about 50% and increased cell death in 30%. Daily irradiation at 660nm and 10J/cm2 was efficient preventing the effects on cell proliferation and migration. HGC also increased the production of reactive oxygen species, an effect totally prevented by LILT. The results suggest that LILT favors cell proliferation and migration, processes very important for healing, possibly through an anti-oxidant effect.

A organização de fibras de colágeno no leito de uma ferida é componente importante da cicatrização e contração da ferida, determinando em última instância a qualidade final da cicatriz. Neste estudo realizamos a implantação de modelo de biotecnologia constituído de géis de colágeno povoados por fibroblastos humanos, que foi utilizado como instrumento para a melhor compreensão dos fenômenos ainda pouco elucidados, envolvidos na contração de feridas. Utilizando fibroblastos procedentes de pele normal ou quelóides, observou-se maior contração dos géis povoados por fibroblastos oriundos de quelóide. O modelo implementado foi considerado eficiente para a avaliação da presença de moduladores da fase de remodelação da cicatriz, tais como o Fator de Crescimento Transformador Beta (TGF beta). A comparação entre a curva de contração gerada por fibroblastos oriudos de pele normal sob o efeito do TGF beta e a contração gerada por fibroblastos de quelóides, demonstra que as mesmas apresentam comportamento igual do ponto de vista estatístico. O modelo proposto demonstrou ser adequado para a melhor compreensão dos mecanismos responsáveis pela contração de feridas, bem como possui potencial na avaliação de novas drogas capazes de modular este fenômeno / An important component of tissue healing and wound contraction is the re-arrangement of ground collagen fibers, which can ultimately influence the final quality of scars. In this study we used a biotechnology experimental model with contracting collagen gels seeded with human fibroblasts in order to better understand the phenomena involved in wound contraction. We compared the contraction of the collagen gels using fibroblasts from normal skin and from keloids, and we observed that the collagen gels seeded with keloid fibroblasts suffered a bigger contraction. The model was considered efficient to test growth factors with the potential to modulate the remodeling phase of the scar, for example, the Transforming Growth Factor Beta (TGF beta). The analysis of the changing macroscopic gel area comparing the contraction generated by the normal fibroblasts after the treatment with TGF beta with the contraction in the gels with keloid\'s fibroblasts showed that they have the same behavior. The experimental model proved to be an useful tool to better understand the wound contraction and to test new drugs to modulate this phenomenon.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:22:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:28:45Z : No. of bitstreams: 1 000851207.pdf: 1059422 bytes, checksum: 3ef98dc609c2e964bafefa24cd2efdc7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A endometrose é uma alteração degenerativa das glândulas uterinas e do estroma circundante, caracterizada pelo arranjo periglandular de miofibroblastos e a deposição de matriz extracelular (ECM). O presente trabalho objetivou avaliar a expressão de colágeno tipo I, III e IV e α-actina de músculo liso (α-SMA) nas endometroses equinas, procurando esclarecer a participação dos miofibroblastos na progressão destes processos. Foram utilizadas 24 biópsias uterinas com diagnóstico de endometrose, recebidas pelo Serviço de Patologia Veterinária e de Reprodução Animal da FMVZ, UNESP, Botucatu, SP. Cortes histológicos foram submetidos às técnicas histoquímicas de Tricrômico de Masson, Picrosirius Red sob luz polarizada e Ácido Periódico de Schiff (PAS) e imuno-histoquímicas para os três tipos de colágeno citados e α-SMA. Ainda, traçou-se um paralelo entre a técnica de Picrosirius Red e a imunomarcação dos colágenos tipos I e III. A análise histológica revelou que as fibras de colágeno denso correspondem ao colágeno tipo I, predominantes nas endometroses inativa e inativa destrutiva. As fibras de colágeno frouxo correspondem ao colágeno tipo III, predominantes nas endometroses ativas e ativas destrutivas. Nestes mesmos processos, a membrana basal revelou espessamento, aparentemente não relacionado ao colágeno tipo IV, e uma maior imunomarcação de miofibroblastos periglandulares em relação às endometroses inativa e inativa destrutiva. Desta forma, nota-se que os miofibroblastos estão relacionados ao aumento na deposição de colágeno tipo III nos ninhos fibróticos ativos / Endometrosis is a degenerative change of the uterine glands and surrounding stroma, characterized by periglandular