Orientador: Ricardo Della Coletta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-17T00:49:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sobral_LaysMartin_D.pdf: 3033003 bytes, checksum: 6019edf717b2f1f1088e0f9584909707 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Miofibroblastos são células mesenquimais caracterizadas pela expressão da isoforma ? da actina de músculo liso (?-SMA) e pela secreção de proteínas da matriz extracelular, fatores de crescimento e proteases. Estas células desempenham um papel importante na reparação de feridas e em processos patológicos, incluindo fibroses e cânceres. Os objetivos deste estudo foram 1) analisar o papel do fator de crescimento de tecido conjuntivo bem como o efeito da superexpressão de Smad7 na transdiferenciação de miofibroblastos gengivais induzida pelo fator de crescimento transformante-?1 (TGF-?1), 2) isolar e caracterizar linhagens celulares de miofibroblastos do estroma de carcinomas espinocelulares (CEC) orais e comparar o potencial proliferativo e produção de metaloproteinases de matriz (MMP) com linhagens celulares de fibroblastos do estroma de CEC orais, e 3) analisar a influência de miofibroblastos na modulação da proliferação e invasão de linhagens celulares de CEC oral. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com TGF-?1 induziu simultaneamente a expressão de ?-SMA e CTGF e a neutralização de CTGF com RNA de interferência (siRNA) bloqueou o efeito de TGF-?1 na indução da transdiferenciação de células de gengiva normal em miofibroblastos. A superexpressão de Smad7 em células de GN inibiu a cascata de ativação de TGF-?1, caracterizada pela fosforilação de Smad2 e expressão de ?-SMA, CTGF e colágeno tipo I. Similarmente, miofibroblastos isolados do tecido gengival de fibromatose gengival hereditária (FGH) superexpressando Smad7 demonstraram níveis reduzidos de ?-SMA e pSmad2, além de baixos níveis de expressão de CTGF e colágeno tipo I. Três linhagens celulares de miofibroblastos foram isoladas do estroma de CEC de língua e caracterizadas pela expressão de ?-SMA e por níveis elevados de produção de colágeno tipo I. Embora o potencial proliferativo dos clones de fibroblastos e miofibroblastos tenham sido semelhantes, as produções de MMP-1, -2, -9 e -13 foram significantemente maiores em miofibroblastos. Finalmente, nós demonstramos que miofibroblastos do estroma tumoral produzem níveis elevados de alguns fatores de crescimento comparado com fibroblastos, incluindo ativina A. Meios de cultura condicionados por miofibroblastos contendo ativina A significantemente induziu a proliferação de linhagens celulares de CEC oral e uma maior progressão tumoral in vivo, enquanto que o bloqueio de ativina A por siRNA diminuiu significantemente a proliferação das células de CEC oral. In vitro, miofibroblastos induziram a invasão de linhagens celulares de CEC oral, o qual foi acompanhado por uma indução na produção de MMPs, e in vivo uma significante correlação entre presença de miofibroblastos e atividades de MMP-2 e MMP-9 foi observada. O bloqueio da síntese de ativina A por siRNA em miofibroblastos não alterou a capacidade de indução da invasão e síntese de MMPs. Os resultados deste estudo demonstram 1) que Smad7 bloqueia a transdiferenciação de miofibroblastos gengivais por meio da inibição da fosforilação de Smad2 e da transcrição de CTGF, 2) que miofibroblastos no estroma de CEC orais podem contribuir para um fenótipo mais invasivo via secreção de elevados níveis de MMPs e 3) que produtos de síntese dos miofibroblastos induzem a proliferação e invasão das células de CEC oral e os estímulos proliferativos são controlados pela produção de ativina A. / Abstract: Myofibroblasts are mesenchymal cells, characterized by the specific isoform ? of the smooth muscle actin (?-SMA) expression and the extracellular matrix proteins, growth factors and proteases secretion. These cells play a central role on wound healings and in pathologic process, including fibrosis and cancers. The aims of this study were 1) analyze the connective tissue growth factor (CTGF) role and the superexpression of Smad7 effect on TGF-?1-induced gingival myofibroblasts transdifferentiation, 2) isolate and characterize myofibroblast cell lines from oral squamous cell carcinomas stroma (OSCC) and compare the proliferative potential and matrix metalloproteinases (MMP) production with fibroblast cell lines from OSCCs stroma, and 3) analyze the myofibroblasts influence on the modulation of OSCC cell lines proliferation and invasion. Our results demonstrated that the TGF-?1 treatment induced simultaneously the ?-SMA and CTGF expression and the CTGF neutralization using the small interference RNA (siRNA) blocked the TGF-?1-induced gingival myofibroblasts transdifferentiation. Smad 7 superexpression in normal gingival cells (NG) inhibit the TGF-?1 cascade activation, characterized by the Smad2 phosphorilation and ?