No description available.

G protein-coupled receptors (GPCRs) form the biggest family of membrane receptors and are involved in numerous physiological processes. Collectively, these receptors are also prominently targeted by the pharmaceutical industry due to their implications in multiple diseases and disorders. GPCR signaling is tightly regulated. Several kinases, activated downstream of the receptor, initiate negative feedback loops; and arrestins play a crucial role in these regulatory processes by desensitizing the ligand–activated receptor and promoting its endocytosis. By doing so, arrestins control the duration and the amplitude of signal transduction at the cell surface. In the last few years, several non-canonical roles have also been attributed to arrestins, such as the post-endocytic activation of several signalling pathways, or the regulation of crosstalks between GPCRs and various other signalling events. My thesis project was aimed at providing a better understanding of the non-canonical functions of arrestins. The first objective of my research work was to investigate a possible reciprocal effect of the activation of the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) on GPCR signaling. We demonstrated that stimulation of ERK1/2, either by a cell surface receptor or a constitutively active mutant, leads to a reduction in steady-state expression levels of many GPCRs at the cell surface. This receptor redistribution mechanism is dependent on beta-arrestins phosphorylation. In vitro kinase assays combined with complementation experiments in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) lacking beta-arrestins, revealed that beta-arrestin-2 phosphorylation on Ser14 and Thr276 is essential for the ERK1/2-promoted GPCR sequestration. This ERK1/2- and arrestins mediated regulatory process was found to result in a global dampening of cell responsiveness. The second objective of my research work was to identify and develop a small organic compound that inhibits the interaction between arrestins and the adaptor protein AP-2, without interfering with the recruitment of arrestin to the receptor. This inhibitor, named Barbadin, was found to specifically block endocytic processes that are dependent on the interaction between arrestins and the appendage domain of the b-subunit of AP-2. We demonstrated its value as an analytical tool in studying the role of the arrestins in GPCR signaling, such as cAMP production and ERK1/2 activation. These results support the concept that beta-arrestin/AP-2-dependent signaling is important to both G protein-dependent and -independent pathways. The third objective of my research work was to develop a BRET-based biosensor able to detect signal-dependent PTEN conformational changes. This biosensor was validated by monitoring PTEN activation induced by targeted mutations affecting key intramolecular interactions or by modulating signalling pathways that impact PTEN function. We also demonstrated the value of this biosensor in studying PTEN/protein interactions using two known interactors that activate PTEN, beta-arrestin-2 and RhoA. Finally, we uncovered PTEN activation by several GPCRs, previously unknown as PTEN regulators. Given the central role of the tumor suppressor PTEN in oncogenesis, this biosensor could also provide a precious tool for anti-cancer drug research. To conclude, my research work highlighted non-canonical mechanisms for arrestins to activate GPCR-dependent signaling pathways, such as cAMP, ERK1/2 and PTEN, as well as negatively regulate GPCR signaling upon phosphorylation by ERK1/2. This work was made possible by the development of new tools: a beta-arrestin inhibitor named Barbadin and a PTEN BRET-based biosensor that have both shown their usefulness in studying beta-arrestin noncanonical signaling. / Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de récepteurs membranaires et sont impliqués dans un grand nombre de processus physiologiques. Cette famille de récepteurs constitue aussi une cible majeure dans la recherche pharmaceutique au vu de son importance dans de nombreuses pathologies. La signalisation des RCPG est étroitement régulée. Plusieurs kinases activées en aval du récepteur initient des boucles de régulation négative. Les arrestines jouent un rôle clé dans ces processus de régulation en favorisant la désensibilisation du récepteur activé par le ligand, suivie de son endocytose. Ainsi, les arrestines contrôlent la durée et l’amplitude de la transmission du signal à la surface de la cellule. Ces dernières années, plusieurs rôles non-canoniques ont été attribués aux arrestines comme l’activation de voies de signalisation post-endocytiques, ou la modulation de la régulation croisée entre les RCPG et d’autres acteurs de la signalisation cellulaire. Le premier objectif de mon travail de recherche est d’examiner l’effet réciproque de l’activation des kinases ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1/2) sur la signalisation des RCPG. Nous avons démontré que la stimulation de ERK1/2, soit par un récepteur de surface soit par l’utilisation d’un mutant constitutivement actif, conduit à la baisse de l’expression de surface basale de nombreux RCPG. Des essais kinases in vitro, combinés à des expériences de complémentation dans des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), où les gènes beta-arrestine-1/2 ont été supprimés, démontrent l’importance de la phosphorylation par ERK1/2 des résidus Ser14 et Thr276 dans ce mécanisme de séquestration des RCPG. Cette régulation, contrôlée par ERK1/2 et arrestine, conduit à une baisse globale de la capacité de réponse de la cellule aux stimuli extracellulaires. Le deuxième objectif de mon travail de recherche est d’identifier et de développer une petite molécule organique qui inhibe l’interaction entre l’arrestine et la protéine adaptatrice du