SILVA, Maria Zelandia Rocha. Isolamento em cromatografia de imunoafinidade e atividade antifúngica de osmotinas de fluidos laticíferos. 2015. 85 f. Dissertação (Mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-09-01T19:36:22Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_mzrsilva.pdf: 2515574 bytes, checksum: 4dcf1607c0ce726fde9bddf9f92b2d80 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-02T20:25:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_mzrsilva.pdf: 2515574 bytes, checksum: 4dcf1607c0ce726fde9bddf9f92b2d80 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T20:25:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_mzrsilva.pdf: 2515574 bytes, checksum: 4dcf1607c0ce726fde9bddf9f92b2d80 (MD5) Previous issue date: 2015 / Plants are constantly exposed to a variety of stresses conditions. However, they react to biotic stresses by triggering a set of defense mechanisms including the synthesis of defensive substances as the pathogenesis-related (PR) proteins. The PR-protein named osmotin can be induced under osmotic stress and water shortage conditions. Osmotin-like proteins have been purified from latex and some of them are related to antifungal activity. The aim of this study was to investigate the osmotin in the following species laticifers: C. grandiflora, P. rubra, T. peruviana, H. drasticus and C. papaya to isolate and evaluate its antifungal activities. Immunoaffinity column chromatography with anti-CpOsm antibodies were performed in order to purify these osmotin-like. They were detected in latex of C. grandiflora and P. rubra by immunoassays the ELISA, Dot Blot and Western Blot using anti-CpOsm antibody (the osmotin of C. procera latex). Osmotin of C. procera, C. grandiflora, P. rubra and H. drasticus were identified by mass spectrometry. However, the osmotin from C. procera was co-purified with cysteine proteases. The co-purified cysteine protease from C. procera was identified as Procerain B. The alignment and the 3-D structure analysis of Procerain B and CpOsm revealed the presence of a similar sequence in both proteins. This sequence might be an epitope which allows the anti-antibody recognition. The osmotin from C. grandiflora, and P. rubra did not show antifungal activity against Fusarium solani and Colletotrichum gloesporioides. Since no correlation between the antifungal activity and the presence of these osmotins were found, the proteolytic activities of these latex protein fractions were evaluated in order to correlate with the antifungal activity C. procera and C. grandiflora showed a strong proteolytic activity. In latex, the cysteine proteases are more often related to antifungal activity than osmotin, which might explain, at least in part, the antifungal activity performed by C. grandifora and not for its osmotin. Further studies on the role of osmotin in physiology laticifers plants are needed. / As plantas estão constantemente sujeitas a diversos tipos de estresse, tanto bióticos como abióticos, resultando em respostas de defesa. Decorrente disto, os vegetais sintetizam certas proteínas denominadas de proteínas relacionadas à patogênese (PR proteína). As Pr-proteínas chamadas de osmotinas podem ser induzidas sob condições de estresse osmótico, frio e escassez de água. Osmotinas tem sido purificadas de fluidos laticíferos e algumas delas estão relacionadas com a atividade antifúngica. O objetivo do presente trabalho foi prospectar osmotinas, bem como isolá- las e avaliar suas atividades antifúngicas, nos fluidos laticíferos das seguintes espécies: C. grandiflora, P. rubra, T. peruviana, H. drasticus e C. papaya. Nos látex de C. grandiflora e P. rubra foram detectadas osmotinas através de imunoensaios em placa de ELISA, Dot Blot e Westen Blot, utilizando os anticorpos anti-CpOsm (osmotina do látex de C. procera). Cromatografia de imunoafinidade em coluna com anticorpos anti-CpOsm foram realizadas com o intuito de purificar estas osmotinas. Análises por meio de espectrometria de massas, revelaram a presença de osmotina em C. procera, C. grandiflora, P. rubra e H. drasticus. No entanto, a osmotina de C. procera foram co-purificadas com proteases cisteínicas. A protease cisteínica co- purificada no látex de C. procera foi identificada como Proceraina B. O alinhamento e a análise da estrutura tridimensional da Proceraina B e CpOsm revelaram a presença de uma sequência semelhante em ambas as proteínas, que pode ser um epítopo disponível ao reconhecimento do anticorpo anti-CpOsm. As osmotinas isoladas de C. grandiflora e P. rubra não apresentaram atividade antifúngica contra F. solani e C. gloesporioides. Desde que não houve correlação entre a atividade antifúngica e à presença destas osmotinas, as atividades proteolíticas das frações proteicas foram avaliadas a fim de correlaciona-las à atividade antifúngica. Nos fluidos laticíferos, as proteases cisteínicas estão mais frequentemente relacionadas à atividade antifúngica do que as osmotinas. Estudos mais aprofundados sobre a função das osmotinas na fisiologia de plantas laticíferas são necessários.