-SMA, CTGF and type I collagen expression. Similarly, hereditary gingival fibromatosis (HGF) myofibroblasts superexpressing Smad 7, demonstrated reduced levels of ?-SMA and phospho-Smad2, and low expression levels of CTGF and type I collagen. Three myofibroblast cell lines were isolated from tongue OSCC stroma and characterized by the ?-SMA expression and high levels of type I collagen. Although the proliferative potential of fibroblast and myofibroblast clones has been similar, the MMP-1, -2, -9 and -13 were significantly higher in myofibroblasts. Finally, we demonstrated that tumor stroma myofibroblasts produce high levels of some growth factors compared with fibroblasts, including activin A. Myofibroblasts conditioned medium containing activin A induce significantly the OSCC cell lines proliferation and a tumor progression in vivo, while the activin A dowregulation by siRNA significantly decreased the OSCC cells proliferation. In vitro, myofibroblasts induced OSCC cells invasion, accompanied by an induction of MMPs production, and in vivo was observed a significant correlation between the myofibroblasts presence and the MMP-2 and MMP-9 activity. The myofibroblasts dowregulation of activin A by siRNA did not affect the induction of invasion and MMPs synthesis. The results of this study demonstrate that 1) Smad 7 blockage the gingival myofibroblasts transdifferantiation through the inhibition of Smad 2 phosphorilation and CTGF transcription, 2) myofibroblasts on the OSCCs stroma can contribute to a more invasive phenotype via elevated levels of MMPs secretion, 3) myofibroblasts released products induce an OSCC cells proliferation and invasion and the proliferative stimulus are controlled by the activin A production. / Doutorado / Estomatologia / Doutor em Estomatopatologia

Orientador: Luciano Resende Ferreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-27T08:14:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MartelliJunior_Hercilio_M.pdf: 3416342 bytes, checksum: 1e4781599e6c56d26cf0a8c2c2bb6f6e (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Fibromatose Gengival Hereditária (FGH) representa uma condição oral incomum (1:750.000), caracterizada por um aumento gengival fibrótico generalizado. Manifesta-se como entidade clínica isolada ou como parte de síndromes, produzindo excessiva quantidade de colágeno e outras moléculas da matriz extra-celular. Hsp47 é uma chaperone residente no retículo endoplasmático (RE) que liga especificamente a moléculas de colágeno, enquanto Sec61 a representa uma proteína transmembrânica com ativa participação na condução de cadeias polipeptídicas nascentes para o lúmen do RE. Este trabalho descreve a participação das proteínas Hsp47 e Sec61? em culturas de fibroblastos provenientes de uma única família portadora de FGH e de pacientes com gengiva normal (GN) nos eventos de translação/translocação de colágeno tipo I. Ensaios de Western blot mostraram uma produção aumentada de Hsp47 em fibroblastos de FGH, comparado a fibroblastos de GN em condições de homeostasia e em situações de estresse térmico. Além disso, foi demonstrado produção de Sec61? nas linhagens celulares, FGH e GN, porém sem diferenças nos padrões de produção. A maior produção de Hsp47 pode estar envolvida na proteção da degradação intra reticular de colágeno, podendo ser um dos fatores responsáveis pela fibrose característica desta doença. Embora os mecanismos biológicos responsáveis pela FGH sejam ainda desconhecidos, o conhecimento da participação destas proteínas na regulação da biosíntese de colágeno pode ser importante para o entendimento de condições genéticas, como a FGH / Abstract: Study of the sinthesis of Hsp47 and Sec61??during the events of translacions/translocations of collagen type I in fibroblasts from hereditary gingival fibromatosis Hereditary Gingival Fibromatosis (HGF) represents an uncommon oral condition (l :750,000) characterized fibrous gingival enlargement. HGF can manifest as an isolated clinical entity or as part of a syndrome. The gingiva of patients with HGF produce excessive amount of collagen and other extracellular matrix. Hsp47 is an endoplasmic reticulun (ER) resident chaperone which binds specifically to collagen molecules, and Sec61? represents a transmembranous protein with active role in conducting of nascent polypeptide chain into the ER. This study describes the role of Hsp47 and Sec61? during the events of translationltranslocation of collagen type I in fibroblasts from patients with HGF and patients presenting normal gingiva (NG). Western blot assays demonstrated an increased production of Hsp47 in fibroblasts HGF as compared to NG cells under stress and unstressed conditions. In addition, Sec61? was evenly found in both cell types showing no marked variations in quantity in both stressed or unstressed situations. The more increased production of Hsp47 may related to a collagen degradation protective mechanism inside the ER. This can be one of the factors responsible for the fibrous features of HGF. Although the exact biological mechanisms involved in HGF are still unknown, the study of these ER proteins role in regulating collagen biosynthesis may be important for understanding hereditary conditions such as HGF / Mestrado / Mestre em Biologia e Patologia Buco-Dental

