Cell polarity is a fundamental feature of eukaryotic cells. The intracellular trafficking of proteins between cellular compartments and the cytoskeleton regulates the establishment and maintenance of cell polarity. These events are largely regulated by the Ras superfamily of small GTPases. Rabs (Ras-related in brain) and Arfs (ADP-ribosylation factor), subfamilies of the Ras superfamily, play a major role in coordinating vesicle formation and in mediating vesicle association with cytoskeletal components for transport of vesicles to their correct cellular compartment or membrane domain. Although these GTPases mediate membrane trafficking, how they interact with each other and effector proteins to participate in vesicle formation and transport at the trans-Golgi network (TGN) remains poorly understood. The TGN is a major sorting station for biosynthetic cargo molecules (i.e. apical and basolateral) into distinct carriers for delivery to their correct acceptor compartment. We have analyzed the role of Rab14 at the Trans-Golgi Network (TGN), apical endosomes, and in vesicle formation at the TGN by overexpressing wild type and mutant forms of Rab14 in polarized and non-polarized cells. We localized Rab14 to a domain of the TGN distinct from that of the TGN/basolateral protein, TGN38. Overexpression of inactive Rab14 causes the TGN to expand and mislocalizes the apical membrane protein VIP/MAL to the lateral membrane. Furthermore, inactive Rab14 colocalizes with Arf1-GDP at the TGN and increases the amount of COPI at the TGN. These results suggest that Rab14 is involved in the trafficking of proteins from the TGN to apical endosomes and modulates vesicle formation at the TGN by regulating Arf1 activation and COPI localization to distinct domains of the TGN. Thus, Rab14 defines a new role for COPI-mediated vesicle formation at the TGN.

No description available.

We examined the function of ADP-ribosylation factors (Arfs) and their guanine nucleotide exchange factors (GEFs) that regulate recruitment of coat proteins on the Golgi complex. The large ArfGEF GBF1 localizes at the cis-Golgi complex while BIG1 and BIG2 localize at the trans-Golgi network (TGN). Complementary overexpression and RNA-based knockdown approaches established that GBF1 but not BIGs, is required for COPI recruitment, Golgi stack maintenance and sub-compartmentalization while BIGs appear specialized for clathrin adaptor recruitment and for assembly and maintenance of the TGN. Our observations disprove two widely accepted mechanisms for cargo export by establishing that COPII is the only coat required for sorting and export from the ER exit sites and that BIGs are not required for traffic of the cargo protein VSVG to the cell surface. Furthermore, we provide evidence that may ultimately explain how these ArfGEFs regulate different coats in spite of their well-characterized promiscuity towards class I and II Arfs. We prove for the first time that Arf3 is activated uniquely by BIGs at the TGN. Also, contrary to expectations, we demonstrate that Arf3 differs from Arf1 in regard to localization pattern as well as temperature sensitivity of membrane recruitment. Shifting temperature to 20C for 2 hours, a method known to block cargo in trans-Golgi compartments, caused a dramatic redistribution Arf3 but not Arf1. Redistribution of Arf3 from Golgi membranes upon shift to 20C was not immediate but occurred gradually over 20 minutes. Arf1 and Arf3 differ in sequence only in two short regions at the N- and C-termini. Analysis of swap constructs established that two amino acids in the N-terminal region of Arf3 and Arf1 are responsible for directing the temperature sensitivity while two amino acids in the C-terminus directs Arf3s specific localization. Arf3 knockdown had no impact on any of the markers tested or on VSVG trafficking to the cell surface. My work provides solid evidence to support that ArfGEFs function at different compartments to regulate membrane recruitment of specific coat proteins, and may also regulate distinct sets of Arfs that localize preferentially to these particular compartments.