arrangement of myofibroblasts and deposition of extracellular matrix (ECM). The aim of this study was evaluate the expression of collagen type I, III and IV and α-smooth muscle actin (α-SMA) in equine endometroses, and investigate the role of myofibroblasts in the progression of these processes. A parallel was made with histochemical techniques of Masson's trichrome, Picrosirius Red under polarized light and Periodic Acid-Schiff (PAS). Twenty four uterine biopsies received by the Veterinary Pathology Service and Animal Reproduction of FMVZ, UNESP, Botucatu, SP, were diagnosed with endometrosis. Histological analysis revealed that the orange dense collagen fibers correspond to type I collagen, being prevalent in inactive and inactive destructive endometrosis. And the green loose collagen fibers correspond to type III collagen, and are predominant in active and active destructive endometrosis. In the same processes, a greater amount of periglandular myofibroblasts were observed in comparison to inactive and inactive destructive endometrosis. The presence of these cells in active processes are strongly related to an increased deposition of collagen type III in fibrotic nests. Regarding the basement membrane, the active destructive and active endometrosis shows thickening, apparently not related to an increase in expression of type IV collagen. The active destructive and inactive destructive endometrosis exhibited disruption areas in type IV collagen fibers. Thus, it is noted that the myofibroblasts are related to increased deposition of type III collagen in active fibrotic nests

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-30Bitstream added on 2014-06-13T18:41:44Z : No. of bitstreams: 1 pagnano_lo_dr_jabo.pdf: 626602 bytes, checksum: 91e708f2a8ad849761e7177151a3d66e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de cicatrização de uma fração de proteína extraída do látex da seringueira em diferentes concentrações (0,01% e 0,001%) associada a diferentes biomateriais (Fibracol plusÒ e ácido hialurônico a 1%). Utilizaram-se 36 coelhos albinos da raça Nova Zelândia Branco submetidos à realização de 4 feridas em cada orelha. Dividiu-se o experimento em etapas de acordo com a análise do período pós-operatório (3º, 7º, 14º e 21º dias), sendo utilizados 9 animais para cada etapa. Na primeira etapa (3º dia de pósoperatório), os animais foram numerados aleatoriamente de 1 a 9, sendo que em 3 animais, nas orelhas esquerdas, as feridas foram tratadas com solução salina (T1) e nas orelhas direitas, as feridas foram tratadas com membrana de Fibracol plus® + FrHb1 a 0,01% (T2). Em outros 3 animais, realizaram-se os mesmos procedimentos, diferenciando os tratamentos, onde nas feridas das orelhas esquerdas o tratamento foi com Fibracol plus® (T3) e nas feridas das orelhas direitas Fibracol plus® + FrHb1 a 0,001% (T4). Nos 3 animais restantes, seguiram-se os mesmos procedimentos, inserindo nas feridas das orelhas esquerdas ácido hialurônico a 1% + FrHb1 a 0,01% (T5) e nas feridas das orelhas direitas ácido hialurônico a 1% + FrHb1 a 0,001% (T6). Os animais foram sacrificados no 3º dia de pós-operatório e as feridas foram analisadas macroscopicamente e em seguida separadas para a análise histológica. Estes procedimentos foram repetidos para as etapas de 7, 14 e 21 dias de pós-operatório. Os segmentos de tecidos com as feridas foram fixados em solução de Bouin por 24 horas, e processados rotineiramente, para inclusão em paraplast e posterior avaliação histológica e morfométrica. A morfometria foi realizada por meio do sistema... / The aim of this study was to evaluate the potential for healing of a fraction of protein extracted from the latex of rubber trees in different concentrations (0.01% and 0.001%) associated with various biomaterials (Fibracol plus®1 and hyaluronic acid to 1%). There were used 36 New Zealand White rabbits underwent achievement of 4 wounds on each ear. The experiment was divided into stages according to the analysis of the postoperative period (3, 7, 14 and 21 days), and 9 animals used for each step. In the first stage (day 3 post-surgery), animals were randomly numbered from 1 to 9, with 3 animals in the left ear, the wounds were treated with saline (T1) and the right ear, the wounds were treated with membrane of Fibracol plus® + FrHb1 to 0.01% (T2). In 3 other animals, the same procedures were held, differing treatments, where the wounds of the left ear they were treated with Fibracol plus® (T3) and the wounds of the right ears Fibracol Plus® + FrHb1 to 0.001% (T4). In the 3 remaining animals, there was followed by the same procedures, including the ears wounds hyaluronic acid at 1% + FrHb1 to 0.01% (T5) and right ears wounds of hyaluronic acid 1% + FrHb1 a 0.001% (T6). The animals were sacrificed at 3 days postoperatively and the wounds were examined macroscopically and then separated for histological analysis. These procedures were repeated on the steps of 7, 14 and 21 days postoperatively. The segments of the injured tissues were fixed in Bouin solution for 24 hours and routinely processed for inclusion in paraplastic and subsequent histologic and morphometric evaluation. The morphometry was performed using the image analyzing system (Image Pro-PLUS2) and the evaluation of healing was done by enumeration of leukocytes and fibroblasts. The data were subjected to statistical analysis (ANOVA and Tukey test at 5%)... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-19Bitstream added on 2015-01-26T13:30:41Z : No. of bitstreams: 1 000793457.pdf: 4940625 bytes, checksum: 33d37f3e9d163f7bc90f3beb34d29c57 (MD5) / Introdução: A Engenharia de Tecidos consiste na regeneração de órgãos e tecidos, obtidos através da coleta de partes de órgãos ou tecidos do indivíduo, que, dissociados em células, são cultivadas sobre suportes biológicos ou sintéticos (scaffolds), tendo como principal premissa o reestabelecimento e recuperação da funcionalidade do tecido lesado ou perdido. Esta tecnologia, portanto, abre novos caminhos para gerar transplantes funcionais e vitais. Dentro da Engenharia Biomédica e de Biomateriais, o Laboratório de Engenharia Celular do Hemocentro de Botucatu possui, desde 2001, pesquisas na área de produção de curativos biológicos, que são aqueles que interagem de forma ativa nas diversas fases do processo cicatricial, nos vários tipos de feridas. Diante da realidade de que o tratamento das feridas crônicas englobam altos custos econômicos, sociais e humanos, comprometendo a vida dos indivíduos acometidos e da necessidade de se otimizar e minimizar o impacto negativo do descarte de hemocomponentes excedentes da prática transfusional, o desafio é buscar alternativas de scaffolds para Terapia Celular. Objetivos: Avaliar o desempenho de diferentes arcabouços biológicos como a cola de fibrina, gel de plaquetas e membrana de quitosana dopada com fatores de crescimento extraídos de plaquetas, para cultura de células. Material e Métodos: Foi coletado um fragmento de pele e um de gordura de cinco pacientes diferentes. Estes tecidos foram submetidos a protocolos de dissociação mecânica, enzimática e por explante, seguido de isolamento, semeadura e expansão das células obtidas: células-tronco mesenquimais, fibroblastos e queratinócitos. As células foram cultivadas até ao menos a quarta passagem, caracterizadas e separadas em dois grupos: testes pré-scaffold e pós-scaffold, que consistiu nas análises de imunofenotipagem, imunocitoquímica, dosagem de citocinas inflamatórias no sobrenadante de cultura, teste do ... / Introduction: Tissue engineering comprises in organ and proper tissue regeneration achieved by collecting small tissue fragments that are dissociated into cells and then cultivated into biological or synthetics scaffolds. The main characteristic of these constructs is their capacity to behave as their biological matrix counterparts, providing mechanical support and the required micro environment to the cells. This technology paves the way for the creation of functional and vital tissues for transplants. Within Biomedical Engineering and Biomaterials, the Cell Engineering Laboratory of the Botucatu Blood Transfusion Center has been investigating these topics since 2001, starting with the production of biological dressings. Biological dressings interact actively with the several phases of chronic wounds, which involves high economic, social and psychological costs, often condemning the patients quality of life. Considering this reality, the contribution of tissue engineering is to develop alternatives on cell therapy using scaffold technology. Aims: To assess the performance of different biological scaffolds such as fibrin glue, platelet gel and chitosan membrane for cell culture. Material and Methods: Five fragments of adipose tissue and skin were collected, dissociate with mechanical, enzymatic and explant techniques, and the resulting cells were seeded on tissue culture flasks, amplified and characterized using multiparameter techniques. Following characterization, these cells were cultivated into three different scaffolds made of fibrin glue, platelet gel and chitosan - which was performed in two distinct ways, on its natural form and incorporated with platelet-derived growth factors to analyze this interaction. Discussion and Results: cell cultures were amplified and cultivated making a good cell bank. However, keratinocytes were difficult to grow and the rest of experiments were unfeasible to drawn up. Immunocytochemistry analysis ...