Orientador: Oslei Paes de Almeida / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-25T08:18:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DellaColetta_Ricardo_D.pdf: 6321143 bytes, checksum: fee6575189b6054e21beeaa54cc06f5a (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Fibromatose gengival hereditária (FGH) é uma condição rara caracterizada por um aumento gengival generalizado com crescimento lento e progressivo. Para elucidar algumas das características regulatórias que resultam nesta condição, quatro linhagens celulares de fibroblastos provenientes de indivíduos de uma mesma família com FGH foram isoladas e caracterizadas em relação ao comportamento prol proliferativo, produção, e expressão de colágeno e suas proteínas chaperones, expressão de MMPs e TIMPs e produção de citocinas. Fibroblastos de gengiva normal (GN) e FGH em condições de subconfluência celular apresentaram típicas características morfológicas, mas em condições de saturação da densidade, os fibroblastos de FGH apresentaram dimensões menores que as células controle. Cinco diferentes ensaios de proliferação celular mostraram que a relação de proliferação foi significantemente maior em fibroblastos de FGH. A produção e expressão de Hsp47 é também aumentada em fibroblastos de FGH em paralelo com o aumento na produção de colágeno. Em adição, a expressão de Hsp47 é regulada por estresse celular e pró-peptídeos correspondendo as regiões da porção N-terminal das cadeias 'alfa'1 (I). A produção de citocinas foi detectada por ELlSA utilizando anticorpos específicos para TGF-' beta '31, IL-6, IL-1 ' beta ' e TNF- 'alfa '. Em fibroblastos de FGH a produção de TGF-' beta ' 1 e IL-6 foi estatisticamente maior que em fibroblastos normais (p<0,013 e p< 0,0035 respectivamente), enquanto que IL-' beta ' 1 e TNF- 'alfa ' não foram detectadas em todos as linhagens celulares. A expressão e produção de MMP-1 e MMP-2, como revelada por RT -PCR e zimografia, foram significantemente menores em fibroblastos de FGH comparando com células de GN. Por outro lado, a expressão de TIMP-1 e TIMP-2 foi ligeiramente maior em fibroblastos de GN. A neutralização de TGF- ' beta ' 1 com anticorpos específicos elevou os níveis de expressão e produção de MMP-1 e dramaticamente reduziu os níveis de MMP-2, enquanto que os de níveis de TIMPs não foram alterados. Estes resultados sugerem que a pato gênese do aumento gengival de indivíduos com FGH é possivelmente resultado de uma associação de fatores incluindo alterado comportamento proliferativo, exacerbada síntese de colágeno e Hsp47, desregulação no balanço proteolítico e elevada produção de citocinas / Abstract: Characterization of cellular proliferation and expression of collagen and its molecular chaperones, cytokines and matrix metalloproteinases and its tissue inhibitors in gingival fibroblasts from pacients with hereditary gingival fibromatosis Hereditary gingival fibromatosis (HGF) is a rare oral condition characterized by a slow and progressive enlargement of the gingiva, involving both the maxillaand mandible. To further elucidate some of the regulatory features resulting in this condition, the culture characteristics of the four cell lines of gingival fibroblasts derived from patients of the some family with HGF were isolated and characterized on proliferation index, collagen and its molecular chaperones production and expression, MMPs and TIMPs expression, and cytokines production. HGF and normal gingiva (NG) fibroblasts in subcofluent culture densities showed typical morphologic characteristics, but in saturation density, HGF fibroblasts were shorter than NG cells. Five different cell proliferation assays showed that the cell proliferation rate was significantly higher in HGF fibroblasts. The production and expression of Hsp47 were significantly higher in HGF fibroblasts than in NG fibroblasts, along with increased producto?n of collagen. In addition, Hsp47 is coordinately regulated by stress and by feedback mechanism mediated by N-terminal procollagen propeptides corresponding to residues of a1 (I)-chains. The cytokines production was detected by ELlSA using specific antibodies for TGF-' beta ' 1 , IL-6, IL-1 ' beta ' and TNF- 'alfa '. In HGF fibroblasts, the production of TGF-' beta ' 1 and IL-6 was