A organização de fibras de colágeno no leito de uma ferida é componente importante da cicatrização e contração da ferida, determinando em última instância a qualidade final da cicatriz. Neste estudo realizamos a implantação de modelo de biotecnologia constituído de géis de colágeno povoados por fibroblastos humanos, que foi utilizado como instrumento para a melhor compreensão dos fenômenos ainda pouco elucidados, envolvidos na contração de feridas. Utilizando fibroblastos procedentes de pele normal ou quelóides, observou-se maior contração dos géis povoados por fibroblastos oriundos de quelóide. O modelo implementado foi considerado eficiente para a avaliação da presença de moduladores da fase de remodelação da cicatriz, tais como o Fator de Crescimento Transformador Beta (TGF beta). A comparação entre a curva de contração gerada por fibroblastos oriudos de pele normal sob o efeito do TGF beta e a contração gerada por fibroblastos de quelóides, demonstra que as mesmas apresentam comportamento igual do ponto de vista estatístico. O modelo proposto demonstrou ser adequado para a melhor compreensão dos mecanismos responsáveis pela contração de feridas, bem como possui potencial na avaliação de novas drogas capazes de modular este fenômeno / An important component of tissue healing and wound contraction is the re-arrangement of ground collagen fibers, which can ultimately influence the final quality of scars. In this study we used a biotechnology experimental model with contracting collagen gels seeded with human fibroblasts in order to better understand the phenomena involved in wound contraction. We compared the contraction of the collagen gels using fibroblasts from normal skin and from keloids, and we observed that the collagen gels seeded with keloid fibroblasts suffered a bigger contraction. The model was considered efficient to test growth factors with the potential to modulate the remodeling phase of the scar, for example, the Transforming Growth Factor Beta (TGF beta). The analysis of the changing macroscopic gel area comparing the contraction generated by the normal fibroblasts after the treatment with TGF beta with the contraction in the gels with keloid\'s fibroblasts showed that they have the same behavior. The experimental model proved to be an useful tool to better understand the wound contraction and to test new drugs to modulate this phenomenon.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-08-25T14:25:58Z No. of bitstreams: 1 Ernesto Rodriguez-Salas.pdf: 2263672 bytes, checksum: e3402ae3eb8a78aa7240c1d83859157e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-25T14:25:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ernesto Rodriguez-Salas.pdf: 2263672 bytes, checksum: e3402ae3eb8a78aa7240c1d83859157e (MD5) Previous issue date: 2006-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Search for materials, methods and means of conservation of membranes and tissues has been accomplished either for preservation of anatomic pieces or for utilization in homologue and heterologue transplants. In the present work, a bibliographical review about materials and means of conservation of biological membranes utilized in surgery procedures was realized. Three experiments aimed at: (I) – Determine concentration of the antibiotics benzilpeniciline, sulphate of estreptomicine and anfotericine B in the environment of conservation ERS®-04-09-11-16-21; (II) – Characterize morphology and histopathology of the BPMs (III) – Evaluate biomechanical characteristics of BPMs conserved in the environment proposed. Initially, 10 BPMs were collected, which registered an average weight of 21g after processed. In order to determine concentration of peniciline, a dosage taking weight into account weight was used, whereas for sulphate of estreptomicine and anfotericine B, procedure used in cell cultivation was adapted. Final results indicated dosages of 2,0 mg/ml; 0,035 mg/ml e 0,030 mg/ml respectively. In experiment II – four samples were collected and sectioned in 10 fragments of 2 cm2, determining weight, size and thickness, according to treatments T-0 - In natura; T-30 -, T-60 e T-90, respectively at 30, 60 and 90 days after collecting. Morphometrical results demonstrated augmentation of thickness, size and weight of BPMs in the several timings in relation to in natura state and histopathological studies (optic and electronic microscopy) brought to evidence maintenance of BPMs structure, although an enlargement of spacing between collagen fibers took place. Fibroblasts presented varied degrees of vacuolization and necrosis at all timings. In the third experiment, same procedure of collecting and conservation as in experiment II were obeyed. Size of samples was of 13 cm x 20 cm for evaluation of thickness, maximum force, tension and expansion through computerized dynamometer EMIC. Taking all results into account, we come to the conclusion is the environment proposed is capable of maintaining the BPMs free of contaminants for a period of 90 days with the same morphological pattern and collagen fibers arrangement. The BPMs conserved in the environment and maintained under refrigeration temperature 12±2ºC can be used in surgery procedures in an ideal period of between 13 and 69 days given conservation of capacity of expasion and augmentation of maximum force and thickness. A reduction of tension to which BMP was submitted because of timing was also observed, which does not endanger use of BPMs in surgery procedures such as reconstitution of articular capsules, herniorafies, reparation surgeries of thick traumatisms with loss of conjunctive tissue, and so forth. / A busca de materiais, métodos e meios de conservação de membranas e tecidos vêm sendo realizada seja para preservação de peças anatômicas ou para uso nos transplantes homólogos e heterólogos. No presente trabalho foi realizada uma revisão bibliográfica sobre os materiais e meios de conservação de membranas biológicas utilizadas em procedimentos cirúrgicos. Três experimentos objetivaram: (I) - Determinar a concentração dos antibióticos benzilpenicilina, sulfato de