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA12MA088.pdf: 670172 bytes, checksum: 978ec4d11d867f3e2959dae1534f76a9 (MD5) Previous issue date: 2012-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The viability evaluation of animal cells subjected to different cryopreservation strategies is important for studies in cell culture, application in animal cloning and the establishment and maintenance of gene banks. The aim of this study is optimize a method for cryopreservation of bovine somatic cells in different containers using different cryoprotectants. For this purpose, three experiments were conducted using bovine skin fibroblast cells obtained by ear biopsy explantation by ear biopsy of a female Flemish breed. In the first experiment the cells were cryopreserved in cryotubes at fixed concentration of 1x106 cells/mL and in three freezing culture medium (1) culture medium +10% DMSO, (2) culture medium + 10% propylene glycol, (3) culture medium + 10% ethylene glycol. In the second experiment the freezing was performed with the same solutions used in experiment 1, however, the cells were cryopreserved in 0.25 mL and 0.5 mL straws. In the third experiment cells in different concentrations, (0.33x106 cells/mL, 1x106 cells/mL, 3x106 cells/mL and 5x106 cells/mL) were cryopreserved in 0.5 mL straws with culture medium + 10% propylene glycol. In all experiments, the cells were thawed in waterbath at 37 oC for evaluation of cell survival by trypan blue method and by the cell growth curve after 72 h in culture, moreover, in the first experiment was carried out the population doubling time test (PDT). The data were analyzed by analysis of variance with pairwise comparisons between groups by the Tukey test, with significance level of 5%. In first experiment there was no significant difference between groups using different cryoprotectants and the time of cell division, estimated by PDT, ranged from 15.9 to 16.5 hours.In the second experiment no significant difference in the survival rate between groups was observed, regardless of the cryoprotectant used, and considering the 0.25 and 0.5 mL straws. In the growth curve, the survival performance of cells cryopreserved in 0.25 ml straws was statistically inferior to that frozen in 0.5 mL straws and cryovials. In this experiment all groups had significantly lower survival results campared to the control group. In the third experiment, the cell concentrations that presented a better survival rate after thawing were 0.33x106cells/ mL and 1x106 cells /mL. Based on the results obtained it follows that straws can be used for freezing cells and the straws of 0.5 mL showed results consistent with those obtained by cryotubes. Likewise the use of PG can be a viable alternative for the freezing somatic cells / A avaliação da viabilidade de células animais submetidas à criopreservação é importante para estudos em cultivo celular, aplicação em clonagem animal e para o estabelecimento e manutenção de bancos genéticos. O objetivo do trabalho é otimizar uma metodologia de criopreservação de células somáticas bovinas utilizando diferentes recipientes e crioprotetores. Para tanto, três experimentos foram conduzidos utilizando células fibroblásticas de origem cutânea foram obtidas por meio de biópsia auricular de uma fêmea da raça Flamenga. No primeiro experimento, as células foram criopreservadas em criotubos na concentração fixa de 1x106 células/mL em três soluções de congelamento (1) meio de cultivo +10% de DMSO; (2) meio de cultivo + 10% de Propileno glicol; (3) meio de cultivo + 10% de Etileno glicol. No segundo experimento, o congelamento foi realizado com as mesmas soluções crioprotetoras utilizadas no experimento um, porém as células foram criopreservadas em palhetas de 0,25 mL e 0,5 mL. No terceiro experimento, foram testadas diferentes concentrações celulares, (0,33x106 cel/mL, 1x106 cel/mL, 3x106 cel/mL e 5x106 cel/mL) que foram criopreservadas em palheta de 0,5 mL utilizando-se meio de cultivo + 10% propileno glicol. Em todos os experimentos, as células foram descongeladas em banho maria a 37 oC para avaliação da sobrevivência celular pelo método de azul de Tripan e avaliação da curva de crescimento celular após 72 h de cultivo, além disso, no primeiro experimento foi realizado o teste de population doubling time (PDT) e no segundo e terceiro experimento o grupo controle foi realizado com células criopreservadas em criotubo utilizando a solução de congelamento composta meio de cultivo +10% de DMSO. Os dados foram analisados através da análise de variância com comparações pareadas entre grupos pelo teste de Tukey, com nível de significância de 5%. No primeiro experimento, não houve diferença significativa entre os grupos utilizando diferentes crioprotetores e o tempo de divisão celular estimado pelo PDT variou de 15,9 a 16,5 horas. No segundo experimento, a taxa de sobrevivência pós descongelamento, considerando as palhetas de 0,25 e 0,5 mL, não apresentou diferença significativa entre os grupos, independente do crioprotetor utilizado. Já na curva de crescimento, a sobrevivência das células criopreservadas em palhetas de 0,25 mL apresentou um desempenho estatisticamente inferior às congeladas em palhetas de 0,5 mL e criotubos. Neste experimento todos os grupos apresentaram resultados de sobrevivência significativamente inferiores ao grupo controle. No terceiro experimento as concentrações celulares que apresentaram melhores resultados de sobrevivência após o descongelamento foram de 0,33x106 cel/mL e 1x106 cel/mL. Com base nos resultados obtidos conclui-se que é possível utilizar palhetas para o congelamento de células e que as palhetas de 0,5 mL apresentaram resultados compatíveis aos obtidos com criotubos. Da mesma forma o uso de PG pode ser uma alternativa viável para o congelamento de células somáticas