Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Les inhibiteurs sélectifs de recapture de la sérotonine (ISRS), agonistes indirects des récepteurs de la sérotonine (5-HT), ont un début d'effet antidépresseur retardé de plusieurs semaines. Des travaux antérieurs suggèrent que le récepteur 5-HT4 de la sérotonine serait une cible directe pour traiter la dépression et un nouvel espoir pour traiter plus rapidement ces pathologies anxio-dépressives. Toutefois, l'hypothèse « 5-HT4 » doit encore être validée dans des modèles animaux d'anxiété/dépression. Les questions posées étaient : la stimulation des récepteurs 5-HT4 centraux est-elle nécessaire aux effets comportementaux des ISRS ? la neurogenèse hippocampique adulte contribue-t-elle à ces effets ? En utilisant le modèle de stress chronique à la corticostérone (CORT) chez la souris, nous avons évalué les effets sur ces paramètres d’un traitement chronique avec un agoniste du récepteur 5-HT4 (RS67333, 1,5 mg/kg/jour pendant 4 semaines) comparé à un traitement à la fluoxétine (18 mg/kg/jour). Nous avons ensuite utilisé ce modèle murin combiné à l’ablation de la neurogenèse hippocampique par rayons-X afin d’examiner si la neurogenèse est nécessaire aux effets comportementaux d’un traitement subchronique (7 jours) ou chronique (28 jours) avec le RS67333. Nous avons également évalué le blocage des effets de la fluoxétine par un antagoniste du récepteur 5-HT4 (GR125487, 1 mg/kg/jour). Le traitement chronique avec RS67333, comme celui de la fluoxétine, induit une activité anxiolytique/antidépressive et stimule la neurogenèse hippocampique adulte. Cependant, contrairement à la fluoxétine , les effets anxiolytiques du RS67333 sont déjà présents après 7 jours de traitement, sans nécessité l’activation de la neurogenèse. Le traitement chronique avec le GR125487 empêche les deux effets anxiolytique/antidépresseur et neurogènique de la fluoxétine, indiquant que l'activation du récepteur 5-HT4 est nécessaire à ces effets de l’ISRS. Nous avons ensuite cherché à savoir si le court délai d’action antidépresseur du RS67333 peut être prédit par l'expression d'un biomarqueur périphérique. Des données de la littérature indiquent que la cascade de signalisation de β-arrestine 1 (impliquée dans la désensibilisation et l’internalisation du récepteur 5-HT4) serait un biomarqueur potentiel pré-clinique/clinique des états dépressifs et des effets d’un traitement antidépresseur. À cette fin, nous avons développé une nouvelle méthode d’évaluation des taux de protéines circulantes grâce à une analyse par immunoblot des leucocytes (PBMC) isolés à partir du sang total de souris. Les taux de β-arrestine 1 sont diminués dans les leucocytes des souris pré-traitées à la CORT. Il faut 7 jours de traitement avec le RS67333, mais 28 jours avec la fluoxétine chez ces animaux pour restaurer un taux de β-arrestine 1 comparable à celui des animaux contrôles. Ces résultats suggèrent que le taux sanguin de β-arrestine 1 est un biomarqueur de la rapidité de la réponse antidépressive. Enfin, l'activation du récepteur 5-HT4 dans le cerveau peut représenter une approche thérapeutique innovante d’apparition pour traiter plus rapidement des symptômes dépressifs associés à l’anxiété. / Selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) display a delayed onset of action of several weeks. Past work demonstrated evidence that the 5-HT4 receptor may be a direct target for treating depression and a new hope for fast acting antidepressant treatment. However, the 5-HT4 hypothesis still needs to be validated in models of anxiety/depression.We decided to investigate whether 5-HT4 receptor stimulation was necessary for the effects of SSRIs in a mouse model of anxiety/depression and whether hippocampal neurogenesis contributed to these effects. Using the mouse corticosterone model of anxiety/depression, we assessed whether chronic treatment with a 5-HT4 receptor agonist (RS67333, 1.5 mg/kg/day) had effects on anxiety and depression-related behaviors as well as on hippocampal neurogenesis in comparison to chronic fluoxetine treatment (18 mg/kg/day). Then, using our model combined with ablation of hippocampal neurogenesis, we investigated whether neurogenesis was necessary for the behavioral effects of subchronic (7-days) or chronic (28-days) RS67333 treatment. We also assessed whether a 5-HT4 receptor antagonist, (GR125487, 1 mg/kg/day) could prevent the behavioral and neurogenic effects of fluoxetine. Chronic treatment with RS67333, similar to fluoxetine, induced anxiolytic/antidepressant-like activity and stimulated adult hippocampal neurogenesis. However, unlike fluoxetine, the anxiolytic effects