Les protéines SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein REceptor) sont essentielles pour la fusion membranaire. J'ai étudié chez Arabidopsis thaliana la SNARE Memb11 de l’appareil de Golgi qui intervient au début de la voie sécrétoire à l'interface Réticulum endoplasmique (RE)-appareil de Golgi. Dans les cellules de mammifères, l'orthologue de Memb11 (Membrine) est un « récepteur » potentiel de la GTPase Arf1 à la membrane golgienne. Cette dernière est impliquée dans le recrutement de la machinerie COPI nécessaire au transport rétrograde de l'appareil de Golgi vers le RE. Le but de ce travail était de déterminer si Memb11 pouvait interagir avec Arf1 dans les cellules végétales. Des anticorps dirigés contre la partie cytosolique de Memb11 ont été obtenus et ont été utilisés sur tissus végétaux pour réaliser des immunomarquages en microscopie électronique à transmission et des immunoprécipitations sur extraits de plantes. Il a été démontré que Memb11 est située au niveau de la membrane cis-golgienne et qu'elle co-immunoprécipite avec Arf1, suggérant ainsi que Arf1 peut interagir avec Memb11. J'ai confirmé l'interaction de Memb11 et Arf1 au niveau de l'appareil de Golgi par des expériences de BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) in vivo. Cette interaction est spécifique puisque ni Memb12 (90% d'identité avec Memb11) ni Sec22 interagissent avec Arf1. Grâce à une approche de bioinformatique structurale, j'ai déterminé les régions de Memb11 (différentes de Memb12) qui pourraient être critiques pour l'interaction et j’ai commencé à tester in vivo les mutants correspondants par BiFC. En outre, des expériences d’immunoprécipitations avec des protéines recombinantes produites in vitro suggèrent que la forme d’Arf1 liée au GTP interagit avec Memb11. / The SNARE proteins (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein REceptor) are critical for membrane fusion in the secretory pathway. I have studied the Golgi SNARE Memb11 in Arabidopsis thaliana cells. Memb11 is involved at the ER-Golgi interface. In mammalian cells, the ortholog of Memb11 (Membrin) is the potential “receptor” of the GTPase Arf1 in the Golgi membrane. This protein is involved for the recruitment of the COPI machinery, required for retrograde transport from the Golgi to the ER. The aim of this work was to determine whether Memb11 can interact with Arf1 in plant cells. Antibodies against the cytosolic part of Memb11 were obtained and were applied on plant tissues to perform immunolabeling by transmission electron microscopy and immunoprecipitation (IP) studies. It has been shown that Memb11 is located at the cis-Golgi and that it co-immunoprecipated with Arf1, suggesting that Arf1 may interact with Memb11. I confirmed the interaction of Memb11 and Arf1 at the Golgi by in vivo BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) experiments. This interaction was specific since neither Memb12 (90% identity with Memb11) nor Sec22 interacted with ARF1. Thanks to a structural bioinformatic approach, I determined the regions in Memb11 (different from Memb12) that could be critical for the interaction and started to test corresponding mutants in vivo by BiFC. In addition, IP experiments with recombinant proteins produced in vitro suggest that the GTP-bound form of ARF1 interacts with Memb11.

Les petites GTPases de la famille Arf, régulateurs majeurs du trafic membranaire, sont activé par plusieurs familles de facteurs d’échange nucléotidiques (ArfGEFs). Les ArfGEFs jouent un rôle essentiel dans l’intégration des signaux de régulation qui conduisent à l’activation d’Arf au niveau de compartiments cellulaires spécifiques, cependant les mécanismes par lesquels ils ciblent les Arfs activés aux membranes spécifiques et leur coordination avec l’échange de nucléotide reste peu comprise. Nous utilisons ici la cristallographie et la reconstitution des activités ArfGEF sur des membranes artificielles pour analyser ces mécanismes pour un ArfGEF humain atypique, impliqués dans l’endocytose de récepteurs et associé à l’invasion tumorale dans de nombreuses cellules cancéreuses. Les membres de cette famille ont été décrits comme des GEFs spécifique d’Arf6, et comporte un domaine de type PH après leur domaine Sec7. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous voulions savoir comment les isoformes Arf1 et Arf6 achevaient leurs fonctions dans la cellule. Arf1 et Arf6 sont très similaires: elles possèdent plus de 60% d’identité de séquence, et des études structurales ont montré que la surface qu’ils utilisent pour interagir avec leurs régulateurs et effecteurs est essentiellement identique en séquence et en structure. Cependant, elles ont des fonctions différentes dans la cellule et des propriétés différentes in vitro, pour lesquelles aucune donnée structurale n’a donné d’explications. Nous utilisons ici la cristallographie, le SAXS et la RMN pour comprendre la différence entre ces deux isoformes. / Small GTPases of the Arf family, which are pivotal regulators of membrane traffic in eukaryotes, are activated by several families of guanine nucleotide exchange factors (ArfGEFs). ArfGEfs play a key role in processing upstream regulatory signals that lead to Arf activation onto specific subcellular compartments, yet the mechanisms by which they target activated Arfs to specific membranes and their coordination with nucleotide exchange remain poorly understood. Here we used X-ray crystallography and reconstitution of ArfGEF activities on artificial membranes to analyze these mechanisms for an atypical human ArfGEF, involved in receptor endocytosis and associated with tumour invasion in various cancer cells. Members of this family have been described as Arf6-specific GEFs, and carry a PH-like domain downstream their Sec7 domain. In a second part of the work we wanted to know how the isoforms Arf1 and Arf6 achieve exquisitely specific functions in cells. Arf1 and Arf6 are highly similar: they have over 60% sequence identity, and structural studies have shown that the surfaces they use to interact with regulators and effectors are essentially identical in sequence and structure. Yet, they have non-overlapping functions in cells. Arf1 is a major regulator of most aspects of vesicular traffic, while Arf6 is restricted to the plasma membrane where it acts at the crossroads of trafficking and cytoskeleton functions (D'Souza-Schorey and Chavrier 2006). Consistent with their cellular specificities, Arf1 and Arf6 also have distinctive biochemical properties in vitro, for which no straightforward structural explanation has been put forward. Here we used X-ray crystallography, synchrotron SAXS experiments and NMR to assess the difference between these two isoforms.

La cellule eucaryote compartimentalise ses tâches au sein d’organelles communiquant les unes avec les autres au moyen de vésicules de transport. Le trafic vésiculaire est contrôlé par des petites protéines G de la superfamille Ras, activées par un changement de nucléotide guanidique catalysé par un facteur d’échange (GEF). En particulier, au niveau du cis-Golgi la petite protéine G Arf1 est activée par GBF1, permettant le transport rétrograde des vésicules COPI vers le réticulum endoplasmique. Récemment, GBF1 a été impliqué dans d’autres fonctions, notamment dans le cycle réplicatif de certains virus ou dans le métabolisme des gouttelettes lipidiques.Les gouttelettes lipidiques sont les organelles ubiquitaires du stockage des lipides et ont un rôle majeur dans l’homéostasie des lipides à l’échelle de la cellule. Le trafic intracellulaire des ces organelles dynamiques serait contrôlé par des petites protéines G. Notre équipe à montré dans une précédente étude que GBF1 est localisé sur les gouttelettes lipidiques et est impliqué dans le recrutement de PLIN2 et de la lipase ATGL sur les gouttelettes lipidiques. Cette thèse montre, par des études de biologie cellulaire et de microscopie, que GBF1 possède un domaine de fixation aux phospholipides via une hélice amphipatique. Cette hélice est nécessaire et suffisante pour l’association aux gouttelettes lipidiques in cellulo. La régulation de la localisation de GBF1 repose sur l’interaction avec Rab1B (cascade entre Rab1 et Arf1 dans la voie sécrétoire précoce) ainsi que sur les interactions intramoléculaires entre les différents domaines de GBF1. / The eukaryotic cell physically separates its functions within several membrane-bound organelles, which communicate using vesicles. Vesicular trafficking is under the control of small GTPases that exist as an inactive GDP-bound form and an active GTP-bound form. The switch between GDP and GTP is catalyzed by a guanine nucleotide exchange factor (GEF). On cis-Golgi membranes, Arf1, activated by the large GEF GBF1, recruits the COPI coat. COPI coated vesicles ensure the retrograde transport from the Golgi to the ER. Recently, GBF1 has been implicated in other pathways, such as the life cycle of various viruses and lipid droplet metabolism.Lipid droplets (LD), the major lipid storage organelle, play a major role in lipid homeostasis within the cell. LDs are connected to membrane trafficking and are therefore under the control of GTPases. In previous studies, our team showed that GBF1 localizes around LDs and that it is required for protein loading onto the LD surface. Here, data support the idea that GBF1 localizes to the LD surface. Using cell biology tools and microscopy, we identified, within GBF1, a lipid binding domain. In this domain, a single amphipathic helix is necessary and sufficient for LD targeting in cells. The regulation of GBF1 localization relies on interaction with Rab1 (data support a Rab1-Arf1 cascade between the ER and the Golgi) and on intramolecular interactions between GBF1 domains.