complexe d’endocytose AP-2, sans toutefois empêcher la formation du complexe arrestine/récepteur. Cet inhibiteur, nommé Barbadin, bloque sélectivement les processus d’internalisation dépendants de l’interaction entre arrestine- et la sous-unité beta2 de la protéine adaptatrice AP-2. Barbadin représente le premier inhibiteur des fonctions d’arrestine, et nous avons démontré son utilité comme outil analytique pour déterminer la contribution des arrestines dans l’activation de plusieurs voies de signalisation en aval des RCPG, telles que la production d’AMP cyclique (AMPc) ou l’activation des kinases ERK1/2. Nos résultats démontrent l’importance du complexe arrestine/AP-2 dans la signalisation dépendante et indépendante des protéines G. Le troisième objectif de mon travail de recherche est de développer un biosenseur BRET capable de mesurer les changements de conformation du suppresseur de tumeur PTEN. Nous avons validé ce biosenseur en mesurant l’activation de PTEN suite à des mutations ciblées déstabilisant les interactions intramoléculaires au sein de cette protéine ou en modulant différentes voies de signalisation qui affectent sa fonction. Nous avons démontré l’intérêt de ce nouvel outil dans l’étude des interactions entre PTEN et des partenaires protéiques, en utilisant deux interacteurs connus pour activer PTEN : b-arrestine-2 et RhoA. Finalement, en utilisant ce biosenseur, nous avons démontré pour la première fois la capacité de plusieurs RCPG à induire l’activation de PTEN. Étant donné le rôle central de PTEN dans le développement tumoral, ce biosenseur constitue aussi un outil précieux pour la recherche de nouveaux médicaments anticancer. Ainsi, au travers de ces trois lignes directrices, nous avons pu mettre en lumière de nouveaux rôles non-canoniques des arrestines, soit dans l’activation de voies de signalisation, (comme la production d’AMPc, l’activation de ERK1/2 ou de PTEN), soit comme régulateur négatif de la signalisation des RCPG après phosphorylation par ERK1/2. Ce travail a été rendu possible par le développement de nouveaux outils pour l’étude des RCPG : un inhibiteur de beta-arrestine, Barbadin, et un biosenseur BRET de PTEN ; tous deux ayant démontré leur utilité dans l’étude des voies de signalisation non-canoniques des arrestines.

La leucémie myéloïde aiguë (LMA) est causée par une prolifération anormale de cellules souches sanguines immatures. Notre laboratoire se concentre sur un sous-groupe de la LMA représentant près de 30% de la LAM pédiatrique et caractérisé par la translocation chromosomique KMT2A-MLLT3. L'analyse par séquençage de l’ARN (RNA-seq) dans notre modèle de LMA médiée par la fusion KMT2A-MLLT3 et des échantillons de patients leucémiques a révélé que les gènes codant la chimiokine CCL23 et son récepteur correspondant CCR1 sont surexprimés dans cette maladie. Bien qu'il ait été rapporté que CCL23 et CCR1 sont impliqués dans le trafic de leucocytes et le développement de l'inflammation, les rôles exacts de ces deux protéines dans la leucémogenèse sont inconnus. Pour illustrer les effets de la signalisation CCL23/CCR1 dans la leucémie causée par la fusion KMT2A-MLLT3, nous avons utilisé la technique de transfert d'énergie de résonance de bioluminescence 2 améliorée (ebBRET2) avec des tests d'immuno-empreintes. Nos résultats ont révélé que la signalisation de l'axe CCL23/CCR1 active plusieurs effecteurs de signalisation intermoléculaire, y compris Gi2, G12/13 et β-arrestine 1/2, mais avec un biais vers le recrutement de la β-arrestine. Nous avons également montré que le récepteur CCR1 présente une activité constitutive qui peut se coupler à une voie médiée par la protéine G et activer la voie impliquant les MAP kinases. Enfin, nous avons montré que la signalisation de l'axe CCL23/CCR1 provoque une activation de ERK1/2 dans les lignées cellulaires LMA potentiellement par une voie médiée par la β-arrestine. Ces résultats indiquent que la signalisation de l'axe CCL23/CCR1 active plusieurs voies biologiques pouvant fournir des avantages majeurs pour le développement et la progression de la LMA et présentent ainsi CCL23 et CCR1 comme deux candidats intéressants pour une thérapie ciblée contre la LMA de type KMT2A-MLLT3. / Acute Myeloid Leukemia (AML) is caused by abnormal proliferation of immature blood stem cells. Our lab focuses on an AML subgroup accounting for almost 20% of pediatric AML and characterized by a chromosomal translocation that generates the gene fusion: KMT2A-MLLT3 (KM3). Interestingly, RNA-seq analysis of our KM3 AML model and AML patient samples has revealed that the chemokine CCL23 and its corresponding receptor CCR1 are highly upregulated in this disease. Although it has been reported that CCL23 and CCR1 are implicated in leukocyte trafficking and development of inflammation, the exact roles of these two proteins in leukemia are unknown. To illustrate the effects of CCL23/CCR1 signaling in the KMT2A-MLLT3 rearranged leukemia we employed the enhanced bystander bioluminescence resonance energy transfer 2 (ebBRET2) technique along with phospho-immunoblots assays. Our results revealed that CCL23/CCR1 axis signaling activates multiple intermolecular signaling effectors, including Gi2, G12/13, and β-arrestin1/2 albeit with a bias towards β-arrestin recruitment. We also showed that the CCR1 receptor exhibits a constitutive activity which can couple to a G-protein mediated pathway to activate the MAPK cascade. Finally, we showed that CCL23/CCR1 axis signaling causes an activation of ERK1/2 in AML cell lines potentially through a β-arrestin-mediated pathway. These results indicate that the CCL23/CCR1 axis signaling activates several biological pathways than can provide major advantages for the AML disease development and progression thus presenting both CCL23 and CCR1 as interesting candidates for targeted therapy against KMT2A-MLLT3 AML.