estreptomicina e anfotericina B no meio de conservação ERS®04-09-11-16-21; (II) - Caracterizar a morfologia e histopatologia das MPBs (III) - Avaliar as características biomecânicas das MPBs, conservadas no meio proposto. Inicialmente, foram coletadas 10 MPBs, que após processadas, registraram peso médio de 21 g. Para determinação da concentração de penicilina, utilizou-se a dosagem atendendo ao peso, enquanto que para o sulfato de estreptomicina e anfotericina B, adaptou-se o procedimento utilizado em cultivo celular. Os resultados finais indicaram dosagens de 2,0 mg/ml; 0,035 mg/ml e 0,030 mg/ml nesta ordem respectivamente. No experimento II – quatro amostras foram coletadas e seccionadas em 10 fragmentos de 2 cm2, determinando-se peso, tamanho e espessura, segundo os tratamentos T-0 - In natura; T-30 -, T-60 e T-90, respectivamente aos 30, 60 e 90 dias da coleta. Os resultados morfofométricos demonstraram aumento de espessura, tamanho e peso das MPBs nos diversos tempos em relação ao estado in natura e estudos histopatológicos (microscopia óptica e eletrônica) evidenciaram a manutenção da estrutura das MPBs, apesar de haver um maior espaçamento entre as fibras colágenas. Os fibroblastos apresentaram graus variados de vacuolização e necrose em todos os tempos. No terceiro experimento, obedeceram-se aos mesmos procedimentos de coleta e conservação do experimento II. Já, o tamanho das amostras foi de 13 cm x 20 cm para avaliação da espessura, força máxima, tensão e alongamento por meio de dinamômetro computadorizado EMIC. Tendo em vista todos os resultados, conclui-se que o meio proposto é capaz de manter as MPBs livres de contaminantes por um de 90 dias com o mesmo padrão morfológico e arranjo das fibras colágenas. As MPBs conservadas no meio e mantidas em temperatura de refrigeração 12±2ºC podem ser utilizadas em procedimentos cirúrgicos num período ideal entre 13 e 69 dias dado pela conservação da capacidade de alongamento e pelo aumento da força máxima e espessura. Houve também uma redução da tensão a que foi submetida a MPB, em função do tempo, o que não compromete o uso das MPBs em procedimentos cirúrgicos como reconstituição de cápsulas articulares, herniorafias, cirurgia reparadora de extensos traumatismos com perda de tecido conjuntivo, entre outros.

Orientador: Ricardo Della Coletta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-17T00:49:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sobral_LaysMartin_D.pdf: 3033003 bytes, checksum: 6019edf717b2f1f1088e0f9584909707 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Miofibroblastos são células mesenquimais caracterizadas pela expressão da isoforma ? da actina de músculo liso (?-SMA) e pela secreção de proteínas da matriz extracelular, fatores de crescimento e proteases. Estas células desempenham um papel importante na reparação de feridas e em processos patológicos, incluindo fibroses e cânceres. Os objetivos deste estudo foram 1) analisar o papel do fator de crescimento de tecido conjuntivo bem como o efeito da superexpressão de Smad7 na transdiferenciação de miofibroblastos gengivais induzida pelo fator de crescimento transformante-?1 (TGF-?1), 2) isolar e caracterizar linhagens celulares de miofibroblastos do estroma de carcinomas espinocelulares (CEC) orais e comparar o potencial proliferativo e produção de metaloproteinases de matriz (MMP) com linhagens celulares de fibroblastos do estroma de CEC orais, e 3) analisar a influência de miofibroblastos na modulação da proliferação e invasão de linhagens celulares de CEC oral. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com TGF-?1 induziu simultaneamente a expressão de ?-SMA e CTGF e a neutralização de CTGF com RNA de interferência (siRNA) bloqueou o efeito de TGF-?1 na indução da transdiferenciação de células de gengiva normal em miofibroblastos. A superexpressão de Smad7 em células de GN inibiu a cascata de ativação de TGF-?1, caracterizada pela fosforilação de Smad2 e expressão de ?-SMA, CTGF e colágeno tipo I. Similarmente, miofibroblastos isolados do tecido gengival de fibromatose gengival hereditária (FGH) superexpressando Smad7 demonstraram níveis reduzidos de ?-SMA e pSmad2, além de baixos níveis de expressão de CTGF e colágeno tipo I. Três linhagens celulares de miofibroblastos foram isoladas do estroma de CEC de língua e caracterizadas pela expressão de ?-SMA e por níveis elevados de produção de colágeno tipo I. Embora o potencial proliferativo dos clones de fibroblastos e miofibroblastos tenham sido semelhantes, as produções de MMP-1, -2, -9 e -13 foram significantemente maiores em miofibroblastos. Finalmente, nós demonstramos que miofibroblastos do estroma tumoral produzem níveis elevados de alguns fatores de crescimento comparado com fibroblastos, incluindo ativina A. Meios de cultura condicionados por miofibroblastos contendo ativina A significantemente induziu a proliferação de linhagens celulares de CEC oral e uma maior progressão tumoral in vivo, enquanto que o bloqueio de ativina A por siRNA diminuiu significantemente a proliferação das células de CEC oral. In vitro, miofibroblastos induziram a invasão de linhagens celulares de CEC oral, o qual foi acompanhado por uma indução na produção de MMPs, e in vivo uma significante correlação entre presença de miofibroblastos e atividades de MMP-2 e MMP-9 foi observada. O bloqueio da síntese de ativina A por siRNA em miofibroblastos não alterou a capacidade de indução da invasão e síntese de MMPs. Os resultados deste estudo demonstram 1) que Smad7 bloqueia a transdiferenciação de miofibroblastos gengivais por meio da inibição da fosforilação de Smad2 e da transcrição de CTGF, 2) que miofibroblastos no estroma de CEC orais podem contribuir para um fenótipo mais invasivo via secreção de elevados níveis de MMPs e 3) que produtos de síntese dos miofibroblastos induzem a proliferação e invasão das células de CEC oral e os estímulos proliferativos são controlados pela produção de ativina A. / Abstract: Myofibroblasts are mesenchymal cells, characterized by the specific isoform ? of the smooth muscle actin (?