<p>In this thesis, we have firstly cloned and expressed the domains that harbours the putative catalytic GC domain in these receptor molecules and demonstrate that these molecules can convert GTP to cGMP in vitro. Secondly, we show that exogenous application of both Phytosulfokine and Brassinosteroid increase changes of intracellular cGMP levels in Arabidopsis mesophyll protoplast demonstrating that these molecules have GC activity in vivo and therefore provide a link as second messenger between the hormones and down-stream responses. In order to elucidate a relationship between the kinase and GC domains of the PSK receptor, we have used the AtPSKR1 receptor as a model and show that it has Serine/Threonine kinase activity using the Ser/Thr peptide 1 as a substrate. In addition, we show that the receptor`s ability to phosphorylate a substrate is affected by the product (cGMP) of its co-domain (GC) and that the receptor autophosphorylates on serine residues and this step was also observed to be affected by cGMP. When Arabidopsis plants are treated with a cell permeable analogue of cGMP, we note that this can affect changes in the phosphoproteome in Arabidopsis and conclude therefore that the cGMP plays a role in kinase-dependent downstream signalling. The obtained results suggest that the receptor molecules investigated here belong to a novel class of GCs that contains both a cytosolic kinase and GC domains, and thus have a domain organisation that is not dissimilar to that of atrial natriuretic peptide receptors NPR1 and NPR2. The findings also strongly suggest that cGMP has a role as a second messenger in both Brassinosteroid and Phytosulfokine signalling. We speculate that other proteins with similar domain organisations may also have dual catalytic activities and that a significant number of GCs, both in plants and animals, remain to be discovered and characterised.</p>

In Arabidopsis, the mucilage secretory cells (MSC) of the seed coat produce a pectinaceous mucilage. Very little is known about which genes are involved in the synthesis of pectins. A reverse genetic approach was used to identify genes involved in mucilage synthesis. A publicly available microarray database was screened with expression visualization tools, and was complemented by in-lab microarray experiments between wild type and known MSC mutants to identify candidate cell wall genes highly expressed at the time of mucilage synthesis. Several cell wall genes were also chosen based on their putative functions which would implicate them in mucilage synthesis. Phenotyping of mutant lines obtained for the cell wall candidate genes revealed no abnormal mucilage phentoypes in single or select double mutant lines. These results indicate that significant genetic redundancy exists in cell wall genes and/or the genes studied do not play significant roles in mucilage synthesis.

This project was designed to investigate the impact of natural levels of ultraviolet-B radiation on the genomic mutation rate in Arabidopsis thaliana. UV-B radiation is a known mutagen, but plants may have evolved mechanisms to cope with any genomic damage induced by routine exposure to this radiation. In an attempt to determine whether the genomic mutation rate in a plant species is elevated in the presence of UV-B, two eleven generation mutation accumulation studies were preformed. One study incorporated levels of UV-B similar to that encountered on a clear mid-summer's day, while the other was performed in the absence of this mutagen. Mutation rate estimates, obtained primarily from maximum likelihood analysis of phenotypic data, were not significantly greater than zero, both in the presence and absence of UV-B. No evidence was found to support the notion that the genomic mutation rate is increased by exposure to natural levels of UV-B.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2006. / Vita. Includes bibliographical references (p. 64-73).