higher than fibroblasts from normal tissues (p<0.013 and p<0.0035 respectively), whereas IL-1' beta ' and TNF-'alfa ' were not detected in ali cell lines. RT-PCR and enzymographic analysis clearly demonstrated that the expression and production of MMP-1 and MMP-2 were significantly lower in fibroblasts from HGF than from NG. Interestingly, TIMP-1 and TIMP-2 expression from NG cells was shown to be slightly higher than those from HGF. The use of neutralizing antibodies to TGF-' beta ' 1 caused a slight increase in MMP-1 and a decrease in MMP-2 expression, whereas that no change TIMPs levels. These results suggest that the pathogenesis of gingival outgrowth in HGF patients is possibly resulted of a association of factors such as increased proliferative potential, altered synthesis of collagen and Hsp47, dysregulated proteolytic balance and increased cytokines production / Doutorado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Doutor em Odontologia

O objetivo do presente trabalho é analisar os componentes celulares e de fibras do tecido conjuntivo nas hiperplasias inflamatórias (HI), nos fibromas (F) e na fibromatose gengival hereditária (FGH), além de investigar a imunocompetência e efetuar análises moleculares de pacientes com FGH. Para atingir os objetivos foram desenvolvidos 4 artigos, com diferentes metodologias e universos amostrais. No 1º artigo, pretendeu-se estabelecer critérios microscópicos válidos para diferenciar F e HI. Foram avaliadas em microscópio óptico 136 lesões coradas pela Hematoxilina-eosina (HE) e pelo Tricrômico de Masson quanto às características microscópicas. Os resultados mostraram que uma área central de fibras colágenas dispostas de forma enovelada e mais densa, circundada por uma camada de fibras dispostas de forma paralela são características dos F, enquanto a presença de hiperplasia epitelial, infiltrado inflamatório e fibras colágenas organizadas de forma paralela são características das HI. Tais resultados motivaram o 2º artigo, no qual estudamos 18 lesões de F e 13 de HI, que foram preparadas histologicamente e coradas pelo picrosírius red e pelo direct blue para avaliação quantitativa das fibras colágenas e de fibras do sistema elástico, respectivamente, em microscopia a laser confocal. Os resultados confirmaram a disposição estrutural das fibras colágenas observada no 1º artigo, além de apontarem diferenças nas áreas ocupadas pelas fibras colágenas em todas as regiões estudadas. A fim de proceder a uma avaliação dos componentes fibroso e celular das 3 lesões fibrosas, foi desenvolvido o 3º artigo. Espécimes das 3 lesões foram estudados em microscopia ótica, a fim de avaliar suas populações de fibroblastos e de células inflamatórias e os seguintes componentes fibrosos do tecido conjuntivo: fibras colágenas, sistema de fibras elásticas, fibras reticulares e fibras oxitalânicas. Os resultados mostraram disposição e concentração diferente das fibras colágenas nas 3 lesões e uma maior concentração de fibras reticulares na FGH. A análise dos componentes celulares mostrou um maior número de fibroblastos no F e uma maior contagem de células inflamatórias na HI. A partir do encaminhamento de uma família com FGH, optouse por inclui-la no estudo, tendo em vista serem lesões do mesmo grupo. Com isso, foi desenvolvido um 4º estudo, que utilizou uma avaliação morfológica semelhante à dos 2 artigos anteriormente descritos. Dos pacientes com FGH foi obtido sangue periférico para avaliação da proliferação celular de linfócitos através do teste do MTT e para o sequenciamento do gene SOS-1. Os resultados mostraram hiperplasia epitelial na porção externa da gengiva dos pacientes com FGH, maior concentração de fibras colágenas e poucas células inflamatórias. Os 3 pacientes com FGH não mostraram diferenças no seu índice de proliferação de linfócitos em relação aos controles e não apresentaram a mutação descrita no gene SOS-1 de outras famílias com FGH. Pode se concluir que as 3 lesões apresentam estrutura conjuntiva diferente tanto no aspecto quantitativo quanto na disposição estrutural de seus componentes. / The objective of this study was to analyze the cellular and fibrous components of connective tissue in inflammatory hyperplasia (IH), oral fibroma (OF) and hereditary gingival fibromatosis (HGF), and to investigate the immunocompetence and to perform molecular analysis in HGF patients. To achieve the goals were developed 4 articles, with different methodologies and sample universes. In the 1st article, we intended to establish microscopic criteria to differentiate F and IH. The microscopic characteristics of the lesions (n=136) stained by hematoxylin-eosin (HE) and Masson trichrome were evaluated in an optical microscope. The results showed that a central area of wound collagen fibers and arranged in a higher density, surrounded