-SMA) expression and the extracellular matrix proteins, growth factors and proteases secretion. These cells play a central role on wound healings and in pathologic process, including fibrosis and cancers. The aims of this study were 1) analyze the connective tissue growth factor (CTGF) role and the superexpression of Smad7 effect on TGF-?1-induced gingival myofibroblasts transdifferentiation, 2) isolate and characterize myofibroblast cell lines from oral squamous cell carcinomas stroma (OSCC) and compare the proliferative potential and matrix metalloproteinases (MMP) production with fibroblast cell lines from OSCCs stroma, and 3) analyze the myofibroblasts influence on the modulation of OSCC cell lines proliferation and invasion. Our results demonstrated that the TGF-?1 treatment induced simultaneously the ?-SMA and CTGF expression and the CTGF neutralization using the small interference RNA (siRNA) blocked the TGF-?1-induced gingival myofibroblasts transdifferentiation. Smad 7 superexpression in normal gingival cells (NG) inhibit the TGF-?1 cascade activation, characterized by the Smad2 phosphorilation and ?-SMA, CTGF and type I collagen expression. Similarly, hereditary gingival fibromatosis (HGF) myofibroblasts superexpressing Smad 7, demonstrated reduced levels of ?-SMA and phospho-Smad2, and low expression levels of CTGF and type I collagen. Three myofibroblast cell lines were isolated from tongue OSCC stroma and characterized by the ?-SMA expression and high levels of type I collagen. Although the proliferative potential of fibroblast and myofibroblast clones has been similar, the MMP-1, -2, -9 and -13 were significantly higher in myofibroblasts. Finally, we demonstrated that tumor stroma myofibroblasts produce high levels of some growth factors compared with fibroblasts, including activin A. Myofibroblasts conditioned medium containing activin A induce significantly the OSCC cell lines proliferation and a tumor progression in vivo, while the activin A dowregulation by siRNA significantly decreased the OSCC cells proliferation. In vitro, myofibroblasts induced OSCC cells invasion, accompanied by an induction of MMPs production, and in vivo was observed a significant correlation between the myofibroblasts presence and the MMP-2 and MMP-9 activity. The myofibroblasts dowregulation of activin A by siRNA did not affect the induction of invasion and MMPs synthesis. The results of this study demonstrate that 1) Smad 7 blockage the gingival myofibroblasts transdifferantiation through the inhibition of Smad 2 phosphorilation and CTGF transcription, 2) myofibroblasts on the OSCCs stroma can contribute to a more invasive phenotype via elevated levels of MMPs secretion, 3) myofibroblasts released products induce an OSCC cells proliferation and invasion and the proliferative stimulus are controlled by the activin A production. / Doutorado / Estomatologia / Doutor em Estomatopatologia

Orientador: Luciano Resende Ferreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-27T08:14:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MartelliJunior_Hercilio_M.pdf: 3416342 bytes, checksum: 1e4781599e6c56d26cf0a8c2c2bb6f6e (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Fibromatose Gengival Hereditária (FGH) representa uma condição oral incomum (1:750.000), caracterizada por um aumento gengival fibrótico generalizado. Manifesta-se como entidade clínica isolada ou como parte de síndromes, produzindo excessiva quantidade de colágeno e outras moléculas da matriz extra-celular. Hsp47 é uma chaperone residente no retículo endoplasmático (RE) que liga especificamente a moléculas de colágeno, enquanto Sec61 a representa uma proteína transmembrânica com ativa participação na condução de cadeias polipeptídicas nascentes para o lúmen do RE. Este trabalho descreve a participação das proteínas Hsp47 e Sec61? em culturas de fibroblastos provenientes de uma única família portadora de FGH e de pacientes com gengiva normal (GN) nos eventos de translação/translocação de colágeno tipo I. Ensaios de Western blot mostraram uma produção aumentada de Hsp47 em fibroblastos de FGH, comparado a fibroblastos de GN em condições de homeostasia e em situações de estresse térmico. Além disso, foi demonstrado produção de Sec61? nas linhagens celulares, FGH e GN, porém sem diferenças nos padrões de produção. A maior produção de Hsp47 pode estar envolvida na proteção da degradação intra reticular de colágeno, podendo ser um dos fatores responsáveis pela fibrose característica desta doença. Embora os mecanismos biológicos responsáveis pela FGH sejam ainda desconhecidos, o conhecimento da participação destas proteínas na regulação da biosíntese de colágeno pode ser importante para o entendimento de condições genéticas, como a FGH / Abstract: Study of the sinthesis of Hsp47 and Sec61??during the events of translacions/translocations of collagen type I in fibroblasts from hereditary gingival fibromatosis Hereditary Gingival Fibromatosis (HGF) represents an uncommon oral condition (l :750,000) characterized fibrous gingival enlargement. HGF can manifest as an isolated clinical entity or as part of a syndrome. The gingiva of patients with HGF produce excessive amount of collagen and other extracellular matrix. Hsp47 is an endoplasmic reticulun (ER) resident chaperone which binds specifically to collagen molecules, and Sec61? represents a transmembranous protein with active role in conducting of nascent polypeptide chain into the ER. This study describes the role of Hsp47 and Sec61? during the events of translationltranslocation of collagen type I in fibroblasts from patients with HGF and patients presenting normal gingiva (NG). Western blot assays demonstrated an increased production of Hsp47 in fibroblasts HGF as compared to NG cells under stress and unstressed conditions. In addition, Sec61? was evenly found in both cell types showing no marked variations in quantity in both stressed or unstressed situations. The more increased production of Hsp47 may related to a collagen degradation protective mechanism inside the ER. This can be one of the factors responsible for the fibrous features of HGF. Although the exact biological mechanisms involved in HGF are still unknown, the study of these ER proteins role in regulating collagen biosynthesis may be important for understanding hereditary conditions such as HGF / Mestrado / Mestre em Biologia e Patologia Buco-Dental

