ARF6 et ARF1 sont des petites GTPases de la famille des ARF(s) qui régulent plusieurs voies de signalisation comprenant, la formation et le mouvement des vésicules, la transformation des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. À ce jour, le rôle de la protéine ARF6 et de la protéine ARF1 dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) dans les cellules endothéliales est encore très peu étudié. Le but de cette étude a été de caractériser le rôle de la protéine ARF6 dans la migration des cellules endothéliales induite par l’endothéline-1, ainsi que le rôle de la protéine ARF1 dans la sécrétion du monoxyde d’azote (NO) stimulées par le VEGF. Dans cette étude, nous montrons qu’ARF6 est essentielle à la migration des cellules endothéliales induite par l’endotheline-1. L’inhibition de l’expression d’ARF6 par interférence à l’ARN entraîne une activation marquée de la kinase FAK et son association constitutive avec Src. Par ailleurs, cette inhibition affecte l’association entre GIT1 et la kinase FAK. Ceci se traduit par une inhibition du désassemblage des contacts focaux et une augmentation de l’adhésion cellulaire menant à une diminution de la motilité. De plus, nos résultats montrent que la protéine ARF1 est essentielle à l’activation d’eNOS et à la sécrétion du NO suite à l’activation du VEGFR2 dans les cellules endothéliales BAEC. En effet, l’inhibition de l’expression d’ARF1 par interférence à l’ARN entraîne une inhibition du recrutement de la kinase Akt à la membrane plasmique et une inhibition de son activation induite par le VEGF. L’inhibition de l’activation de la kinase Akt par le VEGF conduit à une inhibition de l’activation de eNOS et de la sécrétion du NO. Dans l’ensemble, nos résultats montrent que les protéines ARF6 et ARF1 sont essentielles à la signalisation de l’ETB et du VEGFR2 pour les processus menant à la migration cellulaire et à la sécrétion du NO respectivement, deux évènements essentiels à l’angiogenèse. / ARF6 and ARF1 are small GTPases of the ARF family(s) that regulate several signalling pathways including vesicles trafficking, lipid membrane remodelling and actin cytoskeleton reorganization. To date, the role of ARF6 and ARF1 in GPCR and RTK signalling, in endothelial cells, is little known. In this thesis, we aimed to characterize the role of ARF6 in the migration of endothelial cells induced by Enodothelin-1, and the role of ARF1 in the secretion of NO induced by VEGF. We show that ARF6 is essential for endothelial cell migration induced by endothelin-1. Inhibition of ARF6 expression using RNA interference markedly impaired basal and ET-1 stimulated cell migration. In this condition, FAK is found constitutively associated with Src. In contrast, depletion of ARF6 impairs the ability of GIT1 to form an agonist-promoted complex with FAK, thereby preventing disassembly of focal adhesions. As a consequence, adhesion of ARF6-depleted endothelial cells is increased and their motility is reduced. Furthermore, our result shows that ARF1 GTPase is essential for the activation of eNOS and the secretion of NO following VEGFR2 activation in endothelial cells. Inhibition of ARF1 expression using RNA interference markedly impaired the recruitment of Akt to the plasma membrane and its phosphorylation by the VEGF. As a consequence, the inhibition of Akt leads to an inhibition of eNOS, a well known downstream target, which in turn leads to inhibition of NO production. All together, our results indicate that ARF6 and ARF1 are essential for the ETB and the VEGFR2 signalling leading to cell migration and NO secretion respectively, two required steps for angiogenesis.

