VASCONCELOS, Eliane Silva Araújo de. Proteases do látex de Calotropis procera: purificação, caracterização bioquímica, enzimática e molecular e atividades biológicas. 2013. 140 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2013. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-09-02T11:59:28Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_esaraujo.pdf: 2565494 bytes, checksum: 4d162fd198a10a8d88c2c3e0811e739d (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-05T20:30:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_esaraujo.pdf: 2565494 bytes, checksum: 4d162fd198a10a8d88c2c3e0811e739d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T20:30:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_esaraujo.pdf: 2565494 bytes, checksum: 4d162fd198a10a8d88c2c3e0811e739d (MD5) Previous issue date: 2013 / Studies have shown that latex of plants is a rich source of enzymes with proteolytic activities. Isolation and characterization of cysteine proteases of latex have recently been reported. In this work we report the purification and characterization of three new cysteine proteases of laticifer fluid of Calotropis procera, as well as its activity in plasma coagulation assays. The three proteases, termed CpCP-1, 2-CpCP and CpCP-3 are isoforms of cysteine proteases and were purified using two sequential steps of ion exchange chromatography on CM-Sepharose and Resource S columns, coupled to FPLC system. Their molecular masses were determined by ESI-Q-TOF mass spectrometry: CPCP-1 had mass = 26.213, CPCP-2 = 26.133 and CPCP-3 = 25.086 Da. The amino acid sequences of the N-terminal region was identical for all three enzymes, being composed of 30 amino acid residues. Analysis revealed high sequence identity with others cysteine proteases. The proteolytic activity of these enzymes was tested against different substrates (azocasein, BANA and BApNA) and at different pH and temperature. The three enzymes are capable of degrading azocasein and BANA, substrates nonspecific and specific for cysteine proteases, respectively. CPCP-1 showed proteolytic activity twice that CPCP-3, and this, a little bigger than CPCP-2. Enzymes maintained 60-80% of their activities even when tested at 60 °C temperature, and the optimum pH for these activities was 6.0. Circular Dichroism Analysis showed that the secondary structure of the proteases was composed of 15.1 to 19.9% of alpha-helices and 20.6 to 21.3% of beta-sheets. The spectra deconvolution of proteases showed that their structures were altered in the presence of the reducing agent DTT, suggesting the presence of disulfide bridges stabilizing the three dimensional structures. In biological tests proteases were able to strongly inhibit the germination of spores of the fungus Colletotrichum gloeosporioides and also exhibited plasma coagulation activity by thrombin-like mechanism. / Estudos têm demonstrado que látex de plantas é uma rica fonte de enzimas com atividades proteolíticas. O isolamento e a caracterização de proteases cisteínicas de látex têm sido recentemente relatados. Neste trabalho nós reportamos a purificação e caracterização de três novas proteases cisteínicas do fluido laticífero de Calotropis procera, bem como sua atividade em ensaios de coagulação plasmática. As três proteases, denominadas CpCP-1, CpCP-2 e CpCP-3 são isoformas de proteases cisteínicas e foram purificadas utilizando dois passos sequenciais de cromatografias de troca iônica em colunas de CM-Sepharose e Resource S, acoplada a sistema FPLC. Suas massas moleculares foram determinadas por espectrometria de massas em aparelho do tipo ESI-Q-TOF, onde: CpCP-1 apresentou massa=26,213, CpCP-2=26,133 e CpCP-3=25,086. A sequência de aminoácidos da região N-terminal foi idêntica para as três enzimas, sendo constituída de 30 resíduos de aminoácidos. Análises de sequências revelaram alto nível de identidade (88%) com proteases cisteínicas A atividade proteolítica dessas enzimas foi testada frente a diferentes substratos (Azocaseína, BANA e BApNA) e em diferentes valores de pH e temperatura. As três enzimas foram capazes de degradar Azocaseína e BANA, substratos inespecífico e específico para proteases cisteínicas, respectivamente. CpCP-1 apresentou atividade proteolítica duas vezes maior que CpCP-3, e esta, um pouco maior que CpCP-2. As enzimas mantiveram 60-80% de suas atividades mesmo quando ensaiadas a 60ºC de temperatura, e o pH ótimo para essas atividades foi 6,0. Análises de Dicroísmo Circular revelaram que a estrutura secundária das proteases era composta de 15,1-19,9% de alfa-hélices e 20,6-21,3% de folhas-beta. Os espectros de desconvolução das proteases mostrou que suas estruturas foram alteradas na presença do agente redutor DTT, sugerindo a presença de pontes dissulfeto na estabilização das estruturas tridimensionais. Em testes biológicos as proteases foram capazes de inibir fortemente a germinação de esporos do fungo Colletotrichum gloesporioides e também exibiram atividade de coagulação plasmática por um mecanismo do tipo trombina.