Les résultats insuffisants de la radiochimiothérapie conventionnelle ont motivé l’évaluation de nouvelles cibles afin de moduler la radiosensibilité tumorale: voies intrinsèques impliquées dans la réponse aux rayonnements ionisants, vascularisation tumorale, stroma non vasculaire. A travers cette thèse, nous avons évalué trois nouvelles stratégies de radiosensibilisation pharmacologique. Nous avons d’abord étudié en association à la radiothérapie l’intérêt de la modulation de l’axe p53/Mdm2 par le JNJ26854165, un inhibiteur de la dégradation de p53 par le protéasome. Les résultats in vitro et in vivo dans des xénogreffes sous-cutanées de cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) montrent que cette stratégie permet d’améliorer significativement l’efficacité de la radiothérapie. Nous avons également rapporté des résultats encourageants in vitro dans plusieurs lignées cellulaires tumorales avec un nouvel agent antivasculaire ciblant la tubuline, l’EHT 6706. Cette stratégie augmentait l’efficacité de l’irradiation et potentialisait l’effet antiprolifératif de certains agents de chimiothérapie conventionnelle. Enfin, le développement le plus abouti a consisté en l’évaluation de l’association d’un triple inhibiteur de MET/AXL/FGFR en association à l’irradiation in vitro et dans des modèles de CBNPC implantés en xénogreffes sous-cutanées, mais également sous forme de tumeurs pulmonaires orthotopiques. Cet agent pharmacologique potentialisait l’efficacité de la radiothérapie dans des lignées ne surexprimant pas MET. Il est apparu que l’activité de la drogue faisait intervenir, au moins partiellement, l’inhibition de l’activité d’acteurs de la cytocinèse. Ces trois évaluations, qui s’inscrivent dans la recherche translationnelle, montrent l’importance de la recherche préclinique pour les études d’association aux rayonnements ionisants. Seul un développement préclinique rationnel permettra de faire émerger de nouveaux standards dans le domaine de la biomodulation pharmacologique de la radiosensibilité tumorale. / Insufficient results of conventional chemoradiation have encouraged assessment of new targets for radiosensitization: intrinsic cellular pathways involved in radiation response, tumor angiogenesis, and nonvascular stroma. We have investigated these three strategies for pharmacological radiosensitization. First, we examined the usefulness of targeting p53/Mdm2 pathway in combination with irradiation. In vitro and in vivo results obtained in non-small cell lung carcinoma (NCSLC) showed that this strategy was promising for enhancing radiation efficacy. We also found encouraging results within several cell lines with a novel vascular disrupting agent targeting tubulin. This strategy enhanced radiation effects and also increased the antiproliferative effects of various chemotherapeutics. Finally, the most advanced preclinical development was obtained with a novel MET/AXL/FGFR inhibitor, which improved effectiveness of radiation therapy in vitro and in subcutaneous and orthotopic models of non MET-dependent cell cancer lines. This effect was not only related to an inhibition of stroma/cancer cell interactions, as it probably involved activity toward actors of cytocinesis. These studies, which are part of translational research, highlight the importance of preclinical investigations in the area of radiation research. Only rationale preclinical development will allow new standards to emerge for pharmacological modulation of tumor radiosensitivity.