of RS67333 were already present after 7 days and did not require hippocampal neurogenesis. Chronic treatment with GR125487 prevented both anxiolytic/antidepressant-like and neurogenic effects of fluoxetine, indicating that 5-HT4 receptor activation is necessary for these effects of SSRIs. We then explored whether the fast onset of action of the 5-HT4 receptor agonist RS67333 could be predicted by expression of a peripheral biomarker. The β-arrestin-signaling cascade which is involved in 5-HT4 receptor desensitization and internalization, has recently gained attention as a potential pre-clinical/clinical bridging biomarker for depressive states and treatment effects. To this end, we developed a new method to assess levels of circulating proteins through immunoblot analyses of mouse PBMCs isolated from whole blood of anesthetized animals. While we did not detect any change in β-arrestin 1 in mouse leukocytes after 7 days of fluoxetine in corticosterone-treated animals, a short term treatment with RS67333, restored the level of this protein to control levels. In fluoxetine-treated animals, a restoration was only observed in the corticosterone model after a longer exposure. These results suggest that blood levels of β-arrestin 1 may be a useful biomarker to predict antidepressant/anxiolytic activities. Finally, the activation of 5-HT4 receptors in the brain may represent an innovative and rapid onset therapeutic approach to treat depression with comorbid anxiety.

Les inhibiteurs sélectifs de recapture de la sérotonine (ISRS), agonistes indirects des récepteurs de la sérotonine (5-HT), ont un début d'effet antidépresseur retardé de plusieurs semaines. Des travaux antérieurs suggèrent que le récepteur 5-HT4 de la sérotonine serait une cible directe pour traiter la dépression et un nouvel espoir pour traiter plus rapidement ces pathologies anxio-dépressives. Toutefois, l'hypothèse " 5-HT4 " doit encore être validée dans des modèles animaux d'anxiété/dépression. Les questions posées étaient : la stimulation des récepteurs 5-HT4 centraux est-elle nécessaire aux effets comportementaux des ISRS ? la neurogenèse hippocampique adulte contribue-t-elle à ces effets ? En utilisant le modèle de stress chronique à la corticostérone (CORT) chez la souris, nous avons évalué les effets sur ces paramètres d'un traitement chronique avec un agoniste du récepteur 5-HT4 (RS67333, 1,5 mg/kg/jour pendant 4 semaines) comparé à un traitement à la fluoxétine (18 mg/kg/jour). Nous avons ensuite utilisé ce modèle murin combiné à l'ablation de la neurogenèse hippocampique par rayons-X afin d'examiner si la neurogenèse est nécessaire aux effets comportementaux d'un traitement subchronique (7 jours) ou chronique (28 jours) avec le RS67333. Nous avons également évalué le blocage des effets de la fluoxétine par un antagoniste du récepteur 5-HT4 (GR125487, 1 mg/kg/jour). Le traitement chronique avec RS67333, comme celui de la fluoxétine, induit une activité anxiolytique/antidépressive et stimule la neurogenèse hippocampique adulte. Cependant, contrairement à la fluoxétine , les effets anxiolytiques du RS67333 sont déjà présents après 7 jours de traitement, sans nécessité l'activation de la neurogenèse. Le traitement chronique avec le GR125487 empêche les deux effets anxiolytique/antidépresseur et neurogènique de la fluoxétine, indiquant que l'activation du récepteur 5-HT4 est nécessaire à ces effets de l'ISRS. Nous avons ensuite cherché à savoir si le court délai d'action antidépresseur du RS67333 peut être prédit par l'expression d'un biomarqueur périphérique. Des données de la littérature indiquent que la cascade de signalisation de β-arrestine 1 (impliquée dans la désensibilisation et l'internalisation du récepteur 5-HT4) serait un biomarqueur potentiel pré-clinique/clinique des états dépressifs et des effets d'un traitement antidépresseur. À cette fin, nous avons développé une nouvelle méthode d'évaluation des taux de protéines circulantes grâce à une analyse par immunoblot des leucocytes (PBMC) isolés à partir du sang total de souris. Les taux de β-arrestine 1 sont diminués dans les leucocytes des souris pré-traitées à la CORT. Il faut 7 jours de traitement avec le RS67333, mais 28 jours avec la fluoxétine chez ces animaux pour restaurer un taux de β-arrestine 1 comparable à celui des animaux contrôles. Ces résultats suggèrent que le taux sanguin de β-arrestine 1 est un biomarqueur de la rapidité de la réponse antidépressive. Enfin, l'activation du récepteur 5-HT4 dans le cerveau peut représenter une approche thérapeutique innovante d'apparition pour traiter plus rapidement des symptômes dépressifs associés à l'anxiété.