VASCONCELOS, Eliane Silva Araújo de. Proteases do látex de Calotropis procera: purificação, caracterização bioquímica, enzimática e molecular e atividades biológicas. 2013. 140 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2013. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-09-02T11:59:28Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_esaraujo.pdf: 2565494 bytes, checksum: 4d162fd198a10a8d88c2c3e0811e739d (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-05T20:30:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_esaraujo.pdf: 2565494 bytes, checksum: 4d162fd198a10a8d88c2c3e0811e739d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T20:30:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_esaraujo.pdf: 2565494 bytes, checksum: 4d162fd198a10a8d88c2c3e0811e739d (MD5) Previous issue date: 2013 / Studies have shown that latex of plants is a rich source of enzymes with proteolytic activities. Isolation and characterization of cysteine proteases of latex have recently been reported. In this work we report the purification and characterization of three new cysteine proteases of laticifer fluid of Calotropis procera, as well as its activity in plasma coagulation assays. The three proteases, termed CpCP-1, 2-CpCP and CpCP-3 are isoforms of cysteine proteases and were purified using two sequential steps of ion exchange chromatography on CM-Sepharose and Resource S columns, coupled to FPLC system. Their molecular masses were determined by ESI-Q-TOF mass spectrometry: CPCP-1 had mass = 26.213, CPCP-2 = 26.133 and CPCP-3 = 25.086 Da. The amino acid sequences of the N-terminal region was identical for all three enzymes, being composed of 30 amino acid residues. Analysis revealed high sequence identity with others cysteine proteases. The proteolytic activity of these enzymes was tested against different substrates (azocasein, BANA and BApNA) and at different pH and temperature. The three enzymes are capable of degrading azocasein and BANA, substrates nonspecific and specific for cysteine proteases, respectively. CPCP-1 showed proteolytic activity twice that CPCP-3, and this, a little bigger than CPCP-2. Enzymes maintained 60-80% of their activities even when tested at 60 °C temperature, and the optimum pH for these activities was 6.0. Circular Dichroism Analysis showed that the secondary structure of the proteases was composed of 15.1 to 19.9% of alpha-helices and 20.6 to 21.3% of beta-sheets. The spectra deconvolution of proteases showed that their structures were altered in the presence of the reducing agent DTT, suggesting the presence of disulfide bridges stabilizing the three dimensional structures. In biological tests proteases were able to strongly inhibit the germination of spores of the fungus Colletotrichum gloeosporioides and also exhibited plasma coagulation activity by thrombin-like mechanism. / Estudos têm demonstrado que látex de plantas é uma rica fonte de enzimas com atividades proteolíticas. O isolamento e a caracterização de proteases cisteínicas de látex têm sido recentemente relatados. Neste trabalho nós reportamos a purificação e caracterização de três novas proteases cisteínicas do fluido laticífero de Calotropis procera, bem como sua atividade em ensaios de coagulação plasmática. As três proteases, denominadas CpCP-1, CpCP-2 e CpCP-3 são isoformas de proteases cisteínicas e foram purificadas utilizando dois passos sequenciais de cromatografias de troca iônica em colunas de CM-Sepharose e Resource S, acoplada a sistema FPLC. Suas massas moleculares foram determinadas por espectrometria de massas em aparelho do tipo ESI-Q-TOF, onde: CpCP-1 apresentou massa=26,213, CpCP-2=26,133 