Orientadores: Ricardo Della Coletta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-08T10:13:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kellermann_MicheleGassen_M.pdf: 7081886 bytes, checksum: a59559c13daf66177d18ab7cb24bfbcf (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Miofibroblastos são caracterizados pela expressão de niveis elevados de fatores de crescimento, proteases e proteinas da matriz extracelular, que podem influenciar a progressão tumoral. Recentes estudos encontraram miofibroblastos no estroma de varios tipos de canceres humanos, incluindo os de mama, rim, figado, bexiga, colon e prostata, sendo a presença dos miofibroblastos frequentemente associada a um pior prognostico. Os objetivos deste estudo foram avaliar a presença dos miofibroblastos em amostras de mucosa oral normal, leucoplasias com o diagnostico histologico de displasia e 2 grupos de carcinomas espinocelulares (CEC) orais e correlacionar a presença destas celulas com as caracteristicas cronico-patologicas dos tumores. O primeiro grupo foi formado por leses exclusivamente de língua, enquanto que o segundo grupo foi composto por 38 CECs de várias localizações da cavidade oral. Adicionalmente, nós determinamos in vitro o efeito dos produtos da síntese das células de CEC oral sobre a transdiferenciação dos fibroblastos em miofibroblastos, bem como o efeito dos produtos de síntese dos miofibroblastos sobre a proliferação celular e atividade das metaloproteinases de matriz (MMP) nas linhagens celulares de CEC oral. A análise imunohistoquímica revelou a ausência dos miofibroblastos em amostras de mucosa oral normal e em lesões leucoplásicas com o diagnóstico histológico de displasia. Em contraste, miofibroblastos foram encontrados no estroma e/ou fronte invasivo de aproximadamente 60% das amostras de CEC oral. No primeiro grupo, a presença abundante dos miofibroblastos no estroma ou fronte invasivo do tumor correlacionou significantemente com o estádio clínico N, invasão linfática e vascular, presença de metástases histologicamente confirmadas em linfonodos e infiltração extra-capsular de metástases linfonodais. Presença abundante dos miofibroblastos foi também correlacionada com uma menor sobrevida global dos pacientes e com um maior potencial proliferativo das células tumorais. No segundo grupo de CECs orais, a presença abundante dos miofibroblastos correlacionou significantemente com o estádio clínico N, presença de células tumorais nas margens da peça cirúrgica e recorrência regional. Utilizando 4 linhagens celulares de CEC oral e 3 linhagens de fibroblastos de mucosa oral normal, nós demonstramos que as células tumorais induzem a transdiferenciação dos fibroblastos em miofibroblastos e que este evento é dependente da secreção de fator de crescimento transformante-β1 (TGF-β1) pelas células tumorais. Adicionalmente, nós demonstramos que os miofibroblastos secretam fatores que estimularam significantemente a proliferação celular e a produção de MMP-2 pelas linhagens celulares de CEC oral. Os resultados deste estudo sugerem que durante a progressão tumoral, as células neoplásicas secretam TGF-β1 que promove a transdiferenciação dos miofibroblastos, e por sua vez, miofibroblastos secretam fatores que induzem a proliferação celular e a produção de MMP-2 pelas células neoplásicas, favorecendo o crescimento e a invasão tumoral / Abstract: Myofibroblasts are characterized by the expression of elevated amounts of growth factors, proteases and extracellular matrix, which may influence the tumor progression. Recent studies have detected myofibroblasts in the stroma of several tumors, including those of breast, kidney, liver, bladder, colon and prostate, being the presence of those cells associated with a worse prognosis for the patient. The goals of this study were to evaluate the presence of myofibroblasts in samples of normal oral mucosa, pre-malignant leucoplakia, and 2 groups of squamous cell carcinomas (SCC), and to determine whether their presence is associated with clinicopathological features of the tumors. The first group was composed exclusively by tongue lesions, whereas the second group was formed by 38 SCCs of several sites of the oral cavity. We also investigated in vitro the mutual paracrine effects of tumor cells and myofibroblasts on fibroblast-myofibroblast transdifferentiation and tumor cell proliferation and production of matrix metalloproteinases (MMP). Immunohistochemical analysis showed the lack of myofibroblasts in the stroma of normal oral mucosa and pre-malignant oral leucoplakias. In contrast, ~60% of the SCCs contained myofibroblasts in the tumor stroma and/or deep invasive front of the tumor. In the first group, the abundant presence of myofibroblasts in the stroma or deep invasive front significantly correlated with N stage, vascular and lymphatic invasion, histopathologically confirmed lymph node metastasis, and extracapsular spread of lymph node metastasis. The abundant presence of myofibroblasts was also correlated with a shorter patientâ?¿s survival and the proliferative potential of the tumor cells. In the second group of oral SCCs, the abundant presence of myofibroblasts correlated significantly with N stage, presence of tumor cells at the surgical margins, and regional recurrence. Using 4 oral SCC cell lines and 3 primary oral normal fibroblasts (ONF) from buccal mucosa, we demonstrated that tumor cells induced transdifferentiation of ONFs to myofibroblasts via secretion of transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1). Additionally, we demonstrated that transdifferentiated myofibroblasts secreted factors that significantly stimulated the cellular proliferation and production of MMP-2 by the oral SCC cell lines. The results of this study suggest that during tumor invasion SCC-derived TGF-β1 promote fibroblast to myofibroblast transdifferentiation, and in turn, myofibroblasts synthesize factors that induce cellular proliferation and production of MMP-2 by the tumor cells, favoring tumor growth and invasion / Mestrado / Patologia / Mestre em Estomatopatologia