The chromosome passenger complex (CPC) is an essential mitotic regulator with key roles in mitotic processes such as chromosome condensation, spindle dynamics, chromosome bi-orientation, the spindle checkpoint and cytokinesis. The Aurora B kinase is the CPC’s catalytic subunit. Its targeting and activation are dependent on interactions with the other components of the complex: inner centromere protein (INCENP), survivin and borealin/Dasra B. INCENP serves both as a scaffolding subunit for the CPC as a whole and as an activator of Aurora B via its highly conserved INbox domain. Aurora B is a putative anti‐cancer target; several inhibitors of the kinase are currently in clinical trials. All these are ATP-analogues targeting the kinase active site. The protein-­protein interaction between Aurora B and the INCENP INbox is also essential for CPC function. Earlier studies have demonstrated that INCENP INbox mutants unable to bind and/or activate Aurora B cannot rescue lethality in the absence of endogenous INCENP. The first goal of this study was to test the in vivo effects of disrupting the interaction between endogenous wild type INCENP and Aurora B. For this, a cell-based CPC function assay was developed in HeLa cells. Using this assay, I show that expression of soluble INbox in HeLa cells produces a significant increase in multinucleated and micronucleated cells: both effects consistent with Aurora B loss of function. Expression of soluble INbox bearing the mutations W845G and/or F881A does not elicit this effect suggesting that those mutants cannot bind to Aurora B and occlude INCENP binding. The result concerning the F881A mutant contrasts with earlier reports that equivalent mutants could bind, but not activate, Aurora B. Expression of an INbox mutant lacking the C-­terminal TSS motif reported to be involved in Aurora B activation but not binding has effects similar to those of the wild type INbox. Using the INbox/Aurora B interaction as a model, a secondary goal of this study was to develop and evaluate a novel approach to identify small peptides capable of dissociating intracellular protein‐protein interactions. For this, a library of small (5-­9 residues long) circular peptides (CPs) mimicking the INbox was generated using the split intein circular ligation of proteins and peptides (SICLOPPS) methodology and assayed using the cell-­based CPC function assay. Over two successive rounds of screening, a small number of CPs were identified that caused a significant increase in rates of multinucleated and micronucleated cells. Although statistically significant, these increases were very modest. Furthermore, due to high heterogeneity in SICLOPPS processing efficiencies, it was not practicable to compare the effects of different peptides side-­by-side by transfection. The level of variation in processing efficiency – thus, CP production – was unexpectedly high and puts into question the functional complexity of more commonly used combinatorial cyclic peptide libraries derived using current SICLOPPS methodology. The results of this study are divided into three sections. The first is a methods section concerning the testing of SICLOPPS in HeLa cells and the development of a cell­‐based CPC function assay. In the second, the effects of expressing soluble INbox and mutants thereof in HeLa cells are presented. The final results section presents the results of the feasibility study of the rationally-­designed genetically encoded library approach.

La chromatine est le support de l'information génétique tout le long du cycle cellulaire. Elle est soumise à des modifications diverses et rigoureusement coordonnées par les complexes CDK-Cyclines, sous le contrôle de mécanismes de surveillance. En mitose, la kinase Aurora est un acteur clé qui contrôle la ségrégation correcte des chromosomes. Aurora participe à la bi-orientation des centromères, à la condensation des chromosomes et à la cytocinèse. Le dysfonctionnement de cette kinase conduit alors à une instabilité chromosomique et à l'aneuploïdie, un phénotype observé dans la majorité des cancers solides. Les travaux réalisés au cours de cette thèse démontrent un nouveau rôle pour cette kinase dans la dispersion et la disjonction des télomères