La formation d'un bourgeon vésiculaire repose sur une machinerie complexe qui déforme, par une action mécanique, une membrane plane en une membrane courbée. Le manteau COPI, responsable de ce phénomène dans le Golgi, se polymérise latéralement à la surface de la membrane, sous le contrôle de la petite protéine G Arf1 activée. Suite à la formation de la vésicule, Arf1 revient à l'état inactif par hydrolyse de son GTP et se dissocie de la membrane, provoquant alors le désassemblage du manteau. Cette réaction d'hydrolyse doit être finement régulée, pour ne pas intervenir trop tôt et compromettre l'assemblage du manteau. Notre laboratoire a révélé que l'activité de la protéine ArfGAP1, responsable de la désactivation d'Arf1, est hypersensible à la courbure membranaire. Ceci permettrait à ArfGAP1 de réguler de manière spatio-temporelle l'état du manteau COPI en couplant son désassemblage à la courbure membranaire qu'il a lui-même induite.<br />Au cours de ma thèse, j'ai montré que la dépendance d'ArfGAP1 à la courbure s'explique par la présence dans cette protéine de deux motifs « ALPS », qui se replient en hélices alpha lors de leur adsorption membranaire. Ce sont des hélices amphipathiques atypiques car, si elles possèdent une face hydrophobe classique, elles ont une face polaire riche en sérine et thréonine et pauvre en résidus chargés. Puisque ces résidus hydroxylés ne peuvent interagir avec les têtes polaires des lipides, la liaison d'un motif ALPS ne repose que sur l'insertion de ses résidus hydrophobes entre les lipides, ce qui est favorisé par l'écartement lipidique induit par la courbure membranaire, mais plus difficile sur membrane plane où les lipides sont plus compactés.

De nombreuses bactéries pathogènes piratent les machineries qui régulent le trafic cellulaire pour échapper à la réponse immunitaire de l’hôte ou faciliter leur multiplication. Les familles de petites protéines G Arf et Rab sont des régulateurs majeurs de la régulation du trafic intracellulaire et sont de ce fait des cibles privilégiées pour de nombreuses bactéries pathogènes. Ces pathogènes intracellulaires injectent dans leur cellule hôte des effecteurs capables d’imiter l’activité biochimique de leurs régulateurs pour activer, inhiber ou moduler l’activité des protéines. Ce projet porte sur l’étude de la famille de régulateurs bactériens RalF présents chez les bactéries Legionella pneumophila et Rickettsia prowazekii, les agents responsables de la maladie du Légionnaire et du typhus épidémique, respectivement. RalF possède un domaine catalytique apparenté à celui des facteurs d’échange eucaryotes dont le la fonction est d’activer la petite protéine G Arf. Cet effecteur bactérien agit comme un régulateur illégitime pour détourner les fonctions cellulaires de Arf1. L’objectif de cette thèse est de décrypter les mécanismes biophysiques, structuraux et dynamiques de régulation de la famille RalF pour comprendre les interactions protéine-protéine ou protéine- membrane impliqués dans le piratage de la fonction de Arf1. La combinaison d’études biochimiques et structurales nous ont permis de montrer que RalF est régulé par un cluster aromatique « senseur » de l’environnement lipidique lui permettant de localiser Arf1 à une membrane spécifique. / Many pathogenic bacteria highjack the cellular machineries that control cellular traffic in order to escape the host immune response, or to facilitate their replication. Small GTP-binding proteins (GTPases) of the Arf and Rab families, which are pivotal regulators in these processes, have thus been identified as targets for various human intracellular pathogens. To that purpose, these pathogens translocate bacterial effectors in the host cell, which mimics biochemical functions of their regulators to activate, inhibit or modulate of theses proteins. In this work, we study RalF, a family of bacterial regulators, which are translocated in host cells by the human intracellular pathogens Legionella pneumophila and Rickettsia prowazekii, which are responsible for Legionnaire’s disease and epidemic typhus, respectively. RalF possesses a catalytic domain related to eukaryotic exchange factors, which stimulate GDP/GTP exchange to activate small G-proteins Arf. This bacterial effector acts as an illegitimate regulator to divert cellular functions of Arf1. The aim of this work is to decipher biophysical, structural and dynamics regulation mechanisms of RalF family to understand the intramolecular protein-protein and protein-membrane interactions that underlie highjacking of Arf1 function. Using biochemical and structural analyses we showes how RalF is regulated by a membrane “sensor” to recruit Arf1 at specific membrane locations.