e CpCP-3=25,086. A sequência de aminoácidos da região N-terminal foi idêntica para as três enzimas, sendo constituída de 30 resíduos de aminoácidos. Análises de sequências revelaram alto nível de identidade (88%) com proteases cisteínicas A atividade proteolítica dessas enzimas foi testada frente a diferentes substratos (Azocaseína, BANA e BApNA) e em diferentes valores de pH e temperatura. As três enzimas foram capazes de degradar Azocaseína e BANA, substratos inespecífico e específico para proteases cisteínicas, respectivamente. CpCP-1 apresentou atividade proteolítica duas vezes maior que CpCP-3, e esta, um pouco maior que CpCP-2. As enzimas mantiveram 60-80% de suas atividades mesmo quando ensaiadas a 60ºC de temperatura, e o pH ótimo para essas atividades foi 6,0. Análises de Dicroísmo Circular revelaram que a estrutura secundária das proteases era composta de 15,1-19,9% de alfa-hélices e 20,6-21,3% de folhas-beta. Os espectros de desconvolução das proteases mostrou que suas estruturas foram alteradas na presença do agente redutor DTT, sugerindo a presença de pontes dissulfeto na estabilização das estruturas tridimensionais. Em testes biológicos as proteases foram capazes de inibir fortemente a germinação de esporos do fungo Colletotrichum gloesporioides e também exibiram atividade de coagulação plasmática por um mecanismo do tipo trombina.

Espécies de Ficus e suas vespas polinizadoras representam um dos sistemas mutualísticos mais especializados e estudados atualmente, no qual cada representante depende diretamente do outro para sua reprodução. As vespas que recém-emergem de um figo carregam grãos de pólen em seu corpo e são atraídas pelo odor produzido no sicônio (= inflorescência), em fase receptiva, de outro indivíduo. Ao entrar no sicônio através de sua abertura (ostíolo), as vespas não só depositam seus ovos, como também polinizam as flores femininas abertas, iniciando um novo ciclo de vida. Apesar de inúmeros estudos envolvendo questões químicas, filogenéticas, ecológicas, coevolutivas e reprodutivas desse mutualismo, são raros os estudos abrangendo a anatomia do sicônio e as estruturas secretoras presentes nesta inflorescência. Assim, o objetivo deste trabalho consistiu em localizar e caracterizar as estruturas secretoras ativas em sicônios em fase receptiva de nove espécies, representando diferentes linhagens do gênero, esperando-se encontrar as glândulas responsáveis pela produção das fragrâncias atrativas às vespas polinizadoras, e também estruturas que secretam substâncias atuantes na proteção desta inflorescência. Sicônios de Ficus auriculata, F. citrifolia, F. lyrata, F. microcarpa, F. montana, F. obtusiuscula, F. pumila, F. tikoua e F. variegata em fase receptiva foram coletados e processados de acordo com as técnicas usuais para análise em microscopias fotônica e eletrônica de varredura. Grande diversidade de estruturas secretoras foi encontrada nos sicônios das espécies investigadas. Pela primeira vez os sítios produtores de fragrâncias atrativas às vespas foram identificados e consistem em glândulas de odor (osmóforos) de localização distinta: nas brácteas do ostíolo e no receptáculo da inflorescência. Ambos os osmóforos aparentemente atuam na etapa de atração das vespas a longas distâncias; porém o osmóforo presente no receptáculo da inflorescência parece atuar também na quimioestimulação por contato das vespas polinizadoras que pousam no sicônio receptivo, estimulando-as a entrar na inflorescência. Estas glândulas teriam surgido no gênero Ficus, não ocorrendo em linhagens ancestrais na mesma família, corroborando a importância dos voláteis na manutenção do mutualismo figo-vespa