O presente trabalho tem como objetivo investigar a influência de materiais utilizados na prática odontológica (Single Bond, HEMA, Vitrebond, Ketac Molar e Dycal) na resposta inflamatória de fibroblastos cultivados de polpa dental humana de dentes permanentes em relação à expressão e produção de mediadores da inflamação. As culturas primárias de fibroblastos foram estabelecidas a partir do tecido pulpar de terceiros molares hígidos. Após a quarta passagem, os fibroblastos foram estimulados pelos materiais e pelos materiais seguidos por LPS de E. coli pelos tempos de 6 e 24 horas. Os testes utilizados foram: MTT, Trypan Blue, Análise de Griess, PCR quantitativo e ELISA. Os dados foram analisados estatisticamente aplicando-se o teste ANOVA a 1 critério e pós-teste de Tukey e ANOVA a 2 critérios e teste de correção de Bonferroni (p<0,05). Os materiais SB10 (Single Bond 1:100) e DY (Dycal) afetaram a viabilidade celular com diminuição do metabolismo. Os materiais SB1 (Single Bond 1:1.000), SB10 (Single Bond 1:100) e VB (Vitrebond) seguidos de LPS de E. coli diminuíram o metabolismo celular de maneira estatisticamente significativa. Os níveis de óxido nítrico produzidos foram diminuídos quando os fibroblastos foram estimulados pelo KM (Ketac Molar). A expressão gênica para pró-colágeno tipo I foi diminuída quando os fibroblastos foram estimulados pelos materiais SB10 (Single Bond 1:100), SB (Single Bond polimerizado) e DY (Dycal). Para o SDF-1_/CXCL12 houve um aumento da expressão para o grupo estimulado apenas por LPS de E. coli, SB10 (Single Bond 1:100) e DY (Dycal). Para o IL-6 notou-se uma diminuição significativa para o grupo estimulado por H1000 (HEMA 1000 nM) e um aumento para o grupo SB10 (Single Bond 1:100). A expressão gênica de IL- 8/CXCL8 diminuiu para os fibroblastos estimulados pelas três concentrações de HEMA e de Single Bond, VB (Vitrebond) e DY (Dycal) no período de 6 horas e houve um aumento para os materiais SB10 (Single Bond 1:100) e VB (Vitrebond) no período de 24 horas. Houve diminuição na secreção de SDF-1_/CXCL12 para as três concentrações de HEMA e DY (Dycal) e uma tendência de diminuição para os demais materiais testados. A produção de IL-6 foi aumentada para os materiais VB (Vitrebond) e KM (Ketac Molar). A produção de IL- 8/CXCL8 foi aumentada para SB1 (Single Bond 1:1.000), VB (Vitrebond) e KM (Ketac Molar) e diminuída para SB10 (Single Bond 1:100) e DY (Dycal). O Single Bond e o HEMA, em várias concentrações, diminuíram a expressão e produção de moléculas envolvidas no processo inflamatório e, por causa de seu efeito citotóxico, devem ser vistos com cautela quando em íntimo contato com o órgão pulpar. O hidróxido de cálcio causou intensa morte celular e não estimulou a produção dos mediadores da inflamação avaliados neste trabalho, mas esse evento parece ser fundamental para o processo de reparo do tecido pulpar e formação de barreira mineralizada. Os cimentos de ionômeros de vidro utilizados aumentaram a produção de quimiocinas relacionadas ao processo inflamatório, portanto, esses materiais, embora não tenham causado morte de grande número celular, devem ser utilizados com restrições. / The aim of the present study is to investigate the influence of dental materials (Single Bond, HEMA, Vitrebond, Ketac Molar e Dycal) in the inflammatory response of human dental pulp fibroblasts from permanent teeth in relation to inflammatory mediators expression. and production. Primary cultures were established from third molars pulp tissue. After the fourth passage, the fibroblasts were stimulated only by materials and also by the materials followed by LPS from E. coli for 6 and 24 hours. Data were statistically analyzed using Oneway ANOVA and Tukey post-test and Two-way ANOVA followed by Bonferroni post-test (p<0.05). SB10 (Single Bond 1: 100) and DY (Dycal) affected cell viability and consequently decreased cell metabolism. SB1 (Single Bond 1:1,000), SB10 (Single Bond 1:100) and VB (Vitrebond) followed by LPS E. coli decreased cell metabolism. Nitric oxide levels were reduced when fibroblasts were stimulated by KM (Ketac Molar). Pro-collagen type I expression was reduced when fibroblasts were stimulated by SB10 (Single Bond 1:100), SB (polymerized Single Bond) and DY (Dycal). SDF-1_/CXCL12 expression was increased for the group stimulated only by LPS from E. coli, SB10 (Single Bond 1:100) and DY (Dycal). IL-6 expression had a significant decrease in the group stimulated by H1000 (HEMA 1000 nM) and an increase for SB10 (Single Bond 1:100) group. The expression of IL-8/CXCL8 decreased when fibroblasts were stimulated by the three concentrations of HEMA and of Single Bond, VB (Vitrebond) and DY (Dycal) at 6 hours and increased for SB10 (Single Bond 1:100) and VB (Vitrebond) at 24 hours. There was decrease in SDF-1_/CXCL12 production for the three concentrations of HEMA and DY (Dycal) and a declining trend for the other materials tested. The production of IL-6 was increased by VB (Vitrebond) and KM (Ketac Molar). The production of IL-8/CXCL8 increased by SB1 (Single Bond 1:1,000), VB (Vitrebond) and KM (Ketac Molar) and decreased by SB10 (Single Bond 1:100) and DY (Dycal). Single Bond and HEMA, in different concentrations, decreased the production and the expression of molecules involved in the inflammatory process and, because of its cytotoxic, should be viewed with caution when in intimate contact with the pulp tissue. Calcium hydroxide caused intense cell death and did not stimulate the production of inflammatory mediators evaluated, but this event seems to be essential to the pulp tissue repair process and mineralized barrier formation. The glass ionomer cements used increased the production of chemokines related to the inflammatory process, therefore, these materials, although they have not caused death of many cells, must be used with restrictions.