Les tissus vasculaires sont d’une grande importance pour la physiologie et le développement de la plante. Le xylème et le phloème composent ce tissu. En assurant le transport des sèves brutes et élaborées, ils permettent ainsi de redistribuer minéraux et métabolites entre les différents organes de la plante. La régulation de la mise en place de ces deux tissus est hautement contrôlée tant d’un point de vue génétique que spatio-temporel. Parmi les gènes impliqués dans la mise en place des tissus vasculaires, le gène OCTOPUS (OPS) intervient très précocement au cours du développement dans la mise en place du patron vasculaire ainsi que différenciation du phloème(Bauby et al., 2007; Truernit et al., 2012). OPS appartient à une famille de gènes spécifiques des plantes supérieures. Cependant la fonction moléculaire de la protéine OPS reste inconnue. Une combinaison d’approches physiologique, biochimique, moléculaire, cytologique et génétique a permis de montrer que le gène OPS est un nouveau régulateur positif de la voie signalisation des brassinostéroïdes (BR). Les BR sont des hormones végétales impliquées dans de nombreux processus développementaux incluant l’élongation cellulaire ou encore l’organisation des tissus vasculaires. Bien que la découverte des BR date seulement de 1970 (Mitchell et al., 1970; Mitchell and Gregory,1972; Grove et al., 1979), l’intérêt commun que les scientifiques lui ont porté fait que sa voie de signalisation est aujourd’hui très détaillée. Parmi les composants de la voie des BR, la protéine kinase BIN2 en est le régulateur clef (Li et al., 2001) réprimant la voie par son action sur les facteurs de transcription BES1 et BZR1(Yin et al., 2002; Wang et al., 2002). OPS interagit physiquement avec la protéine BIN2 au niveau de la membrane plasmique, pouvant créer une inhibition par délocalisation de la protéine BIN2 de son site d’activité. A ce titre, les défauts de phloème observés chez le mutant opssont restaurés lorsque l’activité de BIN2 est abolie ou lorsque la voie est induite en dessous de BIN2. Ainsi nous montrons que la voie des BR est directement impliquée dans la différenciation du phloème. Plus généralement, une étude de la redondance fonctionnelle d’autres membres de la famille OPS semble indiquer qu’ils pourraient exercer une fonction similaire de régulateurs positifs de la voie des BR au sein d’autres tissus de la plante / Vascular tissues play an important role in plant physiology and development. Vascular tissues consist on xylem and phloem that ensure sap transport and permit to redistribute mineral and metabolites between different organs. Regulation of vascular tissues establishment is highly controlled in space and time. Among genes involved in vascular tissues formation, OCTOPUS (OPS) gene operates early during development to control vascular patterning and to induce phloem differentiation(Bauby et al., 2007; Truernit et al., 2012). OPS belongs to a multigenic family conserved in high plant. However, molecular function of OPS protein remains unclear. A combination of physiological, biochemical, molecular, cytological and genetic approaches allowed to show that OPS gene is a new positive regulator of brassinosteroid (BR) signaling pathway. BR are phytohormones involved in many developmental processes such as cell elongation or vascular tissues organization. Although BR were discovered in 1970 (Mitchell et al., 1970; Mitchell and Gregory, 1972; Grove et al., 1979), interest of researchers for this hormone permitted its detailed description. Among the component of BR signaling, the BIN2 kinase is the key regulator (Li et al., 2001) which represses the pathway through its action on BES1 and BZR1 transcription factors(Yin et al., 2002; Wang et al., 2002). OPS interacts physically with BIN2 at the plasma membrane which could create an inhibition by delocalization of the BIN2 protein from its activity place. As such, opsphloem defects are restored when the activity of BIN2 is inhibited or when the pathway is induced downstream of BIN2. Thus, we show that BR pathway is directly involved in phloem differentiation. More generally, a study of the functional redundancy of other OPS family members suggests that they could have a similar function as positive regulators of BR pathway in other plant tissues.