by a layer of parallel fibers are characteristic of F, while the presence of epithelial hyperplasia, inflammatory infiltrate and parallel collagen fibers are characteristics of HI. These results led the 2nd article, which studied 18 F and 13 and IH, histologically prepared and stained by picrosírius red and direct blue for the direct quantitative assessment of collagen fibers and elastic fibers of the system, respectively, in the confocal laser microscope. The results confirmed the structural arrangement of collagen fibers found in Article 1, and indicate differences in the areas of collagen fibers in all regions studied. In order to evaluate the cellular and fibrous components of the 3 fibrous lesions, was developed the 3rd article. Specimens of the 3 lesions were studied in optical microscopy, to assess their populations of fibroblasts and inflammatory cells and the following components of fibrous connective tissue: collagen fibers, elastic fiber system, reticular fibers and oxytalan fibers. The results showed different arrangement and concentration of collagen fibers in the 3 lesions and a higher concentration of reticular fibers in HGF. The analysis of cellular components showed a greater number of fibroblasts in F and a higher count of inflammatory cells in IH. With the identification of a family with HGF, we chose to include it in the study because the lesions belong to the group of benign fibrous lesions. With that, it developed a 4th study, which used a similar morphologic evaluation of the 2 articles described above. Periferic blood was extracted from the HGF patients in order to determine the proliferative capacity of the peripheral lymphocytes, by the MTT test, and in order to sequence the SOS1 gene. The 3 HGF affected patients did not present the described mutation for the SOS1 gene, and the lymphocyte proliferative capacity in HGF patients was similar to those on controls. The results showed epithelial hyperplasia in the outer portion of the gingiva of patients with HGF, greater concentration of collagen fibers and few inflammatory cells. We can conclude that the 3 lesions present a different connective structure, considering both the quantitative aspect and the architectural disposition of their components.

O objetivo do presente trabalho é analisar os componentes celulares e de fibras do tecido conjuntivo nas hiperplasias inflamatórias (HI), nos fibromas (F) e na fibromatose gengival hereditária (FGH), além de investigar a imunocompetência e efetuar análises moleculares de pacientes com FGH. Para atingir os objetivos foram desenvolvidos 4 artigos, com diferentes metodologias e universos amostrais. No 1º artigo, pretendeu-se estabelecer critérios microscópicos válidos para diferenciar F e HI. Foram avaliadas em microscópio óptico 136 lesões coradas pela Hematoxilina-eosina (HE) e pelo Tricrômico de Masson quanto às características microscópicas. Os resultados mostraram que uma área central de fibras colágenas dispostas de forma enovelada e mais densa, circundada por uma camada de fibras dispostas de forma paralela são características dos F, enquanto a presença de hiperplasia epitelial, infiltrado inflamatório e fibras colágenas organizadas de forma paralela são características das HI. Tais resultados motivaram o 2º artigo, no qual estudamos 18 lesões de F e 13 de HI, que foram preparadas histologicamente e coradas pelo picrosírius red e pelo direct blue para avaliação quantitativa das fibras colágenas e de fibras do sistema elástico, respectivamente, em microscopia a laser confocal. Os resultados confirmaram a disposição estrutural das fibras colágenas observada no 1º artigo, além de apontarem diferenças nas áreas ocupadas pelas fibras colágenas em todas as regiões estudadas. A fim de proceder a uma avaliação dos componentes fibroso e celular das 3 lesões fibrosas, foi desenvolvido o 3º artigo. Espécimes das 3 lesões foram estudados em microscopia ótica, a fim de avaliar suas populações de fibroblastos e de células inflamatórias e os seguintes componentes fibrosos do tecido conjuntivo: fibras colágenas, sistema de fibras elásticas, fibras reticulares e fibras oxitalânicas. Os resultados mostraram disposição e concentração diferente das fibras colágenas nas 3 lesões e uma maior concentração de fibras reticulares na FGH. A análise dos componentes celulares mostrou um maior número de fibroblastos no F e uma maior contagem de células inflamatórias na HI. A partir do encaminhamento de uma família com FGH, optouse por inclui-la no estudo, tendo em vista serem lesões do mesmo grupo. Com isso, foi desenvolvido um 4º estudo, que utilizou uma avaliação morfológica semelhante à dos 2 artigos anteriormente descritos. Dos pacientes com FGH foi obtido sangue periférico para avaliação da proliferação celular de linfócitos através do teste do MTT e para o