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Análise da expressão dos genes relacionados à assimilação do nitrato na levedura Dekkera Bruxellensis

PITA, Will de Barros 31 January 2009 (has links)
Made available in DSpace on 2014-06-12T18:02:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3634_1.pdf: 1182297 bytes, checksum: 555f62e24f992ab833cb18ef506968ae (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A levedura Dekkera bruxellensis foi identificada como principal contaminante dos processos de fermentação alcoólica em destilarias do Brasil, do Canadá e dos EUA. Contagens elevadas desta levedura podem resultar em diminuição da produtividade etanólica, com conseqüente prejuízo econômico. Recentemente, esta levedura teve seu genoma parcialmente seqüenciado e foram identificadas seqüências correspondentes a genes do metabolismo do nitrato. A presença de tais genes indica que D. bruxellensis possa usufruir deste composto como fonte de nitrogênio, ao contrário de Saccharomyces cerevisiae, durante o processo fermentativo. Como estas leveduras competem no ambiente industrial, a presença de nitrato poderia ser um fator diferencial na adaptação de D. bruxellensis, visto que esta fonte pode estar presente no caldo de cana proveniente do processo de adubação da cana de açúcar. Assim, os objetivos deste trabalho foram analisar o perfil de expressão dos genes da via metabólica do nitrato de D. bruxellensis em meios laboratoriais e verificar se esta levedura expressa estes genes em caldo de cana industrial utilizando a técnica de PCR quantitativa (qPCR). As células de D. bruxellensis foram cultivadas em meios sintéticos contendo glicose como fonte de carbono na presença de amônia, de nitrato ou ambas as fontes. As células foram coletadas em pontos específicos para extração do RNA, síntese de cDNA e analise por qPCR utilizando o método 2-ΔΔCt para quantificação da expressão gênica. Como controle endógeno foi empregado o gene EFA1. Todos os quatro genes estudados apresentaram indução de sua expressão na presença de nitrato e foram sujeitos à repressão catabólica do nitrogênio quando a amônia estava presente no meio. Adicionalmente, a presença e o consumo de nitrato no caldo de cana foram investigados. Neste substrato, os genes apresentaram perfil de expressão diferente do observado nos meios YNB. O nitrato foi detectado no caldo de cana e seu consumo ao longo do tempo foi determinado. Este estudo comprova que os genes da assimilação do nitrato em D. bruxellensis são induzidos em presença deste composto e reprimidos na presença de amônia. As células de D. bruxellensis expressaram estes genes no caldo de cana. Entretanto, maiores estudos acerca da regulação da expressão dos genes desta via metabólica ainda são necessários para correlacionar esta expressão com a adaptação de D. bruxellensis no meio de fermentação alcoólica
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Regulação da fotossíntese por deficiência hídrica, nitrogênio e CO2 elevado em cana-de-açúcar / Regulation of photosynthesis by water stress, nitrogen and elevated CO2 in cane sugar

Martins, Márcio de Oliveira January 2012 (has links)
MARTINS, Márcio de Oliveira. Regulação da fotossíntese por deficiência hídrica, nitrogênio e CO2 elevado em cana-de-açúcar. 2012. 96 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-20T17:40:23Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_momartins.pdf: 859711 bytes, checksum: e1c5c268123078bb8c6164fa1491d1f2 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T17:44:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_momartins.pdf: 859711 bytes, checksum: e1c5c268123078bb8c6164fa1491d1f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T17:44:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_momartins.pdf: 859711 bytes, checksum: e1c5c268123078bb8c6164fa1491d1f2 (MD5) Previous issue date: 2012 / Sugarcane is plant of great economic potential, mainly utilized to sugar and biofuel production. Brazil has an international importance, leading the world production of this culture. In despite of this high production, Brazil is located in a tropical region and presents several climatic adversities. The study of sugarcane physiology in stress situations, like water deficit, becomes essential to maintenance and improvement