Philosophiae Doctor - PhD / In this thesis, we have firstly cloned and expressed the domains that harbours the putative catalytic GC domain in these receptor molecules and demonstrate that these molecules can convert GTP to cGMP in vitro. Secondly, we show that exogenous application of both Phytosulfokine and Brassinosteroid increase changes of intracellular cGMP levels in Arabidopsis mesophyll protoplast demonstrating that these molecules have GC activity in vivo and therefore provide a link as second messenger between the hormones and down-stream responses. In order to elucidate a relationship between the kinase and GC domains of the PSK receptor, we have used the AtPSKR1 receptor as a model and show that it has Serine/Threonine kinase activity using the Ser/Thr peptide 1 as a substrate. In addition, we show that the receptor`s ability to phosphorylate a substrate is affected by the product (cGMP) of its co-domain (GC) and that the receptor autophosphorylates on serine residues and this step was also observed to be affected by cGMP. When Arabidopsis plants are treated with a cell permeable analogue of cGMP, we note that this can affect changes in the phosphoproteome in Arabidopsis and conclude therefore that the cGMP plays a role in kinase-dependent downstream signalling. The obtained results suggest that the receptor molecules investigated here belong to a novel class of GCs that contains both a cytosolic kinase and GC domains, and thus have a domain organisation that is not dissimilar to that of atrial natriuretic peptide receptors NPR1 and NPR2. The findings also strongly suggest that cGMP has a role as a second messenger in both Brassinosteroid and Phytosulfokine signalling. We speculate that other proteins with similar domain organisations may also have dual catalytic activities and that a significant number of GCs, both in plants and animals, remain to be discovered and characterised. / South Africa

Dans cette thèse nous nous intéressons à la manière dont la structure des plantes émerge du fonctionnement de leur méristème apical. Pour cela, nous étudions la structure du méristème apical d'Arabidopsis thaliana à différentes échelles. La thèse commence par étudier les plantes à l'échelle macroscopique dont la phyllotaxie a été perturbée et par le développement d'outils mathématiques pour quantifier et analyser ces perturbations. Ensuite, nous étudions à une échelle plus microscopiques quelles peuvent être les raisons de telles perturbations. Pour cela, nous avons testé une version étendue d'un modèle proposé par Douady et Couder (1996) dans lequel plusieurs paramètres clés sont modifiés par différentes sources de bruit. Cette étude de modélisation suggère que la stabilité de la taille de la zone de la zone centrale peut être un facteur clé dans la robustesse phyllotaxie. Alors que des modèles 3D réalistes des champs d'inhibition autour des primordia ont été développés récemment, une telle étude est toujours manquante pour les tissus réalistes en 3D dans le cas de la zone centrale. Cela nous conduit finalement à analyser en profondeur le réseau de régulation génétique qui contrôle la taille de la zone centrale dans le méristème. Nous avons implémenté une version 3D d'un modèle de la littérature de la zone centrale et testé ce modèle sur des méristèmes 3D obtenues à partir des images 3D de la microscopie laser. / In this dissertation we are interested in how shoot structure emerges from the functioning of their apical meristem. For this, we investigate the structure of Arabidopsis thaliana shoot apical meristem at different scales. The thesis starts by studying at macroscopic scale plants in which the regularity of phyllotaxis has been perturbed and developing mathematical tools to quantify and analyze such complex patterns. Then we try to investigate at more microscopic scales what can be the reasons for such perturbations. For this we tested an extended version of Douady and Couder's model (1996) in which several key parameters are varied by adding different sources of noise. This modeling study enables us to hypothesize that the stability in size of both the primordia inhibition zone and the central zone may be key factors in phyllotaxis robustness. While realistic 3D models of primordia inhibitory fields have been developed recently, such a study is still missing for realistic 3D tissues in the case of the central zone. This lead us finally to analyze in depth the gene regulatory network that controls the size of the central zone in the meristem. We implemented a 3D version of a model in literature modulating the size of the central zone and tested this model on 3D meristem cellular structures obtained from 3D laser microscope images.