Les facteurs d’ADP-ribosylation (ARFs) sont des petites GTPases impliquées dans le transport vésiculaire, la synthèse des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. Les isoformes 1 (ARF1) et 6 (ARF6) sont les plus étudiées. ARF1 est connue pour être distribuée à l’appareil de Golgi, alors qu’ARF6 est confinée principalement à la membrane plasmique. Récemment, il a été démontré qu’ARF6 est hautement exprimée et activée dans plusieurs cellules de cancer du sein invasif et que celle-ci contrôle les processus de migration et d’invasion. Cependant, le rôle d’ARF1 dans ces processus biologiques impliqués dans la formation de métastases du cancer du sein demeure méconnu. Dans la présente étude, nous avons utilisé comme modèle d’étude pour ARF1 les MDA-MB-231, une lignée de cellules invasives du cancer du sein exprimant de haut niveau de récepteurs au facteur de croissance épidermique (EGFR). Afin d’évaluer le rôle d’ARF1 dans la migration, dans la transition épithéliale mésenchymateuse (EMT) et dans la prolifération cellulaire, nous avons procédé à deux types d’approches expérimentales, soit l’inhibition de l’expression endogène d’ARF1 par l’interférence à l’ARN de même que la surexpression de formes mutantes dominante négative (ARF1T31N) et constitutivement active d’ARF1 (ARF1Q71L), qui miment les formes inactive et active de la GTPase, respectivement. De manière intéressante, la suppression d’ARF1 et la surexpression de la forme inactive d’ARF1 induisent l’arrêt de la migration et de la prolifération des MDA-MB-231 de manière dépendante à l’activation de l’EGFR et ce, en bloquant l’activation de la voie PI3Kinase. De plus, nous démontrons qu’ARF1, de même que les ARF GEFs Cytohésine-1 et Cytohésine-2, contribuent au phénotype invasif des cellules tumorales de cancer du sein. Dans les mêmes approches expérimentales, nous montrons que l’inactivation d’ARF1 dans les MDA-MB-231 déclenche un arrêt de croissance irréversible associé à l’induction de la sénescence et ce, en régulant la fonction de la protéine du rétinoblastome pRb. Enfin, cette étude a permis de mettre en évidence le rôle physiologique d’ARF1 dans les processus de migration et de prolifération cellulaire, deux événements biologiques responsables de la progression du cancer du sein. / The ADP-ribosylation factors (ARFs) are small GTPases involved in vesicular transport, lipids synthesis and cytoskeleton remodelling. The isoforms 1 (ARF1) and 6 (ARF6) are the most studied. ARF1 is classically distributed at the Golgi apparatus whereas ARF6 is found at the plasma membrane and onto recycling endosomes. It was recently demonstrated that ARF6 is highly expressed and activated in several breast cancer cell lines and is associated with enhanced migration and invasiveness. However, the role of ARF1, in these biologicals processes necessary for metastasis formation, remains unclear. In this study, we used MDA-MB-231 cells, an invasive breast cancer cell line, that expressed high levels of EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) to investigate the role of ARF1 in migration and proliferation. To further establish the role of ARF1 in cell migration, EMT and proliferation, we used two experimental approaches. First, we decreased endogenous ARF1 expression by RNA interference and second we overexpressed the dominant negative (ARF1T31N) and constitutively active (ARF1Q71L) ARF1 mutants, which mimick the inactive and active forms of ARF1, respectively. We demonstrated that depletion of ARF1 as well as overexpression of the inactive form of ARF1 blocked EGFR-mediated cell migration and proliferation by inhibiting the activation of PI3Kinase. Moreover, we showed, using invasive and non invasive breast cancer cell lines, that ARF1 and both Cytohesin-1 and Cytohesin-2 are required for invasivness. Using similar approaches, we reported that inactivation of ARF1 in MDA-MB-231 cells promotes cell growth arrest associated to senescence program by regulating the function of the Retinoblastoma protein pRb. Altogether, these findings demonstrate a physiological role for ARF1 in cell migration and proliferation. These two biologicals events are necessary for breast cancer progression.

