Orientadores: Edi Lucia Sartorato, Andrea Trevas Maciel-Guerra / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T16:54:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Miranda_PauloMauriciodoAmorDivino_M.pdf: 2620124 bytes, checksum: aacc629866a9ff7880f48f266f4f3743 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Nos seres humanos, a visão é o sentido que retrata com melhor fidelidade o ambiente que os cerca. A ausência do sentido da visão é definida como cegueira. As conseqüências da cegueira são problemas de saúde pública importantes, pois têm um impacto significativamente negativo sobre o desenvolvimento econômico e social dos indivíduos afetados. A perda visual pode ser resultado de lesão nos centros nervosos superiores, nas vias ópticas ou em estruturas do próprio olho. As causas vão desde traumas oculares até doenças congênitas, como: glaucoma congênito, catarata congênita e Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (LHON). A LHON é uma doença, causada por alterações no DNA mitocondrial, caracterizada pela perda repentina da visão em ambos os olhos, devido a uma degeneração do nervo óptico. Atualmente, 17 principais mutações associadas à LHON foram registradas, onde três dessas mutações representam 95% dos casos (mutações primárias) e as 14 mutações subseqüentes representam apenas 5% do total (mutações secundárias). Não foram relatados, até o momento, estudos que definam a freqüência das mutações ou estudos populacionais de prevalência no Brasil. Desta forma, o presente estudo teve como principal objetivo definir a freqüência das mutações da LHON em pacientes brasileiros. Foram avaliados 55 pacientes com hipótese diagnóstica de LHON ou neuropatia óptica adquirida de origem desconhecida. Mutações primárias (G11778A, T14484C e G3460A) e mutações secundárias nos genes MT-ND1, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND5, MT-ND6 e MT-CYB foram rastreadas em todos os indivíduos estudados. O rastreamento das mutações primárias foi realizado pelo método de restrição enzimática. Para os pacientes que não apresentaram mutações primárias procedeu-se o seqüenciamento direto para rastrear mutações secundárias. O método de DHPLC foi padronizado para o rastreamento de mutações primárias. Mutações primárias foram encontradas em 19 pacientes, ou seja, em 38,2% dos casos. A freqüência dessas mutações ficou definida como: 67% da mutação G11778A (13 casos), 28% da mutação T14484C (5 casos) e 5% da mutação G3460A (apenas 1 caso). A mutação G11778A apresentou números próximos aos encontrados nas populações estudadas em outras partes do mundo, confirmando ser a principal causa de LHON também em pacientes brasileiros. A mutação T14484C, como na maioria das populações mundiais, mostrou-se como a segunda maior causa da LHON, porém mostrou uma freqüência quase duas vezes maior que o descrito na literatura. Enquanto que a mutação G3460A apresentou freqüência muito baixa se comparada as das demais populações estudadas. Não foram encontradas mutações secundárias. A ausência dessas mutações pode ser atribuída à possibilidade de haver mutações em regiões do DNA mitocondrial não rastreadas no presente estudo. Há também a possibilidade de os pacientes em que não foram localizadas mutações não serem portadores da LHON, apresentando outra anomalia com dados clínicos semelhantes. No presente estudo também foi possível, a partir do teste molecular a confirmação da hipótese diagnóstica de LHON em alguns pacientes / Abstract: The vision is the sense that best expresses the environment surrounding the mankind. The term blindness is used to define the absence of the vision. The consequences of blindness are important problems of public health concern as they cause a negative impact on the economic and social development of the affected individuals). The visual loss is characterized by congenital deprivation and it can be total or partial, permanent or temporary. Furthermore, visual loss may result from superior nerve centers damage, optic pathways lesions or physic damage of the eye itself. Thus, the visual loss causes range from trauma to ocular congenital diseases such as congenital glaucoma, congenital cataract and Leber Hereditary Optic Neuropathy (LHON). LHON is a mitochondrial disease characterized by sudden loss of vision in both eyes, due to an optic nerve degeneration. Currently, 17 main LHON associated mutations were published, three of which account for 95% of the cases (primary mutations) and the subsequent fourteen account for only 5% of the total (secondary mutations). The frequencies of mutations envolved in LHON in Brazilian patients have not been reported so far. Therefore, the aim of this study was to define the LHON mutations frequency in Brazilian patients. We evaluated 55 patients with LHON diagnosis or