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Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines membranaires du génome humain. Ils transmettent les signaux extracellulaires provenant de plusieurs stimuli comme les odeurs, les ions, les hormones et les neurotransmetteurs, à l'intérieur des cellules. En se liant aux RCPGs, ces molécules contribuent à la stabilisation des changements conformationnels activateurs qui se propagent jusqu'au domaine intracellulaire des récepteurs. Ces derniers engagent ensuite un ou plusieurs effecteurs, comme les protéines G hétérotrimériques et les β-arrestines (βarrs), qui activent une cascade d'événements moléculaires menant à la réponse cellulaire.Récemment, la publication de structures cristallines de RCPGs liant des ligands diffusibles a offert une opportunité de raffiner à une résolution atomique les modèles des mécanismes de transduction des signaux. Dans la première partie de cette thèse, nous avons donc exploré les déterminants de la signalisation du récepteur prototypique β2-adrénergique (β2AR), induite par les β-bloqueurs. En ne tenant compte que de leur efficacités sur le β2AR dans les voies de l'adénylate cyclase (AC) et des protéines kinases activées par les facteurs mitogéniques (MAPK), les β-bloqueurs peuvent être classés en 3 groupes distincts (agoniste inverse AC / agoniste MAPK, antagoniste neutre AC / agoniste MAPK et agoniste inverse AC / agoniste inverse MAPK). Afin de déterminer le lien entre leur efficacité et leur mode de liaison, nous avons réalisé des expériences d'arrimages moléculaires in silico entre des β-bloqueurs de chacun des groupes et la structure cristalline du β2AR liée au carazolol. De manière intéressante, les ligands à l'intérieur d'un groupe partagent un mode de liaison, alors que ceux des ligands entre les groupes divergent, suggérant que le mode de liaison des β-bloqueurs pourrait être utilisé pour prédire leur l'efficacité. En accord avec cette hypothèse, nous avons prédit et confirmé l'efficacité agoniste MAPK du carazolol, un inverse agoniste AC du β2AR se liant au récepteur de manière similaire au groupe inverse agoniste AC / agoniste MAPK. De manière intéressante, le groupement aryl des ligands agonistes inverses agonistes AC / agoniste MAPK, le seul groupement chimique variable de ce groupe, est prédite pour lier la région des 3e et 5e hélices transmembranaires (TM3 et TM5). Nous avons donc émis l'hypothèse que cette région pourrait être un déterminant de l'efficacité de ces ligands. En accord avec cette dernière, la mutation de 2 résidus (T118I, S203A) localisés proches du site de liaison des groupements aryls des β-bloqueurs, prévient l'efficacité agoniste inverse de l'ICI-118551 sur la voie de l'AC sans affecter l'efficacité d'un agoniste, indiquant que cette région est importante pour la transmission de l'effet agoniste inverse, du moins sur la voie de l'AC. Les βarrs sont des protéines d'échafaudage qui coordonnent la formation de complexes avec plusieurs dizaines d'effecteurs de signalisation. Originalement identifiées pour leur rôle dans la désensibilisation et l'internalisation des RCPGs, elles sont aussi d'importants effecteurs de la signalisation des RCPGs indépendante des protéines G hétérotrimériques. Cependant, contrairement aux protéines G hétérotrimériques, il n'existe que peu d'outils pour les étudier. Ainsi, la deuxième partie de la thèse est dédiée au développement d'outils pour l'étude des βarrs. À cette fin, nous avons d'abord tenté de transposer une méthode de mesure de l'interaction entre 2 protéines par la technologie de transfert d'énergie de bioluminescence par résonance (BRET) en microscopie et chez des souris transgéniques afin de mesurer de manière subcellulaire et dans un contexte natif l'engagement de la βarr à des RCPGs. Ainsi, nous avons établi les preuves de principe que le BRET peut être utilisé pour localiser l'interaction entre la βarr et le récepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) sur une cellule au microscope et pour détecter l'interaction entre la βarr et le β2AR sur des tissus de souris transgéniques exprimant ces protéines fusionnées avec des partenaires BRET. Finalement, il n'existe aucun inhibiteur pharmacologique ciblant les βarrs. Ainsi, grâce à la combinaison d'approches de criblage virtuel sur un modèle de la structure des βarrs et d'essais de validation cellulaire, nous avons développé un inhibiteur pharmacologique des βarrs. À l'aide de cet outil, nous avons confirmé l'implication des βarrs dans l'activation des MAPK par le V2R, mais aussi montré un nouveau rôle des βarrs dans