A terapia de fotobiomodulação tem sido vastamente utilizada em cultura de fibroblastos com o objetivo de se verificar seu real efeito na cicatrização de feridas e de se estabelecer os melhores parâmetros de luz. Pacientes com síndrome de Down (SD) possuem alta prevalência da doença periodontal (DP) e importantes alterações imunológicas, as quais podem interferir no processo de cicatrização. O objetivo do presente estudo foi de avaliar os efeitos da utilização de Laser e LED em fibroblastos gengivais de pacientes com e sem SD (FSD e FGH, respectivamente), verificando a viabilidade celular e o processo In vitro de cicatrização de feridas. As células foram cultivadas em placas de 96 poços (1x103 célula/poço) e colocadas em estado de aquiescência (meio DMEM com 1% de soro fetal bovino) 24h antes da irradiação e retomando sua condição inicial de 10% de soro fetal bovino (SFB) instantes antes da aplicação de Laser (AlGaAs - 660nm e AlGaInP - 810nm) e LED (637 ±15nm) com exceção do controle negativo (C-) que continuou com 1% de SFB. Os grupos foram divididos em: C+ (sem irradiação, 10% SFB), C- (sem irradiação, 1% SFB), LIV5 (5 J/cm2 por 3s), LIV8 (8 J/cm2 por 5s), LV5 (5 J/cm2, por 3s), LV8 (8 J/cm2 por 5s), LED3 (0,03 J/cm2 por 3s) e LED5 (0,05J/cm2 por 5s). A potência utilizada foi a mesma tanto para o Laser como para o LED (40mW). A viabilidade celular foi avaliada através dos testes colorimétricos MTT e Cristal Violeta, nos períodos de 24,48,72 e 96h. O teste de cicatrização de feridas In vitro (placas de 24 poços) para avaliação da migração dos fibroblastos, foi nos períodos de 12, 24, 36 e 48h. A análise estatística foi realizada através do teste ANOVA de medidas repetidas complementado pelo teste de Tukey (p<0,05). Os grupos experimentais, em grande parte dos períodos, obtiveram melhor viabilidade celular em relação ao C+, com exceção do grupo LIV8 que apresentou crescimento celular próximo de zero, em todos os períodos. Para FSD os melhores resultados foram com LIV5, LED3 e LED5 (p<0,05), enquanto que para FGH, foi o LV5 (p>0,05). No ensaio de cicatrização de feridas os melhores resultados foram LIV5 para FGH (p<0,05) e todos os tratamentos com exceção do LIV8 para FSD (p<0,05). Os FSD apresentaram maior fechamento da ferida em relação ao FGH nos períodos de 24 e 36h (p<0,05). Como conclusão, a fotobiomodulação por Laser e LED mostrou ser efetiva para viabilidade celular, tanto para o FGH como para o FSD, com exceção do Laser infravermelho de maior densidade de energia e maior tempo de exposição (LIV8). Na migração celular, a fotobiomodulação foi efetiva no maior fechamento da ferida para os FSD. Logo, a terapia de fotobiomodulação por Laser e LED, com os parâmetros adequados, parecer ser um tratamento adjuvante promissor para pacientes com SD. / The photobiomodulation therapy has been widely used in fibroblast culture in order to verify its effects on wound healing and to establish the best parameters of light. Down\'s syndrome patients (DS) present high prevalence of periodontal disease (PD) and important immunological changes, which could interfere on the wound healing process. The aim of this study was to evaluate the Laser and LED effects on gingival fibroblasts cultures from patients with or without DS (FSD and FGH, respectively), through cell viability tests and in vitro wound healing test. Cells were grown in 96-well plates (1x103 cells / well) and then, put in a quiescence environment, (DMEM medium with 1% fetal bovine serum) for 24 hours before irradiation. After that an initial condition of 10% fetal bovine serum (FBS) was set before Laser (Red -AlGaAs - 660nm and Infrared - AlGaInP - 810nm) and LED (637 ± 15nm) application, with the exception of the negative control (C-) which still remained with 1% FBS. The groups were divided in: C+ (no irradiation, 10% FBS), C (no irradiation 1% FBS), LIV5 (5J/cm2 for 3s), LIV8 (8 J / cm2 for 5s), LV5 (5J/cm2 for 3s), LV8 (8J/cm2 for 5s), LED3 (0.03J/cm2 for 3 seconds) and LED5 (0,05J / cm2 for 5s). The power output was the same for both Laser and LED (40mW). Cell viability was evaluated through MTT and Crystal Violet colorimetric tests, in periods of 24,48,72 and 96h. The in vitro wound healing assay (24 well plates), measured the fibroblasts migration, during 12, 24, 36 and 48 hours. Statistical analysis was performed using repeated measures ANOVA complemented by Tukeys test (p <0.05). The experimental groups, in most periods, presented higher cell viability compared to C+, except for the LIV8 group that exhibited cell growth near to zero, in all periods. In relation to FSD, the best results were with LIV5, LED 3 and LED 5 (p<0.05), while to FGH, the LV5 presented higher viability (p<0.05). The best results for the wound healing test were LIV5 for FGH (p<0,05) and all groups but LIV8 for FSD (p<0,05). FSD cells presented higher wound closure in relation to FGH at 24 and 36h (p<0,05). In conclusion, the Laser and LED photobiomodulation was effective for cell growth, for both FGH and FSD cells, except for the infrared laser with higher energy density and longer exposure time (LIV8). Photobiomodulation was more effective for wound closure by FSD cells. Therefore, laser and LED photobiomodulation therapy, with appropriate parameters, seems to be a promising adjunctive treatment for patients with DS.