acquired optic neuropathy of unknown origin. Primary mutations (G11778A, T14484C and G3460A) and secondary mutations in the genes MT-ND1, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND5, MT-ND6 and MT-CYB were screened in all individuals studied. Screening of primary mutations was performed by the method of enzyme restriction. Patients who did not have primary mutations were screened for secondary mutations by direct sequencing. The DHPLC method was used for primary mutations screening. Primary mutations were found in 19 patients, ie 38.2% of cases. The frequency of these mutations was defined as 67% for the G11778A mutation (13 cases), 28% for the T14484C mutation (5 cases) and 5% for the G3460A mutation (only 1 case). The mutation G11778A showed numbers similar to those found in the populations studied in other parts of the world, confirming that the main cause of LHON also in Brazilian patients. The T14484C mutation, as in most world populations, showed up as the second leading cause of LHON, but it showed a frequency almost twice that reported. While the G3460A mutation frequency showed very low compared to the other populations studied. No secondary mutation was found. The absence of these mutations can be attributed to the possibility of mutations in mitochondrial DNA regions not screened in this study. There is also the possibility that patients in whom no mutations were not found to be carriers of LHON, with another anomaly with similar clinical data. This study evaluated the situation of primary and secondary mutations associated with LHON in a sample of Brazilian individuals. It was also possible, from the molecular testing to confirm the diagnosis of LHON in some patients / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Edi Lúcia Sartorato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T22:58:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Miranda_PauloMauriciodoAmorDivino_D.pdf: 3949549 bytes, checksum: 8cd1e0647087ac34cd2bc0ed5d096d0b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (LHON) e a Atrofia Óptica Autossômica Dominante (ADOA ou OPA1) são doenças caracterizadas pela perda da visão bilateral, devido a uma degeneração do nervo óptico. Ambas as doenças apresentam também acuidade visual reduzida, discromatopsia, palidez do nervo óptico e escotoma central ou centrocecal. A LHON é causada por mutações no DNA mitocondrial (mtDNA), onde três dessas mutações representam 95% dos casos (mutações primárias principais G11778A, T14484C e G3460A) e as mutações subsequentes representam apenas 5% do total (mutações raras). A ADOA é causada por mutações (mais de 300) no gene nuclear OPA1. Embora os mecanismos moleculares precisos envolvidos no desenvolvimento das duas doenças ainda não são bem compreendidos, foi demonstrado que LHON e ADOA possuem um defeito comum de acoplamento da fosforilação oxidativa. Nesses dois casos, a hipótese é de que as mutações no mtDNA e no gene OPA1 afetariam a integridade mitocondrial, resultando em uma diminuição do fornecimento de energia para os neurônios do nervo óptico. É possível que no Brasil a presença e frequência das alterações da relacionadas à LHON e ADOA sejam diferentes das encontradas em outras partes do mundo. Por isso, o presente estudo teve como principais objetivos rastrear mutações e haplogrupos associadas à LHON e detectar mutações no gene OPA1 em pacientes brasileiros com hipótese diagnóstica de LHON e com Neuropatia Óptica de etiologia a esclarecer. Também foi objetivo otimizar o método de PCR Multiplex Alelo-Específico e padronizar as plataformas de alto rendimento TaqMan® OpenArray® e Iplex Gold/Maldi TOF MS para o rastreamento da LHON. Foram avaliados 101 pacientes, sendo 67 com hipótese diagnóstica de LHON e 34 com neuropatia óptica de etiologia a esclarecer. As mutações da LHON foram detectadas por meio de PCR-RFLP e PCR Multiplex Alelo-Específico. As mutações raras da LHON e do gene nuclear OPA1 (10 principais éxons) foram rastreadas por sequenciamento direto. Foram encontradas mutações da LHON em 36 casos (83.3% com a mutação G11778A e 16.7% com a mutação T14484C). Não foi encontrada a mutação G3460A. Também não foram encontradas mutações raras da LHON e nem mutações relacionadas à ADOA. Haplogrupos de origem africana (L1/L2 e L3) foram mais frequentes no estudo. Foi otimizado o método de PCR Multiplex Alelo-Específico e padronizadas as plataformas TaqMan® OpenArray® e Iplex Gold/Maldi TOF, os quais se mostraram reprodutivos, eficientes e eficazes. A análise molecular das mutações da LHON e do OPA1 foi importante para a confirmação do diagnóstico de 35% dos casos clínicos típicos de LHON e para a elucidação 35% casos de neuropatia óptica de etiologia a esclarecer / Abstract: The Leber Hereditary Optic Neuropathy (LHON) and Autosomal