de figo. Além das glândulas de odor, os sicônios das espécies de Ficus apresentam outras estruturas secretoras não relacionadas à atração de polinizadores, como laticíferos, idioblastos fenólicos, epiderme fenólica e tricomas secretores de compostos fenólicos, nas brácteas do ostíolo, no receptáculo da inflorescência e em tecidos florais. Estas estruturas devem atuar na proteção do sicônio, estrutura de extrema importância que garante a continuidade dos ciclos de gerações tanto da espécie vegetal quanto de seus polinizadores. A interação com um grande número de fitófagos e o elevado custo da herbivoria para o sucesso reprodutivo da espécie provavelmente foram os fatores que levaram à seleção destas estruturas ao longo da evolução do grupo. / Ficus species and their pollinating wasps represent one of the most specialized and currently studied mutualistic systems, in which each representative directly depends on the other for its reproduction. Wasps that newly emerged from a fig carry pollen on their bodies and are attracted by the scent produced by another plants syconium (= inflorescence), in its receptive phase. Upon entering the syconium through its opening (ostiole), not only the wasps lay their eggs, but also pollinate the open female flowers, starting a new life cycle. Despite numerous studies involving chemical, phylogenetic, ecological, coevolutionary and reproductive issues regarding this fig-fig wasp mutualism, studies comprising syconiums anatomy and secretory structures present in this inflorescence are rare. Therefore the aim of this study was to locate and characterize the active secretory structures in receptive phase of syconia in nine species, representing different lineages of the genus. We intended to find the glands responsible for the production of fragrances that are attractive to pollinating wasps, and also structures that secrete substances acting in syconium protection. Receptive syconia of F. auriculata, F. citrifolia, F. lyrata, F. microcarpa, F. montana, F. obtusiuscula, F. pumila, F. tikoua and F. variegata were collected and processed according to the usual techniques for analyses in photonic and scanning electron microscopies. Great diversity of secretory structures was found in syconia of investigated species. For the first time, the sites producing attractive fragrances were identified and consist of scent glands (osmophores) of distinct location: ostiolar bracts and inflorescence receptacle. Both osmophores apparently act on the attraction of wasps over long distances, but the osmophore of the inflorescence receptacle seems to also act in chemostimulation by contact pollinating wasps land on receptive syconium and are encouraged to enter the inflorescence. These glands would have arisen in the genus Ficus (they do not occur in ancestral lineages in the same family), which confirms the importance of volatiles in the maintenance of fig-fig wasp mutualism. In addition to the scent glands, syconia of Ficus species present other secretory structures that are not associated to the attraction of pollinators: laticifers, phenolic idioblasts, phenolic epidermis and phenolic-secreting trichomes, occurring in ostiolar bracts, inflorescence receptacle and floral tissues. These structures must act in the protection of the syconium, an extremely important structure that ensures the continuity of generations cycles of plant species and their pollinators. The interaction with a large number of phytophagous animals and the high cost of herbivory for the reproductive success of the species were probably the factors that led to the selection of these structures along the evolution of the group.