ARF6 et ARF1 sont des petites GTPases de la famille des ARF(s) qui régulent plusieurs voies de signalisation comprenant, la formation et le mouvement des vésicules, la transformation des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. À ce jour, le rôle de la protéine ARF6 et de la protéine ARF1 dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) dans les cellules endothéliales est encore très peu étudié. Le but de cette étude a été de caractériser le rôle de la protéine ARF6 dans la migration des cellules endothéliales induite par l’endothéline-1, ainsi que le rôle de la protéine ARF1 dans la sécrétion du monoxyde d’azote (NO) stimulées par le VEGF. Dans cette étude, nous montrons qu’ARF6 est essentielle à la migration des cellules endothéliales induite par l’endotheline-1. L’inhibition de l’expression d’ARF6 par interférence à l’ARN entraîne une activation marquée de la kinase FAK et son association constitutive avec Src. Par ailleurs, cette inhibition affecte l’association entre GIT1 et la kinase FAK. Ceci se traduit par une inhibition du désassemblage des contacts focaux et une augmentation de l’adhésion cellulaire menant à une diminution de la motilité. De plus, nos résultats montrent que la protéine ARF1 est essentielle à l’activation d’eNOS et à la sécrétion du NO suite à l’activation du VEGFR2 dans les cellules endothéliales BAEC. En effet, l’inhibition de l’expression d’ARF1 par interférence à l’ARN entraîne une inhibition du recrutement de la kinase Akt à la membrane plasmique et une inhibition de son activation induite par le VEGF. L’inhibition de l’activation de la kinase Akt par le VEGF conduit à une inhibition de l’activation de eNOS et de la sécrétion du NO. Dans l’ensemble, nos résultats montrent que les protéines ARF6 et ARF1 sont essentielles à la signalisation de l’ETB et du VEGFR2 pour les processus menant à la migration cellulaire et à la sécrétion du NO respectivement, deux évènements essentiels à l’angiogenèse. / ARF6 and ARF1 are small GTPases of the ARF family(s) that regulate several signalling pathways including vesicles trafficking, lipid membrane remodelling and actin cytoskeleton reorganization. To date, the role of ARF6 and ARF1 in GPCR and RTK signalling, in endothelial cells, is little known. In this thesis, we aimed to characterize the role of ARF6 in the migration of endothelial cells induced by Enodothelin-1, and the role of ARF1 in the secretion of NO induced by VEGF. We show that ARF6 is essential for endothelial cell migration induced by endothelin-1. Inhibition of ARF6 expression using RNA interference markedly impaired basal and ET-1 stimulated cell migration. In this condition, FAK is found constitutively associated with Src. In contrast, depletion of ARF6 impairs the ability of GIT1 to form an agonist-promoted complex with FAK, thereby preventing disassembly of focal adhesions. As a consequence, adhesion of ARF6-depleted endothelial cells is increased and their motility is reduced. Furthermore, our result shows that ARF1 GTPase is essential for the activation of eNOS and the secretion of NO following VEGFR2 activation in endothelial cells. Inhibition of ARF1 expression using RNA interference markedly impaired the recruitment of Akt to the plasma membrane and its phosphorylation by the VEGF. As a consequence, the inhibition of Akt leads to an inhibition of eNOS, a well known downstream target, which in turn leads to inhibition of NO production. All together, our results indicate that ARF6 and ARF1 are essential for the ETB and the VEGFR2 signalling leading to cell migration and NO secretion respectively, two required steps for angiogenesis.

ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) est une petite GTPase principalement connue pour son rôle dans la formation de vésicules au niveau de l’appareil de Golgi. Récemment, dans des cellules de cancer du sein, nous avons démontré qu’ARF1 est aussi un médiateur important de la signalisation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) contrôlant la prolifération, la migration et l'invasion cellulaire. Cependant, le mécanisme par lequel l’EGFR active la GTPase ainsi que le rôle de cette dernière dans la régulation de la fonction du récepteur demeure inconnue. Dans cette thèse, nous avions comme objectifs de définir le mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules de cancer du sein hautement invasif et démontrer que l’activation de cette isoforme de ARF joue un rôle essentiel dans la résistance de ces cellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nos études démontrent que les protéines d’adaptatrices Grb2 et p66Shc jouent un rôle important dans l'activation de ARF1. Alors que Grb2 favorise le recrutement d’ARF1 à l'EGFR ainsi que l'activation de cette petite GTPase, p66Shc inhibe le recrutement du complexe Grb2-ARF1 au récepteur et donc contribue à limiter l’activation d’ARF1. De plus, nous démontrons que ARF1 favorise la résistance aux inhibiteurs des tyrosines kinases dans les cellules de cancer du sein hautement invasif. En effet, une diminution de l’expression de ARF1 a augmenté la sensibilité descellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nous montrons également que de hauts niveaux de ARF1 contribuent à la résistance des cellules à ces médicaments en améliorant la survie et les signaux prolifératifs à travers ERK1/2, Src et AKT, tout en bloquant les voies apoptotiques (p38MAPK et JNK). Enfin, nous mettons en évidence le rôle de la protéine ARF1 dans l’apoptose en réponse aux traitements des inhibiteurs de l’EGFR. Nos résultats indiquent que la dépletion d’ARF1 promeut la mort cellulaire induite par gefitinib, en augmentant l'expression de facteurs pro-apoptotiques (p66shc, Bax), en altérant le potentiel de la membrane mitochondriale et la libération du cytochrome C. Ensemble, nos résultats délimitent un nouveau mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules du cancer du sein hautement invasif et impliquent l’activité d’ARF1 comme un médiateur important de la résistance aux inhibiteurs EGFR. / The small GTPase ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) has been well described for its role in regulating transport within the Golgi. Recently, in breast cancer cells, we have characterized ARF1 as important mediator of epidermal growth factor receptor (EGFR) signals leading to cell proliferation, migration and invasion. However, the mechanisms regulating ARF1 activity downstream of the EGFR had yet to be defined. Here, we aim to characterize these mechanisms of ARF1 activation in invasive breast cancer cells and demonstrate that activated ARF1 plays an essential role in mediating the resistance of breast cancer cells to EGFR tyrosine kinase inhibitors. We show that the adaptor proteins Grb2 and p66Shc regulate EGF-dependent ARF1 activation. While Grb2 was shown to be essential in the recruitment of ARF1 to the EGFR as well as the activation of this small GTPase, p66Shc blocked the recruitment of this Grb2-ARF1 complex to the receptor and thus suppressed EGF-induced ARF1 activation. Additionally, we demonstrate that ARF1 promotes EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance in invasive breast cancer cells. Indeed, the depletion of ARF1 was associated with an increased sensitivity to EGFR inhibition. We show that ARF1 promotes resistance by enhancing survival and proliferative signals through Erk1/2, Src and AKT, while blocking the apoptotic p38MAPK and JNK pathways. Furthermore, ARF1 was shown to stabilize EGFR dynamics (Expression, activation, dimerization and down-regulation) in response to treatment with EGFR inhibitors. Finally, we highlight the role of ARF1 in mediating mitochondrial-dependent apoptosis in response to EGFR tyrosine kinase inhibitor treatment. The depletion of ARF1 was shown to promote gefitinib-induced cell death as measured by increase expression of pro-apoptotic factors(p66Shc, Bax), altered mitochondrial membrane potential and cytochrome C release. Together, our results delineate a novel mechanism of ARF1 activation in breast cancer cells and implicate ARF1 activity as an important mediator of EGFR inhibitor resistance further supporting the importance of targeting this GTPase in breast cancer patients.