le recyclage du β2AR. Les connaissances et outils développés dans cette thèse permettront de mieux comprendre les déterminants moléculaires de la signalisation des RCPGs et entre autres, grâce à des nouvelles approches pour étudier le rôle cellulaire et physiologique des βarrs. / G Protein-Coupled Receptors (GPCR) are members of the largest family of membrane protein in the human genome. They transduce the signal from a variety of stimuli like odors, ions, hormones and neurotransmitters, inside the cells. By binding directly to the receptors, these molecules stabilize activating conformational changes that are allosterically propagated through transmembrane to intracellular domains. Effectors like heterotrimeric G protein and β-arrestins (βarrs) are then engaged by activated receptors and trigger a cascade of signalling events leading to a cellular response. Recently, the resolution of the crystal structure of GPCR that bind to freely diffusible ligands provided the opportunity to refine at an atomic level the models describing the mecanisms of receptor signal transduction. In the first section of this thesis, we have explored the determinants of the prototypical β2-adrenergic receptor (β2AR) signalling induced by β-blockers. Given their efficacy on Adenylate Cyclase (AC) and Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) pathways, β-blockers can be classified within 3 signalling groups (AC inverse agonist / MAPK agonist, AC neutral antagonist / MAPK agonist and inverse agonist for AC and MAPK). In order to gain insight on the relation between their efficacy and binding mode, we performed in silico binding experiments between β-blockers from each group and the β2AR crystal structure bound to carazolol. Interestingly, ligands within a group share similar binding mode in contrast to those of different groups, suggesting that β-blockers binding mode could be used to predict their efficacy. In accordance to this hypothesis, we have predicted and confirmed that carazolol, an AC inverse agonist that bind to β2AR in a similar way than the AC inverse agonist / MAPK agonist group, is indeed an agonist for MAPK pathway. Moreover, aryl chemical function from AC inverse agonist / MAPK agonist ligands, barely the only variable structure feature of this group, was predicted to bind β2AR nearby the transmembrane helices 3 and 5 (TM3 and TM5). We thus have predicted that this region would be a determinant of the AC inverse agonist / MAPK agonist ligand efficacy. Accordingly, we found that mutation of 2 residues (T118I, S203A) close to the aryl moiety binding site prevents inverse agonist efficacy of ICI-118551 on AC pathway, without affecting agonist efficacy, indicating that this receptor region is important for the efficacy of these group of β-blockers, at least on AC inverse agonism.βarrs are scaffolding proteins that coordinate protein complex formation with dozen of signalling effectors. First identified for their role on GPCR desensitization and internalization, βarrs are also an important heterotrimeric G protein independent GPCR signalling effectors. However, in contrast to heterotrimeric G protein, only a few tools are available for their study. Thus, the second section of this thesis aim at developing tools for the study of βarrs. For this purpose, we had attempted to transpose a method to measure protein-protein interaction that use Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) technology, in microscopy and in transgenic mice, in order to detect subcellular localization and in a native context the engagement of βarr to RCPGs. Thus, we have established a proof of principle that BRET can be combined with microscopy to locate an interaction between βarr and the type 2 vasopressin receptor (V2R) within a cell. Moreover, we have established a second proof of principle that we can detect βarrs recruitment to β2AR on cells extracted from tissues of transgenic mice expressing these proteins fused to BRET partner. Finally, there is no pharmacological inhibitor of βarrs. Thus, using a combination of virtual screening and cellular validation approches, we have developed the first pharmacological βarrs inhibitor. With this novel tool, we have confirmed the implication of βarrs in V2R-mediated MAPK activation, but also showed a new role of βarrs in β2AR recycling.The finding and the tools presented in this thesis should allow to better understand the molecular determinants of GPCR signalling, and among other things, by proposing new tools to study βarrs cellular and physiological roles.

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