nÃo hà / Studies have shown that latex of plants is a rich source of enzymes with proteolytic activities. Isolation and characterization of cysteine proteases of latex have recently been reported. In this work we report the purification and characterization of three new cysteine proteases of laticifer fluid of Calotropis procera, as well as its activity in plasma coagulation assays. The three proteases, termed CpCP-1, 2-CpCP and CpCP-3 are isoforms of cysteine proteases and were purified using two sequential steps of ion exchange chromatography on CM-Sepharose and Resource S columns, coupled to FPLC system. Their molecular masses were determined by ESI-Q-TOF mass spectrometry: CPCP-1 had mass = 26.213, CPCP-2 = 26.133 and CPCP-3 = 25.086 Da. The amino acid sequences of the N-terminal region was identical for all three enzymes, being composed of 30 amino acid residues. Analysis revealed high sequence identity with others cysteine proteases. The proteolytic activity of these enzymes was tested against different substrates (azocasein, BANA and BApNA) and at different pH and temperature. The three enzymes are capable of degrading azocasein and BANA, substrates nonspecific and specific for cysteine proteases, respectively. CPCP-1 showed proteolytic activity twice that CPCP-3, and this, a little bigger than CPCP-2. Enzymes maintained 60-80% of their activities even when tested at 60 ÂC temperature, and the optimum pH for these activities was 6.0. Circular Dichroism Analysis showed that the secondary structure of the proteases was composed of 15.1 to 19.9% of alpha-helices and 20.6 to 21.3% of beta-sheets. The spectra deconvolution of proteases showed that their structures were altered in the presence of the reducing agent DTT, suggesting the presence of disulfide bridges stabilizing the three dimensional structures. In biological tests proteases were able to strongly inhibit the germination of spores of the fungus Colletotrichum gloeosporioides and also exhibited plasma coagulation activity by thrombin-like mechanism. / Estudos tÃm demonstrado que lÃtex de plantas à uma rica fonte de enzimas com atividades proteolÃticas. O isolamento e a caracterizaÃÃo de proteases cisteÃnicas de lÃtex tÃm sido recentemente relatados. Neste trabalho nÃs reportamos a purificaÃÃo e caracterizaÃÃo de trÃs novas proteases cisteÃnicas do fluido laticÃfero de Calotropis procera, bem como sua atividade em ensaios de coagulaÃÃo plasmÃtica. As trÃs proteases, denominadas CpCP-1, CpCP-2 e CpCP-3 sÃo isoformas de proteases cisteÃnicas e foram purificadas utilizando dois passos sequenciais de cromatografias de troca iÃnica em colunas de CM-Sepharose e Resource S, acoplada a sistema FPLC. Suas massas moleculares foram determinadas por espectrometria de massas em aparelho do tipo ESI-Q-TOF, onde: CpCP-1 apresentou massa=26,213, CpCP-2=26,133 e CpCP-3=25,086. A sequÃncia de aminoÃcidos da regiÃo N-terminal foi idÃntica para as trÃs enzimas, sendo constituÃda de 30 resÃduos de aminoÃcidos. AnÃlises de sequÃncias revelaram alto nÃvel de identidade (88%) com proteases cisteÃnicas A atividade proteolÃtica dessas enzimas foi testada frente a diferentes substratos (AzocaseÃna, BANA e BApNA) e em diferentes valores de pH e temperatura. As trÃs enzimas foram capazes de degradar AzocaseÃna e BANA, substratos inespecÃfico e especÃfico para proteases cisteÃnicas, respectivamente. CpCP-1 apresentou atividade proteolÃtica duas vezes maior que CpCP-3, e esta, um pouco maior que CpCP-2. As enzimas mantiveram 60-80% de suas atividades mesmo quando ensaiadas a 60ÂC de temperatura, e o pH Ãtimo para essas atividades foi 6,0. AnÃlises de DicroÃsmo Circular revelaram que a estrutura secundÃria das proteases era composta de 15,1-19,9% de alfa-hÃlices e 20,6-21,3% de folhas-beta. Os espectros de desconvoluÃÃo das proteases mostrou que suas estruturas foram alteradas na presenÃa do agente redutor DTT, sugerindo a presenÃa de pontes dissulfeto na estabilizaÃÃo das estruturas tridimensionais. Em testes biolÃgicos as proteases foram capazes de inibir fortemente a germinaÃÃo de esporos do fungo Colletotrichum gloesporioides e tambÃm exibiram atividade de coagulaÃÃo plasmÃtica por um mecanismo do tipo trombina.