Orientador: Oslei Paes de Almeida / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-25T08:18:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DellaColetta_Ricardo_D.pdf: 6321143 bytes, checksum: fee6575189b6054e21beeaa54cc06f5a (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Fibromatose gengival hereditária (FGH) é uma condição rara caracterizada por um aumento gengival generalizado com crescimento lento e progressivo. Para elucidar algumas das características regulatórias que resultam nesta condição, quatro linhagens celulares de fibroblastos provenientes de indivíduos de uma mesma família com FGH foram isoladas e caracterizadas em relação ao comportamento prol proliferativo, produção, e expressão de colágeno e suas proteínas chaperones, expressão de MMPs e TIMPs e produção de citocinas. Fibroblastos de gengiva normal (GN) e FGH em condições de subconfluência celular apresentaram típicas características morfológicas, mas em condições de saturação da densidade, os fibroblastos de FGH apresentaram dimensões menores que as células controle. Cinco diferentes ensaios de proliferação celular mostraram que a relação de proliferação foi significantemente maior em fibroblastos de FGH. A produção e expressão de Hsp47 é também aumentada em fibroblastos de FGH em paralelo com o aumento na produção de colágeno. Em adição, a expressão de Hsp47 é regulada por estresse celular e pró-peptídeos correspondendo as regiões da porção N-terminal das cadeias 'alfa'1 (I). A produção de citocinas foi detectada por ELlSA utilizando anticorpos específicos para TGF-' beta '31, IL-6, IL-1 ' beta ' e TNF- 'alfa '. Em fibroblastos de FGH a produção de TGF-' beta ' 1 e IL-6 foi estatisticamente maior que em fibroblastos normais (p<0,013 e p< 0,0035 respectivamente), enquanto que IL-' beta ' 1 e TNF- 'alfa ' não foram detectadas em todos as linhagens celulares. A expressão e produção de MMP-1 e MMP-2, como revelada por RT -PCR e zimografia, foram significantemente menores em fibroblastos de FGH comparando com células de GN. Por outro lado, a expressão de TIMP-1 e TIMP-2 foi ligeiramente maior em fibroblastos de GN. A neutralização de TGF- ' beta ' 1 com anticorpos específicos elevou os níveis de expressão e produção de MMP-1 e dramaticamente reduziu os níveis de MMP-2, enquanto que os de níveis de TIMPs não foram alterados. Estes resultados sugerem que a pato gênese do aumento gengival de indivíduos com FGH é possivelmente resultado de uma associação de fatores incluindo alterado comportamento proliferativo, exacerbada síntese de colágeno e Hsp47, desregulação no balanço proteolítico e elevada produção de citocinas / Abstract: Characterization of cellular proliferation and expression of collagen and its molecular chaperones, cytokines and matrix metalloproteinases and its tissue inhibitors in gingival fibroblasts from pacients with hereditary gingival fibromatosis Hereditary gingival fibromatosis (HGF) is a rare oral condition characterized by a slow and progressive enlargement of the gingiva, involving both the maxillaand mandible. To further elucidate some of the regulatory features resulting in this condition, the culture characteristics of the four cell lines of gingival fibroblasts derived from patients of the some family with HGF were isolated and characterized on proliferation index, collagen and its molecular chaperones production and expression, MMPs and TIMPs expression, and cytokines production. HGF and normal gingiva (NG) fibroblasts in subcofluent culture densities showed typical morphologic characteristics, but in saturation density, HGF fibroblasts were shorter than NG cells. Five different cell proliferation assays showed that the cell proliferation rate was significantly higher in HGF fibroblasts. The production and expression of Hsp47 were significantly higher in HGF fibroblasts than in NG fibroblasts, along with increased producto?n of collagen. In addition, Hsp47 is coordinately regulated by stress and by feedback mechanism mediated by N-terminal procollagen propeptides corresponding to residues of a1 (I)-chains. The cytokines production was detected by ELlSA using specific antibodies for TGF-' beta ' 1 , IL-6, IL-1 ' beta ' and TNF- 'alfa '. In HGF fibroblasts, the production of TGF-' beta ' 1 and IL-6 was higher than fibroblasts from normal tissues (p<0.013 and p<0.0035 respectively), whereas IL-1' beta ' and TNF-'alfa ' were not detected in ali cell lines. RT-PCR and enzymographic analysis clearly demonstrated that the expression and production of MMP-1 and MMP-2 were significantly lower in fibroblasts from HGF than from NG. Interestingly, TIMP-1 and TIMP-2 expression from NG cells was shown to be slightly higher than those from HGF. The use of neutralizing antibodies to TGF-' beta ' 1 caused a slight increase in MMP-1 and a decrease in MMP-2 expression, whereas that no change TIMPs levels. These results suggest that the pathogenesis of gingival outgrowth in HGF patients is possibly resulted of a association of factors such as increased proliferative potential, altered synthesis of collagen and Hsp47, dysregulated proteolytic balance and increased cytokines production / Doutorado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Doutor em Odontologia