en mitose chez la levure S. Pombe. La dispersion des télomères s'accompagne en métaphase de la dissociation aux télomères des protéines Swi6/HP1 et cohésine Rad21. Tandis que la disjonction a lieu en anaphase après la phosphorylation de la sous-unité de condensine Cnd2. L'inhibition d'Aurora induit la formation de ponts chromosomiques anaphasiques qui révèle des défauts de séparation des télomères. La délétion d'une protéine spécifique aux télomères, Ccq1, protège la cellule de la formation de ces ponts chromosomiques en favorisant le chargement de la condensine en anaphase malgré l'inhibition d'Aurora. / Chromatin is the support of the genetic information throughout the cell cycle. It is subject to various modifications that occur with precise coordination. This coordination is led by CDK-cyclins under the control of cell cycle checkpoints. In mitosis, correct chromosome segregation is ensured by Aurora kinases. Aurora participates to centromere bi-orientation, chromosome condensation and cytokinesis. A dysfunction in the activity of this kinase leads to chromosomal instability and aneuploidy, phenotypes frequently observed in cancer. The results obtained during this thesis reveal a new function for fission yeast Aurora kinase during mitosis in telomere dispersion and disjunction. Telomere dispersion is triggered in metaphase by the dissociation of Swi6/HP1 and cohesion Rad21 from telomeres. Then, during anaphase, the phosphorylation of the condensin subunit Cnd2 is required for telomere disjunction. Aurora inhibition leads to anaphase chromosome bridges with unseparated telomeres. Deletion of a specific telomeric protein, Ccq1, prevents the formation of anaphase chromosome bridges by favoring condensin loading despite Aurora inhibition.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第24946号 / 生博第508号 / 新制||生||68(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 松田 道行, 教授 松本 智裕, 教授 原田 浩 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DGAM

La mitose assure la répartition égale du génome. La kinase mitotique Aurora B y joue un rôle majeur en contrôlant la fidélité de la ségrégation des chromosomes de par sa localisation aux centromères et aux microtubules, qui nécessite son ubiquitination par CUL3. Cependant, le mécanisme conduisant la forme ubiquitinée d’Aurora B sur ces structures mitotiques reste à déterminer. Dans ce contexte, j’ai pu identifier la protéine UBASH3B, qui contient un domaine de liaison à l’ubiquitine (UBD) comme un régulateur essentiel de la ségrégation chromosomique, agissant comme un récepteur de l’ubiquitine pour Aurora B. UBASH3B interagit directement avec Aurora B et cette interaction est dépendante de la modification d’Aurora B par l’ubiquitine ainsi que de CUL3. UBASH3B ne régule pas le niveau d’expression d’Aurora B. En revanche, UBASH3B se localise aux fuseaux mitotiques et est à la fois nécessaire et suffisant pour transférer Aurora B aux microtubules. De plus, la redistribution d’Aurora B des centromères vers les microtubules contrôle le déroulement et la fidélité de la ségrégation des chromosomes et donc le contenu correct du matériel génétique des cellules. Ainsi, mes résultats expliquent comment la modification par l’ubiquitine régule la localisation et la fonction d’Aurora B, reliant une voie de signalisation impliquant un récepteur à l’ubiquitine à la mitose. / Mitosis ensures equal segregation of the genome. The major mitotic kinase Aurora B controls fidelity of chromosome segregation by its localization to centromeres and microtubules, which requires CUL3-mediated ubiquitylation. However, it remains unknown how ubiquitylated Aurora B is targeted to mitotic structures. Here, I identify ubiquitin-binding domain (UBD) protein UBASH3B that critically regulates chromosome segregation, acting as ubiquitin receptor for Aurora B. UBASH3B directly binds Aurora B, and this interaction is dependent on CUL3 and on ubiquitin recognition. UBASH3B does not regulate protein levels of Aurora B. Instead, UBASH3B localizes to the mitotic spindle and is both required and sufficient to transfer Aurora B to microtubules. Moreover, redistribution of Aurora B from centromeres to microtubules controls timing and fidelity of chromosome segregation and thereby euploidy of cells. Thus, my findings explain how ubiquitin attachment regulates localization and function of Aurora B, linking receptor-mediated ubiquitin signaling to mitosis.