of the production. Sugarcane is a C4 species, with a CO2 concentration mechanism. It is expected that the growing elevation of CO2 in the atmosphere does not the sugarcane productivity in a relevant way but the studies about this subject are very scarce. Thus, it was aimed to evaluate the photosynthesis regulation by water deficit, nitrogen supply and high CO2 in sugarcane plants. Chapter 1 contains the state of the art concerning the study theme. In the chapter 2, it was performed an work in order to evaluate the responses to water deficit of two sugarcane cultivars considered contrasting about water deficit, IAC SP 94-2094 and IAC SP 95-5000. These cultivars were exposed to severe water deficit, with withholding water for five days, and recovery, irrigated after for two days after stress. The applied treatment strongly affected the gas exchanges, with stomatal closure in both cultivars, leading to great reductions in transpiration and CO2 assimilation. The chlorophyll a fluorescence parameters were affected, but without photoinhibition. Tolerant cultivar showed higher PEPcase activity in stress, but Rubisco activity was not altered. In the sensitive cultivar there was not alteration in the PEPcase activity whereas Rubisco activity was reduced 40% in stress but totally recovered. PEPcase expression was increased in stress but with a higher increment in sensitive cultivar, with a similar pattern in the Rubisco amount. In the chapter 3, it was performed an work in order to evaluate the antioxidative system in sugarcane plants exposed to mild water stress. In this chapter, IAC SP 94-2094 was utilized and the water deficit was applied with irrigation cycles, with plants irrigated each five days for fifteen days and recovery for three days. Water stress applied caused remarkable decreases in the stomatal conductance, leaf transpiration and net photosynthesis, with partial recovery, causing lower water use and carboxylation efficiencies. Photochemical parameters showed transient changes completely reversible by recovery. PEPcase and Rubisco activities did not show modifications but it was increase in the relative amount of PEPcase and Rubisco activation state. Water stress increased the lipid peroxidation and H2O2 content, inducing increases in SOD and APX activities, mainly thylakoidal APX and Fe-SOD. Sugars profile was altered in stressed plants, with increase in hexoses and decrease in starch content in leaves. The aim of the chapter 4 was evaluate the physiological and biochemical changes in concern to photosynthetic processes in sugarcane exposed to high CO2 and low supply of nitrogen (-N). Net photosynthesis was reduced in plants subjected to high CO2 and -N. Photochemical parameters were decreased only in -N treatment, but with no photoinhibition. Carboxylation enzymes, PEPcase and Rubisco, did suffer differential regulations either by high CO2 or by low nitrogen. Nitrate determination showed accumulation in roots, indicating deficiency in transport to shoot. -N treatment decreased the amino acids content, soluble proteins and total nitrogen. Sucrose content was reduced in all treatments. At last, it was verified that IAC SP 94-2094 cultivar has more photoprotection indicated by higher NPQ and more PEPcase activity and expression, conferring a better performance in severe water deficit periods. When studied under mild water stress, the plants showed an organized anti-oxidative defense for protection against reactive oxygen species. When under high CO2, sugarcane plants exhibit stomatal and biochemical changes, reducing the photosynthetic activity by reduction in nitrate assimilation and nitrate reductase activity, showing a strong relation between carbon and nitrogen assimilation. / A cana-de-açúcar é uma planta de grande potencial econômico, sendo utilizada principalmente para produção de açúcar e biocombustíveis. O Brasil tem destaque internacional na produção de cana-de-açúcar, sendo o maior produtor mundial dessa cultura. Apesar dessa liderança, o Brasil está localizado em uma região tropical e apresenta várias adversidades climáticas. O estudo da fisiologia da cana-de-açúcar em situações de estresse, como deficiência hídrica, torna-se fundamental para manutenção e melhoria da produção dessa cultura. A cana-de-açúcar é uma espécie