sequenciamento do gene SOS-1. Os resultados mostraram hiperplasia epitelial na porção externa da gengiva dos pacientes com FGH, maior concentração de fibras colágenas e poucas células inflamatórias. Os 3 pacientes com FGH não mostraram diferenças no seu índice de proliferação de linfócitos em relação aos controles e não apresentaram a mutação descrita no gene SOS-1 de outras famílias com FGH. Pode se concluir que as 3 lesões apresentam estrutura conjuntiva diferente tanto no aspecto quantitativo quanto na disposição estrutural de seus componentes. / The objective of this study was to analyze the cellular and fibrous components of connective tissue in inflammatory hyperplasia (IH), oral fibroma (OF) and hereditary gingival fibromatosis (HGF), and to investigate the immunocompetence and to perform molecular analysis in HGF patients. To achieve the goals were developed 4 articles, with different methodologies and sample universes. In the 1st article, we intended to establish microscopic criteria to differentiate F and IH. The microscopic characteristics of the lesions (n=136) stained by hematoxylin-eosin (HE) and Masson trichrome were evaluated in an optical microscope. The results showed that a central area of wound collagen fibers and arranged in a higher density, surrounded by a layer of parallel fibers are characteristic of F, while the presence of epithelial hyperplasia, inflammatory infiltrate and parallel collagen fibers are characteristics of HI. These results led the 2nd article, which studied 18 F and 13 and IH, histologically prepared and stained by picrosírius red and direct blue for the direct quantitative assessment of collagen fibers and elastic fibers of the system, respectively, in the confocal laser microscope. The results confirmed the structural arrangement of collagen fibers found in Article 1, and indicate differences in the areas of collagen fibers in all regions studied. In order to evaluate the cellular and fibrous components of the 3 fibrous lesions, was developed the 3rd article. Specimens of the 3 lesions were studied in optical microscopy, to assess their populations of fibroblasts and inflammatory cells and the following components of fibrous connective tissue: collagen fibers, elastic fiber system, reticular fibers and oxytalan fibers. The results showed different arrangement and concentration of collagen fibers in the 3 lesions and a higher concentration of reticular fibers in HGF. The analysis of cellular components showed a greater number of fibroblasts in F and a higher count of inflammatory cells in IH. With the identification of a family with HGF, we chose to include it in the study because the lesions belong to the group of benign fibrous lesions. With that, it developed a 4th study, which used a similar morphologic evaluation of the 2 articles described above. Periferic blood was extracted from the HGF patients in order to determine the proliferative capacity of the peripheral lymphocytes, by the MTT test, and in order to sequence the SOS1 gene. The 3 HGF affected patients did not present the described mutation for the SOS1 gene, and the lymphocyte proliferative capacity in HGF patients was similar to those on controls. The results showed epithelial hyperplasia in the outer portion of the gingiva of patients with HGF, greater concentration of collagen fibers and few inflammatory cells. We can conclude that the 3 lesions present a different connective structure, considering both the quantitative aspect and the architectural disposition of their components.

O objetivo do presente trabalho é analisar os componentes celulares e de fibras do tecido conjuntivo nas hiperplasias inflamatórias (HI), nos fibromas (F) e na fibromatose gengival hereditária (FGH), além de investigar a imunocompetência e efetuar análises moleculares de pacientes com FGH. Para atingir os objetivos foram desenvolvidos 4 artigos, com diferentes metodologias e universos amostrais. No 1º artigo, pretendeu-se estabelecer critérios microscópicos válidos para diferenciar F e HI. Foram avaliadas em microscópio óptico 136 lesões coradas pela Hematoxilina-eosina (HE) e pelo Tricrômico de Masson quanto às características microscópicas. Os resultados mostraram que uma área central de fibras colágenas dispostas de forma enovelada e mais densa, circundada por uma camada de fibras dispostas de forma paralela são características dos F, enquanto a presença de hiperplasia epitelial, infiltrado inflamatório e fibras colágenas organizadas de forma paralela são características das HI. Tais resultados motivaram o 2º artigo, no qual estudamos 18 lesões de F e 13 de HI, que foram preparadas histologicamente e coradas pelo picrosírius red e pelo direct blue para avaliação quantitativa das fibras colágenas e de fibras do sistema elástico, respectivamente, em microscopia a laser