Laticifers are poorly known among Sapindaceae species. They have only been cited in few works, without a description of its structure, ontogeny and histochemistry, which is of great importance to classify and distinguish them from idioblasts that are cells usually observed in the same organs. Therefore, this work aimed to verify the presence of laticifers in 64 species belonging to 21 genera of Sapindaceae, and to analyze their anatomical aspects, latex composition and evolution within the family. The material obtained from herbaria was rehydrated and embedded in methacrylate, according to the usual techniques in plant anatomy. For histochemical analysis fresh or Paraplast-embedded shoots were used. The presence of articulated nonanastomosing laticifers was confirmed for 15 genera from two subfamilies, being described for the first time in some genera. Apparently, this secretory structure arose six times during evolution of the family. They originate early in the development of shoot apex when the tissues are still in meristematic phase and distributed generally in cortex, phloem and pith. The histochemical tests allowed the observation of lipids, carbohydrates, proteins, alkaloids, and phenolic compounds in the latex. Callose and suberin was also detected in laticifer walls of some species, helping in the interpretation of the infratribal relationships. In general laticifers in the family are small, short and narrow in comparison with other families, and for this reason, for a long time, remained unrecorded in the literature. Presence or absence of laticifers can be used as a character that can help in taxonomic resolution and establishment of relations among groups within Sapindaceae / Os laticíferos são pouco conhecidos em espécies de Sapindaceae. Eles só foram citados em alguns trabalhos, sem uma descrição da sua estrutura, ontogenia e histoquímica que permita classificá-los e distingui-los dos idioblastos que geralmente são observados nos mesmos órgãos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi verificar a presença de laticíferos em 64 espécies pertencentes a 21 gêneros de Sapindaceae e analisar seus aspectos anatômicos, da composição de látex e evolução dentro da família. O material obtido a partir de herbários foi reidratado e incluído em metacrilato de acordo com as técnicas usuais de anatomia vegetal. Para a análise histoquímica foram utilizados ápices frescos e incluídos em Paraplast. A presença de laticíferos articulados não anastomosados foi confirmada para 15 gêneros de duas subfamílias, tendo sido descrita pela primeira vez em alguns destes gêneros. Aparentemente, essa estrutura secretora surgiu seis vezes na família. Eles são originados no início do desenvolvimento no meristema apical quando os tecidos ainda estão na fase meristemática e são distribuídos geralmente no córtex, no floema e na medula. O uso de testes histoquímicos permitiu observar lipídeos, carboidratos, proteínas, alcaloides e compostos fenólicos no látex. Calose e suberina também foram observadas na parede do laticífero de algumas espécies, ajudando na interpretação das relações infratribais. Em geral, os laticíferos da família são pequenos, curtos e estreitos em comparação a outras famílias e, por esse motivo, não se encontram registros na literatura. A presença ou ausência de laticíferos pode ser usada como caráter para ajudar na resolução taxonômica e estabelecimento de relações entre grupos dentro de Sapindaceae

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Plants are constantly exposed to a variety of stresses conditions. However, they react to biotic stresses by triggering a set of defense mechanisms including the synthesis of defensive substances as the pathogenesis-related (PR) proteins. The PR-protein named osmotin can be induced under osmotic stress and water shortage conditions. Osmotin-like proteins have been purified from latex and some of them are related to antifungal activity. The aim of this study was to investigate the osmotin in the following species laticifers: C. grandiflora, P. rubra, T. peruviana, H. drasticus and C. papaya to isolate and evaluate its antifungal activities. Immunoaffinity column chromatography with anti-CpOsm antibodies were performed in order to purify these osmotin-like. They were detected in latex of C. grandiflora and P. rubra by immunoassays the ELISA, Dot Blot and Western Blot using anti-CpOsm antibody (the osmotin of C. procera latex). Osmotin of C. procera, C. grandiflora, P. rubra and H. drasticus were identified by mass spectrometry. However, the osmotin from C. procera was