Les facteurs d’ADP-ribosylation (ARFs) sont des petites GTPases impliquées dans le transport vésiculaire, la synthèse des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. Les isoformes 1 (ARF1) et 6 (ARF6) sont les plus étudiées. ARF1 est connue pour être distribuée à l’appareil de Golgi, alors qu’ARF6 est confinée principalement à la membrane plasmique. Récemment, il a été démontré qu’ARF6 est hautement exprimée et activée dans plusieurs cellules de cancer du sein invasif et que celle-ci contrôle les processus de migration et d’invasion. Cependant, le rôle d’ARF1 dans ces processus biologiques impliqués dans la formation de métastases du cancer du sein demeure méconnu. Dans la présente étude, nous avons utilisé comme modèle d’étude pour ARF1 les MDA-MB-231, une lignée de cellules invasives du cancer du sein exprimant de haut niveau de récepteurs au facteur de croissance épidermique (EGFR). Afin d’évaluer le rôle d’ARF1 dans la migration, dans la transition épithéliale mésenchymateuse (EMT) et dans la prolifération cellulaire, nous avons procédé à deux types d’approches expérimentales, soit l’inhibition de l’expression endogène d’ARF1 par l’interférence à l’ARN de même que la surexpression de formes mutantes dominante négative (ARF1T31N) et constitutivement active d’ARF1 (ARF1Q71L), qui miment les formes inactive et active de la GTPase, respectivement. De manière intéressante, la suppression d’ARF1 et la surexpression de la forme inactive d’ARF1 induisent l’arrêt de la migration et de la prolifération des MDA-MB-231 de manière dépendante à l’activation de l’EGFR et ce, en bloquant l’activation de la voie PI3Kinase. De plus, nous démontrons qu’ARF1, de même que les ARF GEFs Cytohésine-1 et Cytohésine-2, contribuent au phénotype invasif des cellules tumorales de cancer du sein. Dans les mêmes approches expérimentales, nous montrons que l’inactivation d’ARF1 dans les MDA-MB-231 déclenche un arrêt de croissance irréversible associé à l’induction de la sénescence et ce, en régulant la fonction de la protéine du rétinoblastome pRb. Enfin, cette étude a permis de mettre en évidence le rôle physiologique d’ARF1 dans les processus de migration et de prolifération cellulaire, deux événements biologiques responsables de la progression du cancer du sein. / The ADP-ribosylation factors (ARFs) are small GTPases involved in vesicular transport, lipids synthesis and cytoskeleton remodelling. The isoforms 1 (ARF1) and 6 (ARF6) are the most studied. ARF1 is classically distributed at the Golgi apparatus whereas ARF6 is found at the plasma membrane and onto recycling endosomes. It was recently demonstrated that ARF6 is highly expressed and activated in several breast cancer cell lines and is associated with enhanced migration and invasiveness. However, the role of ARF1, in these biologicals processes necessary for metastasis formation, remains unclear. In this study, we used MDA-MB-231 cells, an invasive breast cancer cell line, that expressed high levels of EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) to investigate the role of ARF1 in migration and proliferation. To further establish the role of ARF1 in cell migration, EMT and proliferation, we used two experimental approaches. First, we decreased endogenous ARF1 expression by RNA interference and second we overexpressed the dominant negative (ARF1T31N) and constitutively active (ARF1Q71L) ARF1 mutants, which mimick the inactive and active forms of ARF1, respectively. We demonstrated that depletion of ARF1 as well as overexpression of the inactive form of ARF1 blocked EGFR-mediated cell migration and proliferation by inhibiting the activation of PI3Kinase. Moreover, we showed, using invasive and non invasive breast cancer cell lines, that ARF1 and both Cytohesin-1 and Cytohesin-2 are required for invasivness. Using similar approaches, we reported that inactivation of ARF1 in MDA-MB-231 cells promotes cell growth arrest associated to senescence program by regulating the function of the Retinoblastoma protein pRb. Altogether, these findings demonstrate a physiological role for ARF1 in cell migration and proliferation. These two biologicals events are necessary for breast cancer progression.

Les petites GTPases de la famille Arf, régulateurs majeurs du trafic membranaire, sont activé par plusieurs familles de facteurs d'échange nucléotidiques (ArfGEFs). Les ArfGEFs jouent un rôle essentiel dans l'intégration des signaux de régulation qui conduisent à l'activation d'Arf au niveau de compartiments cellulaires spécifiques, cependant les mécanismes par lesquels ils ciblent les Arfs activés aux membranes spécifiques et leur coordination avec l'échange de nucléotide reste peu comprise. Nous utilisons ici la cristallographie et la reconstitution des activités ArfGEF sur des membranes artificielles pour analyser ces mécanismes pour un ArfGEF humain atypique, impliqués dans l'endocytose de récepteurs et associé à l'invasion tumorale dans de nombreuses cellules cancéreuses. Les membres de cette famille ont été décrits comme des GEFs spécifique d'Arf6, et comporte un domaine de type PH après leur domaine Sec7. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous voulions savoir comment les isoformes Arf1 et Arf6 achevaient leurs fonctions dans la cellule. Arf1 et Arf6 sont très similaires: elles possèdent plus de 60% d'identité de séquence, et des études structurales ont montré que la surface qu'ils utilisent pour interagir avec leurs régulateurs et effecteurs est essentiellement identique en séquence et en structure. Cependant, elles ont des fonctions différentes dans la cellule et des propriétés différentes in vitro, pour lesquelles aucune donnée structurale n'a donné d'explications. Nous utilisons ici la cristallographie, le SAXS et la RMN pour comprendre la différence entre ces deux isoformes.

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