Le nitrate est une source essentielle d’azote pour les plantes. Les transporteurs racinaires qui prélèvent le nitrate du sol sont soumis à des régulations transcriptionnelles qui modulent les capacités de prélèvement du nitrate. NRT2.1, transporteur de nitrate essentiel et majoritaire au niveau racinaire, est très fortement exprimé en condition limitante en nitrate, et réprimé sous forte nutrition azotée. Cette répression est corrélée avec un enrichissement en marque chromatinienne H3K27me3 qui semble dépendant du régulateur chromatinien HNI9. H3K27me3 est une marque chromatinienne répressive pour l’expression des gènes, catalysée par le complexe PRC2, et est impliquée dans la régulation du développement. Cependant, le rôle de H3K27me3 et de PRC2 dans l’adaptation à des environnements nutritionnels fluctuants reste à étudier. Le projet qui m’a été confié était d’étudier, chez Arabidopsis, la contribution de H3K27me3 dans la régulation du gène NRT2.1 en réponse à l'azote. Nous démontrons que H3K27me3 n’est pas le déterminant majeur de la répression de NRT2.1 par le fort statut azoté, mais que H3K27me3 régule directement NRT2.1, dans un contexte où NRT2.1 est fortement exprimé, afin de tempérer son expression. Nous montrons également que l’absence de limitation de l’hyperactivité du promoteur NRT2.1 peut in fine conduire à un état totalement réprimé par méthylation de l’ADN. Ce travail révèle une fonction insoupçonnée de PRC2 en tant que modulateur et protecteur de l’expression de gènes fortement exprimés. Nous montrons aussi que HNI9 aurait pour fonction d’activer des gènes de réponse à un stress oxydant mis en place lors d’une forte nutrition, et que PRC2 et NRT2.1 ont des rôles indépendants dans la régulation de l’architecture racinaire. L’ensemble de ce travail a permis de mettre en lumière de nouvelles fonctions de la dynamique chromatinienne dans la régulation de gènes majeurs pour la nutrition des plantes. / Nitrate is an essential source of nitrogen for plants. Root nitrate transporters are subjected to transcriptional regulations that allow a fine control of nitrate uptake capacities. NRT2.1, an essential and major nitrate transporter in roots, is strongly expressed under limiting nitrate condition, and repressed under high nitrogen nutrition. This repression is correlated with an enrichment in chromatin mark H3K27me3, which seems to be dependent on the chromatin regulator HNI9. H3K27me3 is a chromatin mark repressive for gene expression, catalysed by the PRC2 complex, and involved in developmental regulation. However, the role of H3K27me3 and PRC2 in the adaptation to fluctuating nitrogen environments remains to be understood. My project was to study, in Arabidopsis, the contribution of H3K27me3 in the regulation of NRT2.1 gene in response to nitrogen provision.We demonstrate that H3K27me3 is not the major determinant of NRT2.1 repression by high nitrogen status, but that H3K27me3 directly regulates NRT2.1, in a context where NRT2.1 is strongly expressed, to temper its expression. We also show that the absence of limitation of NRT2.1 promoter hyperactivity can lead to a switch to full silencing by DNA methylation.This reveals an unexpected function of PRC2 as a safeguard for the expression of highly expressed genes. We also show that HNI9 is involved in the activation of oxidative stress responsive genes, which occurs under N-rich nutrition, and that PRC2 and NRT2.1 play independent roles in the regulation of root architecture. This work has highlighted new functions of chromatin dynamic in the regulation of genes with major significance for plant nutrition.