co-purified with cysteine proteases. The co-purified cysteine protease from C. procera was identified as Procerain B. The alignment and the 3-D structure analysis of Procerain B and CpOsm revealed the presence of a similar sequence in both proteins. This sequence might be an epitope which allows the anti-antibody recognition. The osmotin from C. grandiflora, and P. rubra did not show antifungal activity against Fusarium solani and Colletotrichum gloesporioides. Since no correlation between the antifungal activity and the presence of these osmotins were found, the proteolytic activities of these latex protein fractions were evaluated in order to correlate with the antifungal activity C. procera and C. grandiflora showed a strong proteolytic activity. In latex, the cysteine proteases are more often related to antifungal activity than osmotin, which might explain, at least in part, the antifungal activity performed by C. grandifora and not for its osmotin. Further studies on the role of osmotin in physiology laticifers plants are needed. / As plantas estÃo constantemente sujeitas a diversos tipos de estresse, tanto biÃticos como abiÃticos, resultando em respostas de defesa. Decorrente disto, os vegetais sintetizam certas proteÃnas denominadas de proteÃnas relacionadas à patogÃnese (PR proteÃna). As Pr-proteÃnas chamadas de osmotinas podem ser induzidas sob condiÃÃes de estresse osmÃtico, frio e escassez de Ãgua. Osmotinas tem sido purificadas de fluidos laticÃferos e algumas delas estÃo relacionadas com a atividade antifÃngica. O objetivo do presente trabalho foi prospectar osmotinas, bem como isolÃ- las e avaliar suas atividades antifÃngicas, nos fluidos laticÃferos das seguintes espÃcies: C. grandiflora, P. rubra, T. peruviana, H. drasticus e C. papaya. Nos lÃtex de C. grandiflora e P. rubra foram detectadas osmotinas atravÃs de imunoensaios em placa de ELISA, Dot Blot e Westen Blot, utilizando os anticorpos anti-CpOsm (osmotina do lÃtex de C. procera). Cromatografia de imunoafinidade em coluna com anticorpos anti-CpOsm foram realizadas com o intuito de purificar estas osmotinas. AnÃlises por meio de espectrometria de massas, revelaram a presenÃa de osmotina em C. procera, C. grandiflora, P. rubra e H. drasticus. No entanto, a osmotina de C. procera foram co-purificadas com proteases cisteÃnicas. A protease cisteÃnica co- purificada no lÃtex de C. procera foi identificada como Proceraina B. O alinhamento e a anÃlise da estrutura tridimensional da Proceraina B e CpOsm revelaram a presenÃa de uma sequÃncia semelhante em ambas as proteÃnas, que pode ser um epÃtopo disponÃvel ao reconhecimento do anticorpo anti-CpOsm. As osmotinas isoladas de C. grandiflora e P. rubra nÃo apresentaram atividade antifÃngica contra F. solani e C. gloesporioides. Desde que nÃo houve correlaÃÃo entre a atividade antifÃngica e à presenÃa destas osmotinas, as atividades proteolÃticas das fraÃÃes proteicas foram avaliadas a fim de correlaciona-las à atividade antifÃngica. Nos fluidos laticÃferos, as proteases cisteÃnicas estÃo mais frequentemente relacionadas à atividade antifÃngica do que as osmotinas. Estudos mais aprofundados sobre a funÃÃo das osmotinas na fisiologia de plantas laticÃferas sÃo necessÃrios.

Espécies de Ficus e suas vespas polinizadoras representam um dos sistemas mutualísticos mais especializados e estudados atualmente, no qual cada representante depende diretamente do outro para sua reprodução. As vespas que recém-emergem de um figo carregam grãos de pólen em seu corpo e são atraídas pelo odor produzido no sicônio (= inflorescência), em fase receptiva, de outro indivíduo. Ao entrar no sicônio através de sua abertura (ostíolo), as vespas não só depositam seus ovos, como também polinizam as flores femininas abertas, iniciando um novo ciclo de vida. Apesar de inúmeros estudos envolvendo questões químicas, filogenéticas, ecológicas, coevolutivas e reprodutivas desse mutualismo, são raros os estudos abrangendo a anatomia do sicônio e as estruturas secretoras presentes nesta inflorescência. Assim, o objetivo deste trabalho consistiu em localizar e caracterizar as estruturas secretoras ativas em sicônios em fase receptiva de nove espécies, representando diferentes linhagens do gênero, esperando-se encontrar as glândulas responsáveis pela produção das fragrâncias atrativas às vespas polinizadoras, e também estruturas que secretam substâncias atuantes na proteção desta inflorescência. Sicônios de Ficus auriculata, F. citrifolia, F. lyrata, F. microcarpa, F. montana, F. obtusiuscula, F. pumila, F. tikoua e F. variegata em fase receptiva foram