Une étape importante du cycle viral du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est l'export nucléaire de transcrits viraux incomplètement épissés, incluant le génome viral ARN. Ce processus fait intervenir la protéine virale de liaison à l'ARN Rev. Dans le noyau, Rev interagit avec les transcrits viraux non épissés et partiellement épissés en s'oligomérisant sur une séquence intronique de 350 nucléotides, appelée Element de Response à Rev (RRE). Rev recrute également le facteur d'export cellulaire CRM1 et la petite GTPase Ran pour former le complexe d'export RRE/Rev/CRM1/Ran. Connaître l'architecture 3D de ce complexe ribonucléoprotéique fournirait des informations utiles pour une meilleure compréhension de l'export des ARN du VIH incomplètement épissés. Cependant, les détails moléculaires de ce complexe sont mal connus ; en particulier, la stœchiométrie des molécules Rev et CRM1 liées au RRE est en discussion.Mon doctorat vise à étudier l'architecture du complexe RRE/Rev/CRM1/Ran. Dans le cadre de ce travail, j'ai utilisé des essais biochimiques et cellulaires pour caractériser les interactions entre CRM1 et Rev et entre Rev et RRE. La majorité de mes efforts ont porté sur l'étude de ces interactions par spectrométrie de masse (MS) en condition native, une méthode puissante pour déterminer la stœchiométrie de complexes macromoléculaires. J'ai mis en place des protocoles pour la préparation à grande échelle d'un fragment du RRE de 66 nucléotides (IIABC), portant un site de liaison Rev de haute affinité, protocoles que j'ai ensuite adaptés à l'analyse de IIABC par MS en condition native. Comme Rev a tendance à s'agréger et à précipiter en solution, j'ai également conçu une forme mutante de Rev (Rev*) permettant de contourner ces problèmes. L'analyse des complexes IIABC/Rev* par électrophorèse sur gel natif confirme l'oligomérisation de Rev* sur l'ARN. Après d'intenses optimisations, j'ai obtenu des spectres MS en condition native de haute qualité, révélant que IIABC lie jusqu'à 6 monomères Rev*. De plus, j'ai reconstitué un complexe à 4 partenaires IIABC/Rev*/CRM1/Ran et j'ai réussi à déterminer sa masse et sa stœchiométrie par MS en condition native, une tâche techniquement difficile. Des efforts supplémentaires pour analyser le RRE seul et en complexe avec Rev de type sauvage ont également généré des spectres informatifs, alors que l'analyse du complexe intact RRE/Rev/CRM1/Ran a été plus compliquée. Ces résultats illustrent les forces et les limites de la spectrométrie de masse en condition native et son potentiel pour son développement futur en tant qu'outil d'analyse des complexes de ribonucléoprotéines. / An important step in the life cycle of human immunodeficiency virus (HIV) is the nuclear export of incompletely spliced viral transcripts, including the replicated viral RNA genome. This process is mediated by the viral RNA-binding protein Rev. In the nucleus, Rev recognizes unspliced and partially spliced viral transcripts by multimerizing on a 350-nucleotide intron sequence, the Rev-response element (RRE). Rev then recruits the host cell export factor CRM1 and the small GTPase Ran to form the RRE/Rev/CRM1/Ran export complex. Knowledge of the 3D architecture of this ribonucleoprotein complex would provide important insights into how unspliced viral RNA export is achieved. However, the molecular details of this complex are poorly understood. In particular, the stoichiometry of Rev and CRM1 molecules bound to the RRE is under debate.My Ph.D. project aims to investigate the architecture of the RRE/Rev/CRM1/Ran complex. As part of this work, I used biochemical and cell-based assays to characterize the interactions between CRM1 and Rev and between Rev and the RRE. The majority of my efforts focused on investigating these interactions by native mass spectrometry (MS), a powerful method for determining the stoichiometry of macromolecular complexes. I set up protocols for the large-scale preparation of a 66-nucleotide RRE fragment (IIABC) bearing a high-affinity Rev binding site, and adapted these for compatibility with native MS analysis. Because Rev tends to aggregate and precipitate in solution, I engineered a mutant form of Rev (Rev*) to overcome this problem. Analysis of IIABC/Rev* complexes by native gel electrophoresis confirms multimerization of Rev on the RNA. After extensive optimization, I obtained high-quality native MS spectra of these complexes, revealing that IIABC binds up to 6 Rev* monomers. Furthermore, I reconstituted a 4-species complex, IIABC/Rev*/CRM1/Ran, and succeeded in determining its mass and stoichiometry by native MS – a technically challenging task. Additional efforts at analyzing the intact RRE and complexes with wild-type Rev have also yielded informative spectra, while analysis of the intact RRE/Rev/CRM1/Ran holo-complex has had more limited success. These results illustrate the strengths and limitations of native mass spectrometry and its potential for future development as a tool for analyzing ribonucleoprotein complexes.