de fotossíntese C4, com um mecanismo de concentração de CO2. Dessa maneira, espera-se que a crescente elevação de CO2 na atmosfera não afete a produtividade da cana-de-açúcar de maneira relevante, mas os estudos acerca do assunto são ainda bem escassos. Diante desse quadro, objetivou-se avaliar a regulação da fotossíntese por deficiência hídrica, suprimento de nitrogênio e CO2 elevado em plantas de cana-de-açúcar. O Capítulo 1 comtempla o estado da arte a respeito do tema em estudo. No capítulo 2, foi realizado um trabalho com o objetivo de avaliar as respostas de duas cultivares de cana-de-açúcar consideradas contrastantes em relação às respostas à deficiência hídrica, IAC SP 94-2094 e IAC SP 95-5000. Estas cultivares foram expostas a déficit hídrico severo, com suspensão da irrigação por cinco dias, e recuperação, reirrigadas por dois dias após o estresse. O tratamento aplicado foi capaz de afetar fortemente as trocas gasosas, com fechamento estomático nas duas cultivares, levando a fortes reduções de transpiração e assimilação de CO2. Os parâmetros da fluorescência da clorofila a foram afetados, mas não o suficiente para apresentar fotoinibição. A cultivar tolerante apresentou maior atividade de PEPcase no estresse, mas a atividade de Rubisco não foi alterada. Na cultivar sensível, não houve alteração na atividade de PEPcase enquanto que a atividade de Rubisco foi reduzida em 40% no estresse mas com total recuperação. A expressão de PEPcase foi aumentada no estresse mas com maior incremento na cultivar tolerante, com padrão semelhante na quantidade de rubisco. No capítulo 3, foi realizado um trabalho com o objetivo de avaliar o sistema de defesa anti-oxidativo em plantas de cana-de-açúcar expostas ao estresse hídrico moderado. Neste capítulo, apenas a cultivar IAC SP 94-2094 foi utilizada e a deficiência hídrica foi aplicada através de ciclos de irrigação, com plantas irrigadas a cada cinco dias por um período de 15 dias e recuperação de três dias. O estresse hídrico aplicado causou reduções marcantes na condutância estomática, na transpiração foliar e na fotossíntese líquida, com recuperação parcial, refletindo em uma menor eficiência do uso da água e eficiência de carboxilação. Os parâmetros fotoquímicos apresentaram modificações transitórias, completamente revertidas pela recuperação. As atividades da Rubisco e PEPcase não mostraram modificações, mas houve aumento na quantidade relativa de PEPcase e estado de ativação da Rubisco. O estresse hídrico aplicado aumentou a peroxidação lipídica e o conteúdo de H2O2, induzindo aumentos de atividades de SOD e APX, principalmente APX tilacoidal e Fe-SOD. O perfil de açúcares foi alterado nas plantas estressadas, com aumento de hexoses e diminuição do teor de amido nas folhas. O objetivo do capítulo 4 foi avaliar as modificações fisiológicas e bioquímicas em relação aos processos fotossintéticos em cana-de-açúcar submetida a um ambiente de elevado CO2 e baixo suprimento de nitrogênio (-N). A fotossíntese líquida foi reduzida nas plantas com CO2 elevado e -N. Os parâmetros fotoquímicos foram reduzidos apenas no tratamento -N, mas sem sinal de fotoinibição. As enzimas da carboxilação, PEPcase e Rubisco, sofreram regulações diferenciadas, tanto pelo alto CO2 como pelo baixo suprimento de nitrogênio. A determinação de nitrato mostrou acúmulo nas raízes, indicando deficiência no transporte para parte aérea. O tratamento –N diminuiu o conteúdo de aminoácidos, proteínas solúveis e nitrogênio total. O teor de sacarose foi reduzido em todos os tratamentos. Por fim, verificamos que a cultivar IAC SP 94-2094 possui maior fotoproteção indicada pelo maior NPQ e possui ainda maior atividade e expressão de PEPcase, permitindo melhor performance em períodos de déficit hídrico severo. Quando estudada com déficit hídrico moderado, as plantas desta cultivar apresentaram uma organizada defesa anti-oxidativa para proteção contra as espécies reativas de oxigênio. Quando sob elevada concentração de CO2, as plantas de cana-de-açúcar exibem modificações estomáticas e bioquímicas, reduzindo a atividade fotossintética pela redução da assimilação de nitrato e atividade de redutase do nitrato, mostrando uma forte relação entre a assimilação de carbono e nitrogênio.

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