Dominant Optic Atrophy (ADOA) are diseases characterized by loss of vision in both eyes due a degeneration of the optic nerve. Both diseases also exhibit reduced visual acuity, dyschromatopsia, optic nerve and central scotoma or centrocecal. The LHON is caused by mutations in mitochondrial DNA (mtDNA), where three of these mutations account for 95% of cases (major primary mutations G11778A, T14484C and G3460A) and subsequent mutations account for only 5% of the total (rare mutations). The ADOA is caused by mutations (more than 300) in the nuclear gene OPA1. Although the precise molecular mechanisms involved in the development of the two diseases are not well understood, it was shown that LHON and ADOA have a common defect coupling of oxidative phosphorylation. In both cases, the hypothesis is that mutations in mtDNA and OPA1 gene affect mitochondrial integrity, resulting in a decrease in the supply of energy to the neurons of the optic nerve. It is possible that in Brazil the presence and frequency of changes related to LHON and ADOA be different from those found in other parts of the world. Therefore, the present study had two main objectives track haplogroups and mutations associated with LHON and detect mutations in the OPA1 gene in Brazilian patients with a diagnosis of LHON and optic neuropathy of unknown etiology. Another objective was to optimize the method of PCR Multiplex allele-specific and standardize platforms high throughput TaqMan® OpenArray® and Iplex Gold/Maldi TOF MS for screening of LHON. 101 patients were evaluated, 67 with a diagnosis of LHON and 34 with optic neuropathy of unknown etiology. LHON mutations were detected by PCR-RFLP and allele-specific multiplex PCR. Rare mutations of LHON and nuclear gene OPA1 (top 10 éxons) were screened by direct sequencing. LHON mutations were found in 36 cases (83.3% with the G11778A mutation and 16.7% with the T14484C mutation). Not the G3460A mutation. Nor rare mutations of LHON and ADOA or related mutations were found. Haplogroups of African origin (L1/L2 and L3) were more frequent in the study. The method of allele-specific multiplex PCR was optimized and standardized the TaqMan® OpenArray® and iPLEX Gold/Maldi TOF platforms which are shown reproductive, efficient and effective. Molecular analysis of mutations of LHON and ADOA was important to confirm the diagnosis of 35% of the typical clinical cases of LHON and to elucidate 35% cases of optic neuropathy of unknown etiology. Besides being useful also in the prognosis of each patient, for the phenotypic expression of the LHON and ADOA may vary with different genetic background in our population of individuals / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Edi Lucia Sartorato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T07:24:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AmaralFernandes_MarcelaScabello_D.pdf: 2548021 bytes, checksum: 4a1e103fa460381f99df5a845fdfec67 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A neuropatia óptica hereditária de Leber (LHON) é uma doença mitocondrial, com herança materna, caracterizada pela perda (sub) aguda, indolor e bilateral da visão, escotoma central ou cecocentral e discromatopsia, devido à degeneração do nervo óptico por apoptose das células parvo ganglionares da retina. As três mutações primárias G11778A, T14484C e G3460A são responsáveis por 90 a 95% dos casos da LHON e acometem subunidades dos genes MT-ND4, MT-ND6 e MT-ND1, respectivamente, que codificam proteínas para o complexo I da cadeia respiratória. Somente 5% dos pacientes possuem uma das demais mutações secundárias. A presença da mutação é fundamental para que LHON ocorra, no entanto, a penetrância incompleta e predileção pelo gênero masculino sugerem que fatores genéticos, epigenéticos e ambientais possam modular a expressão fenotípica da doença. O objetivo deste estudo foi analisar clínica e molecularmente para LHON 63 pacientes com neuropatia óptica, sendo 25 com quadro clínico típico de Leber (grupo I) e 38 com neuropatia óptica de etiologia a esclarecer (grupo II), assim como verificar a relação entre os agentes tóxicos tabaco e álcool e uma possível suscetibilidade genética entre os pacientes que faziam uso abusivo destes agentes. Estes pacientes foram submetidos à avaliação oftalmológica completa no ambulatório de neuroftalmologia do HC-UNICAMP e tiveram suas amostras de sangue coletadas e analisadas no CBMEG. A pesquisa das três mutações primárias foi realizada pelas técnicas de restrição enzimática e sequenciamento direto, e confirmada pelo PCR-multiplex e Plataforma Sequenom. Os pacientes que não apresentaram uma das mutações primárias foram rastreados pelo sequenciamento direto e pela Plataforma Sequenom, para oito principais mutações secundárias: G3733A e C4171A (MT-ND1), T10663C (MT-ND4L) e G14459A, C14482G, C14482A, A14495G e C14568T (MT-ND6). Os haplogrupos dos pacientes mutantes foram pesquisados pela Plataforma Sequenom. Dos 63 pacientes com neuropatia óptica foram encontrados 18 pacientes mutantes, sendo 14 do grupo I (11 com G11778A e 3 com T14484C) e 4 do grupo II (3 com G11778A e 1 com T14484C). Os haplogrupos encontrados nestes pacientes mutantes foram: C, D, M, U, e, principalmente L1/L2 e L3, que mostra a presença de ancestral comum de origem asiática, européia e, predominantemente, africana. Nenhum dos pacientes apresentou a mutação primária G3460A, assim como não foi encontrada nenhuma das 8 mutações secundárias rastreadas. Na análise estatística das variáveis estudadas houve diferença significativa para recorrência familiar materna, campo visual e presença de mutação, dentre os 63 pacientes com neuropatia óptica, sendo que achados mostraram que o quadro clínico clássico da doença descrito por Leber há mais de um século tem boa confiabilidade. Ao comparar as mesmas variáveis entre os 14 mutantes do grupo I com os 4 mutantes do grupo II, não houve diferença estatisticamente significativa para nenhuma das variáveis, evidenciando que o diagnóstico de LHON é molecular, através do rastreamento das mutações (inicialmente as primárias). Não foi possível estabelecer relação entre o uso abusivo do tabaco e álcool e uma suscetibilidade genética de base, isto é, a mutação da LHON, entre os pacientes com neuropatia óptica de etiologia a esclarecer e com consumo abusivo destes agentes / Abstract: Leber hereditary optic neuropathy (LHON) is maternally inherited mitochondrial disease, characterized by painless, bilateral, (sub) acute loss of vision, central or cecocentral scotoma and dyschromatopsia, due to the degeneration of optic nerve by the apoptosis of the p-retinal ganglion cells. The three primary mutations G11778A, T14484C and G3460A account for 90 to 95% of the cases of LHON and affect subunits of genes MT-ND4, MT-ND6 and MT-ND1, respectively, which encode proteins of the complex I of the respiratory chain. Only 5% of patients have one of the other secondary mutations. The mutation in mtDNA is essential for LHON occurs, however, the incomplete penetrance and the male predominance of the disease suggests that genetic, epigenetic and environmental factors may modulate the phenotypic expression of LHON. The aim of this study was to analyze clinical and molecularly for LHON 63 patients with optic neuropathy, 25 with classical clinical symptoms of Leber (group I) and 38 with optic neuropathy of unknown etiology (group II), as well as to investigate the relationship between toxic agents tobacco and alcohol and a possible genetic susceptibility among patients who were abusing these agents. These patients underwent complete ophthalmologic evaluation in the Neuro-Ophthalmoloy Outpatient HC-UNICAMP, had their blood samples collected and analyzed in CBMEG. The research of the three primary mutations was performed by restriction analysis and direct sequencing and confirmed by multiplex-PCR and Sequenom Platform. Patients who did not have one of the primary mutations were screened by direct sequencing and by Sequenom Platform for 8 major secondary mutations: G3733A and C4171A (MT-ND1), T10663C (MT-ND4L) and G14459A, C14482G, C14482A, A14495G and C14568T (MT -ND6). The haplogroups of mutant patients were screened by Sequenom Platform. Of 63 patients with optic neuropathy 18 patients were found to be mutants, 14 in group I (11 with G11778A and 3 with T14484C) and 4 in group II (3 with G11778A and 1 with T14484C). The haplogroups found in these mutants patients were: C, D, M, U, and especially L1/L2 and L3, which shows the presence of the common ancestor of Asian, European and, predominantly, African. None of the patients had a primary mutation G3460A, and nor it was found any of the eight secondary mutations screened. Statistical analysis of the variables studied showed significant differences for maternal familial recurrence, visual field and the presence of mutation among the 63 patients with optic neuropathy, demonstrating a good reliability to the classical clinical picture of the disease described by Leber over a century ago. When comparing the same variables among 14 mutants of group I with 4 mutants of group II, there was no statistically significant difference for any of the variables, indicating that the diagnosis of LHON is molecular, by tracking the mutations (initially the primaries ones). No relationship between abusive use of tobacco and alcohol and a genetic-based susceptibility, that is, the mutation for LHON could be correlated in patients with optic neuropathy of unknown etiology and history of heavy consumption of these agents / Doutorado / Oftalmologia / Doutora em Ciências Médicas