Muitas complicações do Diabetes Mellitus, dentre elas a deficiência na cicatrização de feridas, estão associadas à hiperglicemia crônica, que promove estresse oxidativo e glicação protéica aleatória. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos de elevada contração de glicose (ECG) sobre a migração, proliferação e morte de fibroblastos cultivados, e o potencial da terapia com laser em baixa intensidade (LILT) (660 e 780 nm; 40mW; 2, 5, 10 e 30J/cm2) na prevenção desses efeitos. A ECG reduziu a proliferação em cerca de 40%, reduziu a migração em 50% e aumentou a morte celular em 30%. A irradiação diária com LILT em 660nm e 10J/cm2 mostrou-se eficaz na prevenção desses efeitos sobre a proliferação e migração celular. A ECG tambem aumentou a produção de especies reativas de oxigênio pelas células, um efeito nao observado em células irradiadas com LILT. Dessa forma, pode-se sugerir que a terapia com LILT favorece a proliferação e migração de células cultivadas sob ECG, processos essenciais para a cicatrização, possivelmente através de um efeito antioxidante. / Diabetic complications, including wound healing deficiency, are usually associated to chronic hyperglycemia, which leads to oxidative stress and aleatory protein glycation. The aim of this study was to evaluate the effects of high glucose concentrations (HGC) on proliferation, migration and death of cultured fibroblasts, as well as the potential effect of low intensity laser therapy (LILT) (660 and 780 nm; 40mW; 2, 5, 10 and 30J/cm2) preventing these effects. HGC reduced cell proliferation in about 40%, cell migration in about 50% and increased cell death in 30%. Daily irradiation at 660nm and 10J/cm2 was efficient preventing the effects on cell proliferation and migration. HGC also increased the production of reactive oxygen species, an effect totally prevented by LILT. The results suggest that LILT favors cell proliferation and migration, processes very important for healing, possibly through an anti-oxidant effect.

Introdução: Várias evidências em estudos de animais knockout sugerem a efetiva participação dos genes Fgf9-Fgfr2 no processo de determinação testicular. Animais XY knockout para os genes Fgf9 e Fgfr2 apresentam reversão sexual como consequência da alteração na cascata de eventos masculinizantes nas gônadas fetais. Até o momento, mutações inativadoras dos genes FGF9-FGFR2 não foram descritas em pacientes 46, XY portadores de disgenesia gonadal. Objetivos: Pesquisar a presença de mutações inativadoras nos genes FGF9 e FGFR2 em pacientes portadores de DDS 46,XY por anormalidades do desenvolvimento gonadal. Casuística e Métodos: Trinta e três pacientes com disgenesia gonadal 46, XY, 11 com a forma completa e 22 com a forma parcial. As regiões codificadoras dos genes FGF9 e FGFR2 de todos os pacientes foram amplificadas e sequenciadas. As investigações quanto a presença de deleções foram realizadas usando-se a técnica de MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification). Resultados: Mutações ou deleções nos genes FGF9 não foram encontradas em nenhum dos pacientes estudados, apenas alguns polimorfismos previamente descritos. No gene FGFR2 não foram encontradas deleções. Uma nova variante não sinônima em heterozigose, c.1358 C>T (p.Ser453Leu), localizada no exon 10 do FGFR2 foi encontrada em duas irmãs com disgenesia gonadal parcial 46,XY. A mãe é portadora da variante alélica e o estudo de 147 indivíduos controles não identificou a presença desta variante. A análise da variante em sites de previsão, PolyPhen, SIFT e Mutation Taster indicou que a nova proteína FGFR2 é possivelmente danificada. Conclusões: Se esses resultados dos sites de previsão forem confirmados em estudos funcionais futuros a participação do gene FGFR2 na determinação gonadal masculina em humanos estará comprovada / Introduction: Several evidence in animal studies \"knockout\" suggest the effective participation of Fgf9-Fgfr2 genes in testicular determination process. Animals XY \"knockout\" for Fgf9 and Fgfr2 genes exhibit sex reversal as a result of the change in the cascade of masculinizing events in fetal gonads. To date, So far inactivating mutations of FGF9 and FGFR2 genes have not been described in 46,XY patients with gonadal dysgenesis. Objectives: To investigate the presence of inactivating mutations in the FGF9 and FGFR2 gene in patients with 46,XY DSD by gonadal abnormalities. Casuistic and Methods: Thirty-three patients with 46,XY gonadal dysgenesis, 11 with the full form and 22 with the partial form. The coding regions of FGF9 and FGFR2 genes of all patients were amplified and sequenced. Investigations on the presence of deletions were made using the MLPA technique (\"Multiplex ligation-dependent probe amplification\"). Results: Mutations or deletions in the FGF9 gene were not found in any of the patients studied, only a few polymorphisms previously described. FGFR2 gene deletions were not found. A new non-synonymous variant in heterozygosis, c.1358 C> T (p.Ser453Leu) located in exon 10 of FGFR2 was found in two sisters with 46,XY partial gonadal dysgenesis. The mother is a carrier of the variant allele and the study of 147 control subjects did not identify the presence of this variant. The analysis of the variant on prediction sites, \"PolyPhen\", \"SIFT\" and \"Mutation Taster\" indicated that the new FGFR2 protein is possibly damaged. Conclusions: If the results of the prediction sites are confirmed by future functional studies the participation of the FGFR2 gene in human male gonadal determination will be proven