La kinase Aurora B appartient au complexe des protéines passagères. Ce complexe est impliqué dans la régulation de la condensation, constriction et ségrégation des chromosomes, ainsi que dans la cytokinèse. Son rôle est donc crucial pour prévenir la formation de cellules cancéreuses. Cependant, l'étude de la fonction précise d'Aurora B dans chacune des phases de la mitose est limitée par la durée de celle-ci, et par le manque de spécificité des inhibiteurs existants. Nous avons donc développé une stratégie basée sur la photo-inactivation de la kinase par le chromophore Killer-Red, fusionné à la protéine. L'émission locale de ROS après irradiation, permet alors la photo-inactivation spécifique et temporelle d'Aurora B. La photo-inactivation d'Aurora B avant anaphase aboutie soit à un arrêt de la mitose, soit à la régression du sillon de division, provoquée par l'entrée en anaphase en présence de chromosomes retardés. La photo-inactivation d'Aurora B en début d'anaphase a pour conséquence la régression du sillon de division en cytokinèse ; apportant la première indication directe de l'implication d'Aurora B dans le fuseau mitotique en cytodiérèse. De façon surprenante, la photo-inactivation de la kinase au niveau du corps résiduel, après constriction du sillon de division, n'affecte pas l'abscission. La photo-inactivation d'Aurora B n'affecte pas la localisation des autres membres du complexe des protéines passagères, indiquant que la kinase n'est pas impliquée dans la dynamique du complexe. Les résultats obtenus montrent sans aucun doute l'implication d'Aurora B dans chacune des phases de la mitose, suggérant que la phosphorylation par Aurora B de ses substrats permet le controle de la division cellulaire. / Aurora B is a mitotic kinase involved in chromosome condensation and segregation as well as cytokinesis. Aurora B together with INCENP, Survivin, TD60 and Borealin constitute the chromosome passenger protein complex (CPC), which localizes to the inner centromeres all through metaphase, transfers to the spindle midzone in anaphase and to the midbody in cytokinesis. In order to dissect the mitotic kinase functions of Aurora B as well as its role as an integral part of the CPC in a temporal manner, we have used chromophore assisted light inactivation (CALI) approach. We have combined miRNA ablation of endogenous Aurora B with ectopic expression of miRNA resistant Aurora B fused to the photosensitizer Killer Red (AurB-KR) in HeLa cells. Irradiation at distinct phases of mitosis led to photobleaching of the Killer Red protein, accompanied by emission of reactive oxygen species (ROS) resulting in the photoinactivation of the fused Aurora B. Photoinactivation before anaphase led to either mitotic arrest or cleavage furrow regression due to entry into anaphase with chromosome bridges. CALI at early anaphase also led to cytokinesis failure underlying the role of Aurora B in central spindle function. Consistent with the effects of dominant negative dead-kinase Aurora B, upon CALI the localisation of Incenp, Survivin and Borealin was not affected. Importantly, photoinactivation of Aurora B-KR following cleavage furrow constriction at the midbody had no effect on the completion of abscission. These data, demonstrate unequivocally the distinct roles Aurora B exerts at each phase of mitosis and in particular suggest that Aurora B substrate phosphorylation from metaphase to anaphase is implicated in the spatio-temporal control of cell division and cytokinesis.