confocal. Os resultados confirmaram a disposição estrutural das fibras colágenas observada no 1º artigo, além de apontarem diferenças nas áreas ocupadas pelas fibras colágenas em todas as regiões estudadas. A fim de proceder a uma avaliação dos componentes fibroso e celular das 3 lesões fibrosas, foi desenvolvido o 3º artigo. Espécimes das 3 lesões foram estudados em microscopia ótica, a fim de avaliar suas populações de fibroblastos e de células inflamatórias e os seguintes componentes fibrosos do tecido conjuntivo: fibras colágenas, sistema de fibras elásticas, fibras reticulares e fibras oxitalânicas. Os resultados mostraram disposição e concentração diferente das fibras colágenas nas 3 lesões e uma maior concentração de fibras reticulares na FGH. A análise dos componentes celulares mostrou um maior número de fibroblastos no F e uma maior contagem de células inflamatórias na HI. A partir do encaminhamento de uma família com FGH, optouse por inclui-la no estudo, tendo em vista serem lesões do mesmo grupo. Com isso, foi desenvolvido um 4º estudo, que utilizou uma avaliação morfológica semelhante à dos 2 artigos anteriormente descritos. Dos pacientes com FGH foi obtido sangue periférico para avaliação da proliferação celular de linfócitos através do teste do MTT e para o sequenciamento do gene SOS-1. Os resultados mostraram hiperplasia epitelial na porção externa da gengiva dos pacientes com FGH, maior concentração de fibras colágenas e poucas células inflamatórias. Os 3 pacientes com FGH não mostraram diferenças no seu índice de proliferação de linfócitos em relação aos controles e não apresentaram a mutação descrita no gene SOS-1 de outras famílias com FGH. Pode se concluir que as 3 lesões apresentam estrutura conjuntiva diferente tanto no aspecto quantitativo quanto na disposição estrutural de seus componentes. / The objective of this study was to analyze the cellular and fibrous components of connective tissue in inflammatory hyperplasia (IH), oral fibroma (OF) and hereditary gingival fibromatosis (HGF), and to investigate the immunocompetence and to perform molecular analysis in HGF patients. To achieve the goals were developed 4 articles, with different methodologies and sample universes. In the 1st article, we intended to establish microscopic criteria to differentiate F and IH. The microscopic characteristics of the lesions (n=136) stained by hematoxylin-eosin (HE) and Masson trichrome were evaluated in an optical microscope. The results showed that a central area of wound collagen fibers and arranged in a higher density, surrounded by a layer of parallel fibers are characteristic of F, while the presence of epithelial hyperplasia, inflammatory infiltrate and parallel collagen fibers are characteristics of HI. These results led the 2nd article, which studied 18 F and 13 and IH, histologically prepared and stained by picrosírius red and direct blue for the direct quantitative assessment of collagen fibers and elastic fibers of the system, respectively, in the confocal laser microscope. The results confirmed the structural arrangement of collagen fibers found in Article 1, and indicate differences in the areas of collagen fibers in all regions studied. In order to evaluate the cellular and fibrous components of the 3 fibrous lesions, was developed the 3rd article. Specimens of the 3 lesions were studied in optical microscopy, to assess their populations of fibroblasts and inflammatory cells and the following components of fibrous connective tissue: collagen fibers, elastic fiber system, reticular fibers and oxytalan fibers. The results showed different arrangement and concentration of collagen fibers in the 3 lesions and a higher concentration of reticular fibers in HGF. The analysis of cellular components showed a greater number of fibroblasts in F and a higher count of inflammatory cells in IH. With the identification of a family with HGF, we chose to include it in the study because the lesions belong to the group of benign fibrous lesions. With that, it developed a 4th study, which used a similar morphologic evaluation of the 2 articles described above. Periferic blood was extracted from the HGF patients in order to determine the proliferative capacity of the peripheral lymphocytes, by the MTT test, and in order to sequence the SOS1 gene. The 3 HGF affected patients did not present the described mutation for the SOS1 gene, and the lymphocyte proliferative capacity in HGF patients was similar to those on controls. The results showed epithelial hyperplasia in the outer portion of the gingiva of patients with HGF, greater concentration of collagen fibers and few inflammatory cells. We can conclude that the 3 lesions present a different connective structure, considering both the quantitative aspect and the architectural disposition of their components.