coletados e processados de acordo com as técnicas usuais para análise em microscopias fotônica e eletrônica de varredura. Grande diversidade de estruturas secretoras foi encontrada nos sicônios das espécies investigadas. Pela primeira vez os sítios produtores de fragrâncias atrativas às vespas foram identificados e consistem em glândulas de odor (osmóforos) de localização distinta: nas brácteas do ostíolo e no receptáculo da inflorescência. Ambos os osmóforos aparentemente atuam na etapa de atração das vespas a longas distâncias; porém o osmóforo presente no receptáculo da inflorescência parece atuar também na quimioestimulação por contato das vespas polinizadoras que pousam no sicônio receptivo, estimulando-as a entrar na inflorescência. Estas glândulas teriam surgido no gênero Ficus, não ocorrendo em linhagens ancestrais na mesma família, corroborando a importância dos voláteis na manutenção do mutualismo figo-vespa de figo. Além das glândulas de odor, os sicônios das espécies de Ficus apresentam outras estruturas secretoras não relacionadas à atração de polinizadores, como laticíferos, idioblastos fenólicos, epiderme fenólica e tricomas secretores de compostos fenólicos, nas brácteas do ostíolo, no receptáculo da inflorescência e em tecidos florais. Estas estruturas devem atuar na proteção do sicônio, estrutura de extrema importância que garante a continuidade dos ciclos de gerações tanto da espécie vegetal quanto de seus polinizadores. A interação com um grande número de fitófagos e o elevado custo da herbivoria para o sucesso reprodutivo da espécie provavelmente foram os fatores que levaram à seleção destas estruturas ao longo da evolução do grupo. / Ficus species and their pollinating wasps represent one of the most specialized and currently studied mutualistic systems, in which each representative directly depends on the other for its reproduction. Wasps that newly emerged from a fig carry pollen on their bodies and are attracted by the scent produced by another plants syconium (= inflorescence), in its receptive phase. Upon entering the syconium through its opening (ostiole), not only the wasps lay their eggs, but also pollinate the open female flowers, starting a new life cycle. Despite numerous studies involving chemical, phylogenetic, ecological, coevolutionary and reproductive issues regarding this fig-fig wasp mutualism, studies comprising syconiums anatomy and secretory structures present in this inflorescence are rare. Therefore the aim of this study was to locate and characterize the active secretory structures in receptive phase of syconia in nine species, representing different lineages of the genus. We intended to find the glands responsible for the production of fragrances that are attractive to pollinating wasps, and also structures that secrete substances acting in syconium protection. Receptive syconia of F. auriculata, F. citrifolia, F. lyrata, F. microcarpa, F. montana, F. obtusiuscula, F. pumila, F. tikoua and F. variegata were collected and processed according to the usual techniques for analyses in photonic and scanning electron microscopies. Great diversity of secretory structures was found in syconia of investigated species. For the first time, the sites producing attractive fragrances were identified and consist of scent glands (osmophores) of distinct location: ostiolar bracts and inflorescence receptacle. Both osmophores apparently act on the attraction of wasps over long distances, but the osmophore of the inflorescence receptacle seems to also act in chemostimulation by contact pollinating wasps land on receptive syconium and are encouraged to enter the inflorescence. These glands would have arisen in the genus Ficus (they do not occur in ancestral lineages in the same family), which confirms the importance of volatiles in the maintenance of fig-fig wasp mutualism. In addition to the scent glands, syconia of Ficus species present other secretory structures that are not associated to the attraction of pollinators: laticifers, phenolic idioblasts, phenolic epidermis and phenolic-secreting trichomes, occurring in ostiolar bracts, inflorescence receptacle and floral tissues. These structures must act in the protection of the syconium, an extremely important structure that ensures the continuity of generations cycles of plant species and their pollinators. The interaction with a large number of phytophagous animals and the high cost of herbivory for the reproductive success of the species were probably the factors that led to the selection of these structures along the evolution of the group.