Das Glioblastom ist der häufigste hirneigene Tumor des Erwachsenen und mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 5 % eine der aggressivsten Hirntumorerkrankungen (Batash et al., 2017). Verbunden mit einer schlechten Prognose und geringen Remissionsraten ergibt sich die Notwendigkeit, bestehende Therapieoptionen zu optimieren und zu erweitern. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das vor einigen Jahren entwickelte und aktuell in klinischen Studien angewandte Konzept der Therapie von Malignomen mit elektrischen Wechselfeldern, den sog. Tumor Treating Fields (TTFields), aufgegriffen. Basis der anti-tumoralen Wirkung der im Rahmen von Glioblastom-Studien applizierten TTFields bildet eine Tumor-spezifische Frequenz von 200 kHz sowie geringe Intensitäten, die einen nebenwirkungsarmen anti-mitotischen Effekt erzielen (Kirson et al., 2004; Kirson et al., 2007; Clark et al., 2017; Porat et al., 2017). Dieser resultiert sowohl aus alternierenden elektrischen Feldern, die während der Metaphase über eine Irritation des Dipolmoments von Tubulin-Untereinheiten die Assemblierung des Spindelapparates inhibieren, als auch aus inhomogenen elektrischen Feldern, die während der Telophase die Trennung der Tochterzellen behindern. Mit dieser Behandlungsoption konnten schon einige gute Ergebnisse für die Behandlung von Glioblastomen in klinischen Studien erreicht werden (Stupp et al., 2017). Eine weitere anti-mitotische Therapieoption stellt die Inhibierung der Aurora B Kinase mittels AZD1152 dar. Die Aurora B Kinase ist Teil des Chromosomal Passenger Complex (CPC), der bei Inhibierung der Kinase seine Kontrollfunktionen während der Mitose und Zytokinese nicht wahrnehmen kann. Diese fehlende Kontrolle führt zu Polyploidie, die einen Zelltod verursachen kann (Wiedemuth et al., 2016). Aufgrund dieses ähnlichen biologischen Hintergrundes wurde zu Beginn dieser Arbeit die Hypothese aufgestellt, dass eine kombinierte Therapie mittels TTFields und AZD1152 einen additiven zytotoxischen Effekt im Vergleich zur Monotherapie mit TTFields erzielen kann. Es konnte zunächst für die etablierte Zelllinie U87-MG ein signifikanter additiver Effekt in der Kombinationstherapie der TTFields mit AZD1152 im Vergleich zur alleinigen Therapie mittels TTFields nachgewiesen werden. Die mediane Tumorzellzahl konnte hierbei in der Kombinationstherapie um 60 % reduziert werden. Dieser additive Effekt konnte ebenfalls an zwei Primärkulturen reproduziert werden. Hierbei konnte die relative mediane Tumorzellzahl der Primärkultur HT18584 ebenfalls um 60 % in der Kombinationstherapie gesenkt werden. Diese tetraploide Zellreihe zeigte außerdem einen außergewöhnlich großen zytotoxischen Effekt bei der Behandlung mit AZD1152. Signifikant zeigte ebenso die Primärkultur HT12347 einen medianen Verlust von 56 % der Tumorzellen nach einer kombinierten Behandlung. Qualitativ und zellmorphologisch konnte mittels konfokaler Laser-Scanning- sowie Lichtmikroskopie die Akkumulation von mitotischen Defekten detektiert werden, die auch in den Monotherapien aber vor allem in der Kombinationstherapie zu finden waren. Die in der quantitativen Analyse gezeigte additive Zytotoxizität der Kombinationstherapie konnte hier nochmals visualisiert und bestätigt werden. Für eine klinische Phase I-Studie zur Überprüfung der Effektivität sollten zunächst weitere zellkulturtechnische Daten erfasst werden, um die Universalität der kombinierten Behandlung zu überprüfen. Weiterhin wäre die Entwicklung einer selektiven/lokalen Therapie mittels AZD1152 wünschenswert, um die Nebenwirkungen des Medikamentes abzumildern. Es sollte außerdem das im Rahmen dieser Arbeit detektierte sensitivere Ansprechen der tetraploiden Zelllinie HT18584 genauer untersucht werden, um eine potentiell prognostisch günstige Verbindung zwischen der Behandlung mit AZD1152 und tetraploiden Zellen herstellen zu können.:1 EINLEITUNG 1 1.1 Glioblastoma multiforme – Definition, Inzidenz und Ätiologie 1 1.1.1 Symptomatik und Diagnostik des Glioblastoms 2 1.2 Molekulare Klassifizierung 3 1.2.1 Primäre und sekundäre Glioblastome und einige allgemeine Marker 3 1.2.2 Der MGMT-Status 5 1.3 Der eukaryotische Zellzyklus und sequentielle Kontrollpunkte 6 1.3.1 Der Chromosomal Passenger Complex (CPC) 8 1.3.2 Die Familie der Aurorakinasen 9 1.4 Therapie maligner Gliome 10 1.4.1 Standardtherapie eines Glioblastoms 10 1.4.2 Tumor Treating Fields (TTFields) – Biologischer Effekt und Studienlage 11 1.4.3 Aurora Kinase-Inhibitoren 14 1.5 Zielstellung der Arbeit 15 2 METHODEN UND MATERIALIEN 17 2.1 Methoden 17 2.1.1 Zellkultivierung allgemein 17 2.1.2 Passagieren adhärenter Zellen 17 2.1.3 Kultivierung von primärem Patientenmaterial 18 2.1.4 Kryokonservierung und Rekultivierung eukaryotischer Zelllinien 18 2.1.5 Bestimmung der Lebendzellzahl