L’azote est un des macronutriments essentiels pour les plantes. Dans les sols, l’azote est présent sous différentes formes organiques et inorganiques. Les plantes utilisent préférentiellement le nitrate, qui n’est pas toujours disponible en quantités suffisantes dans les sols. Récemment, une étude a permis de montrer que le facteur de transcription NLP7 est un régulateur majeur de la réponse primaire au nitrate. La localisation subcellulaire de cette protéine est régulée par le nitrate : en son absence, elle est localisée dans le cytoplasme alors qu’après ajout de nitrate, une rétention nucléaire est activée. Les mécanismes moléculaires de cette rétention restent encore à comprendre ainsi que la transmission du signal nitrate, de l’extérieur de la plante à la protéine NLP7. Le transporteur de nitrate NPF6.3 a été montré comme jouant un rôle dans la perception du nitrate, c’est donc un transcepteur. Notre hypothèse était que NPF6.3 est le récepteur de nitrate en amont de NLP7. Pour tester cette hypothèse, nous avons étudié par des approches génétiques les liens d’épistasie entre les deux gènes. L’étude de la biomasse et de l’expression des gènes sentinelles en réponse au nitrate chez les simples et double mutants a permis d’observer des phénotypes additifs. Nous avons pu montrer que le mécanisme de relocalisation rapide de la protéine NLP7 dans le noyau est toujours actif dans le fond mutant npf6.3. Ces résultats ont donc permis de montrer que NLP7 et NPF6.3 n’appartiennent pas à la même voie de signalisation mais que ces deux voies pourraient être dépendantes selon les conditions. D’autre part, peu de régulateurs de la réponse au nitrate sont connus. De manière intéressante, les gènes cibles de NLP7 sont enrichis en protéines régulatrices comme par exemple d’autres facteurs de transcription ou encore des protéines kinases, ce qui place NLP7 à un haut niveau hiérarchique de régulation dans la voie de signalisation en réponse au nitrate. En effet, ces cibles directes de NLP7 pourraient elles-mêmes être impliquées dans des voies de signalisation en aval de NLP7. Dans le but de disséquer la voie de signalisation en aval de NLP7, nous avons étudié deux cibles directes de NLP7, des Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinases (MAPKKKs), MAPKKK13 et MAPKKK14. Les MAPKs sont connues pour leur mode d’action en cascades de phosphorylations. Par des approches biochimiques en protoplastes, nous avons montré que MAPKKK13/14 sont capables d’activer des MAPKs du groupe C via MKK3. De plus, nous avons obtenu de premières indications montrant que certaines réponses développementales au nitrate ainsi que la réponse primaire au nitrate seraient partiellement modifiées dans les simples mutants mapkkk13 et mapkk14, et dans le double mutant mapkkk13/14. / Nitrogen is one of the most important macronutrients for plants. In the soils, nitrogen can be found under different organic and inorganic forms. Plants preferentially use nitrate, which is not always available for plant uptake and assimilation in soils. Recently, it was shown that the NLP7 transcription factor is a master regulator of the primary nitrate response. Its subcellular protein localization is regulated by nitrate: without nitrate, the protein is localised in the cytoplasm whereas after nitrate resupply, a nuclear retention is observed. Molecular mechanisms of this nuclear-cytosolic shuttling and of the nitrate signal transduction from the external medium to the NLP7 protein are still unknown. It has been shown that the NPF6.3 nitrate transporter plays a role in the nitrate signal sensing, which made this protein a transceptor. Our hypothesis was that NPF6.3 is the nitrate sensor upstream of NLP7. To test this hypothesis, we studied by genetic approaches the epistasis link between the two genes. By studying the simple and double mutant’s biomass and sentinel gene regulation in response to nitrate, we observed additive phenotypes. We showed that the nuclear relocation mechanism of NLP7 is still active in the npf6.3 mutant background. All together, these results showed that NLP7 and NPF6.3 are not in the same signalling pathway but there would be an interplay depending on the conditions. On the other hand, only a few regulators of the nitrate response are known. Interestingly the direct target genes of NLP7 are highly enriched for regulatory proteins such as other transcription factors or protein kinases, which places NLP7 at a high hierarchical place in the nitrate signalling pathway. Indeed these direct targets of NLP7 may themselves be involved in signalling cascades downstream of NLP7. In order to identify molecular events downstream of NLP7, we studies two NLP7 direct targets, Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinases (MAPKKKs), MAPKKK13 and MAPKKK14. MAPKs are known to act as phosphorylation cascades. Using biochemical approaches in protoplasts, we have shown that MAPKKKK13/14 are able to activate Group C MAPKs via MKK3. In addition we showed in planta that nitrate addition indeed triggered the activation of group C MAPKs and that this activation is dependent on NLP7 and MKK3. Furthermore we obtained first indications that nitrate-dependent developmental traits and the primary nitrate response are partially impaired in the single mutants mapkkk13 and mapkkk14, and the double mutant mpkkk13mpkkk14.