Il est estimé qu'une fracture se produit toutes les trois secondes autour du monde, accompagné par un risque élevé d'invalidité ou même de mortalité. La connaissance des mécanismes de fractures dans une configuration de chargement représentatif d'une chute semble être d'un intérêt majeur pour le développement de méthodes dédiées à la prédiction du risque de fracture. La ténacité est un paramètre approprié lorsqu'on s'intéresse à ces mécanismes de fracture, elle détermine l'énergie nécessaire pour propager une fissure à travers l'architecture du tissu. L'objectif de cette étude est d'évaluer la ténacité de l'os cortical humain, considérant à la fois des conditions chargement quasi-statique et représentatif d'une chute sur sites anatomiques appariés. L'acquisition d'images en micro-tomographie ainsi qu'une mesure des cross-links ont été réalisées afin d'évaluer leur influence sur les mécanismes fracture du tissu. Les résultats ont montré que dans des conditions quasi-statiques, les différents sites anatomiques présentent des propriétés mécaniques différentes : le radius résiste mieux à une propagation de fissure. Dans des conditions de chute, il n'y a plus de différences entre ces sites, mais la ténacité décroit de façon significative par rapport au chargement standard. L'os cortical résiste mieux à une propagation de fissure dans des conditions quasi-statiques. Les analyses structurales et biochimiques ont montré des différences entre les sites anatomiques qui expliquent les différences mécaniques. Les caractéristiques architecturales du tissu sont déterminantes vis-à-vis des mécanismes de fracture dans des conditions quasi-statiques. Mais leur rôle lors d'une chute est moins évident. Ces résultats impliquent que la microstructure de l'os cortical n'est pas un déterminant majeur vis-à-vis du risque de fracture. De futures études doivent être réalisées afin de déterminer les paramètres décisifs dans des conditions représentatives d'une chute / A fracture is estimated every three seconds in the world, leading to an increased risk of impairment or even mortality. The biomechanical knowledge of bone fracture mechanisms in a fall configuration of loading is of great interests for the development of clinical method for the prediction of the risk of fracture. Toughness seems to be a good candidate to investigate this fracture process as it corresponds to the energy needed to propagate a crack through cortical bone complex microstructure. The aim of this study was thus to evaluate human cortical bone toughness parameter under both quasi-static and fall-like loading conditions paired anatomical locations. Micro-computed tomography images using synchrotron radiation and collagen cross-links maturation measurements were performed to investigate the influence of the tissue architecture on crack propagation. Results found showed that under quasi-static condition, the different anatomical locations present different mechanical behavior. Radius significantly better resist crack propagation than the other studied location. Considering a fall-like loading condition, no more difference is observed between the locations but a significant decreased is measured compare to the first configuration. Human cortical bone has a better capacity to resist crack propagation under a standard quasi-static loading condition. By investigating the tissue morphometric and biochemical parameters, we observed different organization from a location to another that explains the mechanical differences. The architectural features appear to be determinant for crack propagation mechanisms under quasi-static condition, but they play a lesser role under fall-like condition. These results imply that the tissue microstructure is not a determinant when dealing with the prediction of the risk of fracture. Further work has to be done to reach out which parameters are more determinants under a specific fall-like loading condition