mittels Neubauer-Zählkammer 19 2.1.6 Durchflusszytometrische Analyse 19 2.1.7 Bestimmung der Lebendzellzahl mittels Propidiumiodid (PI) 20 2.1.8 Durchflusszytometrische Immunphänotypisierung von Glioblastomzellen 20 2.1.9 In vitro-Applikation der Tumor Treating Fields (TTFields) 21 2.1.10 Titration der effektiven Aurora B Kinase-Inhibitorkonzentrationen mittels PI 22 2.1.11 Titration inhibitorischer Temozolomidkonzen-trationen mittels AlamarBlue-Assay 23 2.1.12 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 23 2.2. Materialien 25 2.2.1 Geräte 25 2.2.2 Chemikalien und Reagenzien 25 2.2.3 Lösungen 26 2.2.4 Medien 27 2.2.5 Kommerzielle Kits 28 2.2.6 Antikörper 28 2.2.7 Software 28 2.2.8 Statistik 29 2.2.9 Zelllinien 29 3 ERGEBNISSE 30 3.1 Wahl des Designs der Kontrollgruppen 30 3.2 Typisierung der verwendeten Primärkulturen 32 3.2.1 Befunde der Pathologie des Universitätsklinikums Dresden 33 3.2.2 Immunphänotypisierung der Primärkultur HT18584 34 3.2.3 Immunphänotypisierung der Primärkultur HT12347 35 3.3 Titrationen mit AZD1152 36 3.3.1 Titration mit AZD1152 für die Primärkultur HT18584 36 3.3.2 Titration mit AZD1152 für die Primärkultur HT12347 37 3.4 Kombinationstherapie mittels AZD1152 und TTFields 38 3.4.1 Quantitativer Effekt der Kombinationstherapie an U87-MG 39 3.4.2 Quantitativer Effekt der Kombinationstherapie an HT18584 40 3.4.3 Quantitativer Effekt der Kombinationstherapie an HT12347 41 3.4.4 Qualitativer Effekt der Kombinationstherapien 42 3.4.4.1 Die Kombinationstherapie mit U87-MG 43 3.4.4.2 Die Kombinationstherapie mit HT18584 44 3.4.5 Zytotoxischer Effekt der Kombinationstherapie an HT12347 45 3.5 Titrationen mit Temozolomid 47 3.5.1 Therapie mit Temozolomid an U87-MG 48 3.5.2 Therapie mit Temozolomid an Primärkulturen 48 4 DISKUSSION 52 4.1 Vorversuche 52 4.1.1 Wachstumsanalyse der Kontrollgruppen 52 4.1.2 Charakterisierung der Primärkulturen 53 4.2 Die neuen Behandlungsoptionen 54 4.2.1 Applikation der TTFields 54 4.2.2 Die Behandlung mit AZD1152 55 4.2.3 Die Kombinationstherapie 57 4.3. Die Behandlung mit Temozolomid (TMZ) 59 5 ZUSAMMENFASSUNG 62 LITERATURVERZEICHNIS 64 TABELLENVERZEICHNIS 73 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 74 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 75 ANHANG 77 Anhang 1: Einverständniserklärung der Patienten 77 Anhang 2: Erlaubnis zur Nutzung der Patientendaten der Pathologie 78 Anhang 3: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 79 Anhang 4: Erklärung über die Einhaltung gesetzlicher Vorgaben 81

La kinase Aurora B appartient au complexe des protéines passagères. Ce complexe est impliqué dans la régulation de la condensation, constriction et ségrégation des chromosomes, ainsi que dans la cytokinèse. Son rôle est donc crucial pour prévenir la formation de cellules cancéreuses. Cependant, l'étude de la fonction précise d'Aurora B dans chacune des phases de la mitose est limitée par la durée de celle-ci, et par le manque de spécificité des inhibiteurs existants. Nous avons donc développé une stratégie basée sur la photo-inactivation de la kinase par le chromophore Killer-Red, fusionné à la protéine. L'émission locale de ROS après irradiation, permet alors la photo-inactivation spécifique et temporelle d'Aurora B. La photo-inactivation d'Aurora B avant anaphase aboutie soit à un arrêt de la mitose, soit à la régression du sillon de division, provoquée par l'entrée en anaphase en présence de chromosomes retardés. La photo-inactivation d'Aurora B en début d'anaphase a pour conséquence la régression du sillon de division en cytokinèse ; apportant la première indication directe de l'implication d'Aurora B dans le fuseau mitotique en cytodiérèse. De façon surprenante, la photo-inactivation de la kinase au niveau du corps résiduel, après constriction du sillon de division, n'affecte pas l'abscission. La photo-inactivation d'Aurora B n'affecte pas la localisation des autres membres du complexe des protéines passagères, indiquant que la kinase n'est pas impliquée dans la dynamique du complexe. Les résultats obtenus montrent sans aucun doute l'implication d'Aurora B dans chacune des phases de la mitose, suggérant que la phosphorylation par Aurora B de ses substrats permet le controle de la division cellulaire.