La maturation des ARN implique un grand nombre d’évènements post-transcriptionnels, parmi lesquels la polyadénylation qui constitue une étape clé. Chez Arabidopsis, la présence de l’hétérochromatine au niveau des introns de certains gènes peut influencer considérablement la polyadénylation de leur transcrits. INCREASED IN BONSAI METHYLATION2 (IBM2) est une protéinequi contrôle cette catégorie de gènes en reconnaissant l’hétérochromatine au niveau des introns via son domaine BOMO-ADJACENT HOMOLOGY (BAH). IBM2 se lie à l’ARNm par son motif RNA RECOGNOTION (RRM), afin d’assurer la transcription complète de ces gènes cibles en favorisant l’utilisation d’un site distal de polyadénylation. Par conséquent, en mutant IBM2, des plus transcrits courts sont synthétisés suite à une polyadénylation précoce au niveau de la régionhétérochromatique. Durant ma thèse, j’ai cherché à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents de cette régulation tout en étudiant le rôle du complexe protéique IBM2. Nous avons identifié des protéines partenaires d’IBM2 déjà étudiées telle que ENHANCED DOWNY MILDEW2 (EDM2) et ASI-IMMUNOPRECIPITATED PROTEIN1 (AIPP1), ainsi qu’une nouvelle protéine interagissant physiquement avec IBM2 et d’autres protéines. La mutation du gène correspondant à cette protéine conduit à une réduction de l’expression globale des cibles d’IBM2testées, accompagnée d’un niveau réduit de transcrits longs fonctionnels. Moyennant un crible génétique des suppresseurs de la mutation ibm2, nous avons identifié plusieurs facteurs agissant en amont de la voie IBM2, notamment la protéine FLOWERING TIME CONTROL (FPA). FPA est une protéine capable de s’associer à l’ARN pour favoriser l’utilisation de sites proximaux de polyadénylation de plusieurs gènes cibles, avec parmi eux des gènes contrôlés par IBM2, ce qui suggère que la transcription complète de ces gènes dépend étroitement des actions antagonistes entre IBM2 et FPA. Nos résultats ont montré que le choix du site de polyadénylation de gènes contenant de l’hétérochromatine dépend de plusieurs protéines agissant en différents complexes ainsi que l’interconnexion avec d’autres voies. / RNA maturation implies numerous post-transcriptional modifications in whichpolyadenylation is a key step. In Arabidopsis, the heterochromatin found within introns(intronic-HC) can impact transcripts polyadenylation of host genes. INCREASED IN BONSAI METHYLATION2 (IBM2), an RNA-binding protein containing a bromo-adjacent homology (BAH) domain, interacts with intronic-HC to produce functional full-length transcripts by promoting distal polyadenylation. Loss of IBM2 function triggers short transcripts production due to premature polyadenylation from the heterochromatic region. During my thesis, I investigated the role of proteins that may belong to different sub-complexes in the regulation of intronic-HC containing genes. We identified IBM2 partners, including ENHANCED DOWNY MILDEW 2 (EDM2) and ASI-IMMUNOPRECIPITATED PROTEIN1 (AIPP1), and a novel partner that interacts directly with IBM2 and other proteins. Mutating the corresponding gene of the novel partner results in decreased expression of tested IBM2-targets such as IBM1 encoding an H3K9demethylase and the disease resistance gene RECOGNITION OF PERONOSPORA PARASITICA 7 (RPP7), accompanied with compromised use of their distal polyadenylation sites. By conducting a genetic screen of ibm2 mutation suppressors, we identified factors belonging to different pathways that act upstream of IBM2, among them the FLOWERING TIME CONTROL PROTEIN (FPA). FPA is an RNA-binding protein that promotes the use of proximal polyadenylation sitesof several genes such as IBM1. Our data bring evidence that antagonistic actions of FPA and IBM2 regulates polyadenylation sites choice at intronic-HC containing genes. These results provide new insights to understand the interplay between heterochromatin and RNA processing.