Orientador: Ricardo Della Coletta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-09T19:23:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sobral_LaysMartin_M.pdf: 14271407 bytes, checksum: 448e55c30e66d3c36643955fe6ab0225 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Miofibroblastos são células especializadas que exercem funções importantes em processos fibróticos através da síntese elevada de macromoléculas da matriz extracelular, proteases e citocinas. O exato mecanismo do surgimento (transdiferenciação) dos miofibroblastos permanece desconhecido, porém inúmeros estudos sugerem que o fator de crescimento transformante-'beta'1 (TGF-'beta'1) exerça um papel importante neste processo via ativação do fator de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF). Em oposição aos efeitos de TGF-'beta'1, algumas citocinas inflamatórias, incluindo interferon 'gama' (IFN'gama'), parecem inibir a transdiferenciação dos miofibroblastos. O uso da droga imunossupressora ciclosporina A (CsA) é freqüentemente associada a inúmeros efeitos colaterais, sendo o aumento gengival fibrótico o de maior interesse para a área odontológica. Linhagens celulares de fibroblastos de gengiva normal tratadas com CsA expressam níveis elevados de TGF-'gama'1 e colágeno, que são intrínsecos do fenótipo miofibroblástico. Os objetivos deste estudo foram compreender a participação de TGF-'beta'1 e IFN'gama' na transdiferenciação dos fibroblastos gengivais em miofibroblastos e entender os mecanismos de ação destes fatores neste processo. Adicionalmente, nós verificamos a presença de miofibroblastos em aumentos gengivais induzidos por CsA. Nossos resultados demonstraram, através de 4 diferentes ensaios: transcriptase reversa-reação em cadeia da polimerase (RTPCR), western blot, imunofluorescência e citometria de fluxo, que TGF-'beta'1 induz e FNg bloqueia a transdiferenciação dos fibroblastos gengivais em miofibroblastos metabolicamente ativos em uma maneira dependente da dose e tempo. Nas células onde a expressão de CTGF foi significantemente reduzida por seqüências específicas de RNA de interferência, TGF-'beta'1 não foi capaz de promover a transdiferenciação dos miofibroblastos, revelando que TGF-'beta'1 é dependente da ativação de CTGF para induzir a transdiferenciação dos fibroblastos gengivais em miofibroblastos. IFN'gama' bloqueou a transdiferenciação dos miofibroblastos por estimular a expressão de Smad 7, uma proteína que regula negativamente a atividade de TGF-'beta'1. Interessantemente, miofibroblastos não foram associados aos aumentos gengivais induzidos por CsA, como revelado pelos modelos in vivo de injeções diárias de CsA em ratos Wistar e in vitro de tratamento de fibroblastos gengivais com CsA. Embora CsA tenha induzido a expressão de TGF-'beta'1, não demonstrou nenhum efeito na modulação dos níveis de CTGF. Nossos resultados demonstram que a indução da transdiferenciação dos miofibroblastos por TGF-'beta'1 é dependente da estimulação de CTGF. Adicionalmente, este estudo sugere que IFN'gama' pode ser clinicamente efetivo no tratamento de alterações fibróticas associadas à presença de miofibroblastos, pois atenua a excessiva produção de colágeno tipo I por estas células / Abstract: Myofibroblasts are the main cellular type involved in extracellular matrix deposition in fibrotic diseases. Relatively little is known about the underlying mechanisms that regulate myofibroblast emergence (transdifferentiation), however the regulatory cytokine transforming growth factor-beta 1 (TGF-'beta'1) has been traditionally considered an inducer of the myofibroblastic phenotype via activation of connective tissue growth factor (CTGF)-dependent pathway. Some inflammatory cytokines, particularly interferon g (IFN'gama'), show opposite effects to TGF-'beta'1, inhibiting myofibroblast transdifferentiation. Cyclosporin A (CsA) is a widely used immunosuppressant drug that causes significant side effects such as gingival overgrowth. Normal gingival fibroblast cell lines treated with CsA express high levels of TGF-'beta'1 and collagen, which are intrinsic of myofibroblasts. In the present study we examined whether TGF-'beta'1 and IFN'gama' can modulate transdifferentiation of gingival fibroblasts into myofibroblasts, and the biologic mechanisms behind those factors in this process. Additionally, we have analyzed the presence of myofibroblasts in CsA-induced gingival overgrowth. Our results demonstrated throughout a modality of experiments that included reverse trancriptasepolymerase chain reaction (RT-PCR), western blot, immunofluorescence and flow citometry analysis, that TGF-'beta'1 induces and IFN'gama' blocks fibroblast-myofibroblast transdifferentiation in a dose- and time-dependent manner. In fibroblasts with CTGF levels know-down by specific small interference RNA, TGF-'beta'1 effect on transdifferentiation was significantly reduced, revealing that CTGF plays a crucial role in mediating TGF-'beta'1 myofibroblast transdifferentiation. IFN'gama' blocked myofibroblast transdifferentiation by stimulating Smad 7 levels, a protein that negatively regulates TGF-'beta'1 signaling. Interestingly, myofibroblasts were not found in CsA-induced gingival overgrowth, as revealed by the in vivo model of daily injections of CsA in Wistar rats and by the in vitro model of gingival fibroblast cultures treated with CsA. Although CsA treatment stimulated TGF-'beta'1 expression by NG fibroblasts, it lacked to induce CTGF levels. Our results demonstrate that TGF-'beta'1 induction of transdifferentiation of gingival fibroblasts to myofibroblasts occurs via a CTGF dependent pathway. Additionally, this study suggests that IFN'gama' may be clinically effective in the treatment of fibrotic diseases associate with myofibroblast / Mestrado / Patologia / Mestre em Estomatopatologia