Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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La sclérose en plaque (SEP) est une maladie auto-immune chronique du système nerveux central (SNC), maladie au cours de laquelle les cellules T endommagent la myéline. Les cellules T CD4⁺ jouent un rôle fondamental dans cette pathologie. Le modèle animal d'encéphalomyélite auto-immune expérimental (EAE) permet de reproduire les symptômes cliniques de la SEP chez la souris. Bien qu'une grande variété de cellules issues des systèmes immunitaires inné et adaptatif peuvent être impliquées dans la réponse inflammatoire du SNC, les cellules T CD4⁺ sont reconnues comme étant des intervenants importants dans l'initiation et la progression des cellules T vers l'autoréactivité. Dans notre laboratoire, nous travaillons avec la souris 1C6 qui est une souris transgénique pour le récepteur des cellules T (TCR). Cette souris génère des cellules T CD4⁺ et CD8⁺ avec la capacité de reconnaître le peptide MOG[₃₅₋₅₅]. Le développement de cette souris transgénique est un outil inestimable pour l'étude des rôles pathogéniques des différents sous-types de cellules T dans l'EAE. Toutefois, il est possible d'observer que l'exclusion allélique de la chaine α du TCR est incomplète par l'expression de TCR endogène toujours présent dans les souris 1C6. Afin d'obtenir des populations de cellules transgéniques pures, les souris 1C6 ont été croisées avec les souris déficientes en RAG-1. Les gènes RAG-1 et RAG-2 codent ensemble pour former un complexe responsable de la recombinaison V(D)J. Une altération fonctionnelle d'un seul des deux gènes permettraient d'éliminer l'expression endogène du TCR. Le rôle de l'inclusion allélique dans l'élaboration du répertoire de TCR chez la souris 1C6 n'est pas clair. Dans la première partie de ma thèse, j'ai démontré que l'inclusion allélique est cruciale dans la suppression de l'auto-immunité sévère du SNC chez les souris 1C6. J'ai utilisé des souris 1C6 x Rag1[exposant -/-] dérivées de croisements entre souris 1C6 et NOD Rag1[exposant -/-]. Cette lignée de souris ne permet pas la réorganisation des chaînes TCR α et β endogènes en raison de l'absence de RAG-1. Les souris 1C6 x Rag1[exposant -/-] possèdent moins de cellules T CD4⁺ , CD8⁺ et nous avons démontré que les souris 1C6 x Rag1[exposant -/-] développent une EAE spontanée contrairement aux souris 1C6 x Rag1[exposant +/+]. De plus, les souris 1C6 x Rag1[exposant -/-] présentent une EAE fatale suivant leur immunisation avec le peptide dérivé de la glycoprotéine oligodendrocyte de myéline MOG[₃₅₋₅₅] et ce, malgré l'absence de lymphocytes T CD8⁺ en provenance de la rate . Nos résultats démontrent un rôle essentiel du réarrangement des chaines de TCR dans le contrôle de la survie des cellules T ainsi que dans la sensibilité des souris 1C6 face à la maladie. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai investigué le rôle du complexe Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation (ERAD) dans les cellules Th1 et Th17, deux sous-types de cellules T CD4⁺. ERAD est un système de contrôle qualité des protéines situé dans le réticulum endoplasmique (ER). Il permet de sélectivement éliminer les protéines mal repliées ou mal assemblées en les dirigeant vers le cytosol où elles sont dégradées par le système ubiquitine-protéasome (UPS). Sec61 joue un rôle important dans l'importation des protéines nouvellement synthétisées au niveau du ER tandis que le translocon p97 est crucial pour le transport rétrograde des protéines endommagées vers le cytosol. Bien que les rôles de Sec61 et de p97 aient largement été étudiés dans les maladies neurodégénératives et le cancer, leurs fonctions dans les maladies auto-immunes et dans la fonction des cellules T ne sont pas bien comprises. Des études ont démontré que le blocage de Sec61 avec la mycolactone a des effets inhibiteurs immédiats sur la production de cytokines par les cellules immunitaires. Par contre, l'utilisation de l'inhibiteur de Sec61 et la suppression des cytokines dans la SEP sont peu étudiés. Notre objectif est de vérifier les effets d'inhibiteurs de Sec61 et de p97 sur différents sous-types de cellules T. Dans cette étude, nous avons utilisé trois différents inhibiteurs : (1) Eeyarestatin I (ErsI) : inhibiteur de Sec6 et de p97 (2) NMS-873 : inhibiteur spécifique de p97 (3) Apratoxin A : inhibiteur spécifique de Sec61. En vérifiant les effets de ces molécules sur les cellules Th1 et Th17, nous avons observé une suppression substantielle des cytokines pro-inflammatoires dans les deux types de cellules. Elles diminuent également les niveaux de protéines de Stat-1 et de Stat-3, des facteurs des transcription impliqués dans la différenciation des cellules Th1 et Th17, respectivement. Nous avons aussi observé que l'administration du NMS-873 chez les souris C57BL6/J réduit la sévérité de l'EAE. Dans nos travaux futurs, nous explorerons le mécanisme par lequel ces inhibiteurs régulent la signalisation des lymphocytes T. Nous travaux présentent de nouvelles molécules et voies de signalisation d'intérêt pour la découverte de nouveaux traitements de la SEP en ciblant les cellules T CD4⁺. / Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease of CNS in which T cells direct an attack against myelin. CD4⁺ T cells plays a central role in pathogenesis of MS. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of MS that recapitulates many of the immune aspects of its pathogenesis. Although various cell types of the innate and adaptive immune system may be responsible for the inflammatory response within the CNS, CD4⁺ T cells are considered as a critical contributor in the initiation and progression of autoreactive T cells. In our lab we used a 1C6 T cell receptor (TCR) transgenic mouse which generates both CD4⁺ and CD8⁺ T cells that recognize MOG[₃₅₋₅₅]. Indeed, the development of these TCR transgenic mice offered a promising tool to study the pathogenic role of individual subsets of T cells in EAE. However, we still observed endogenous TCR expression in these mice, indicating mainly the incomplete allelic exclusion of the TCRα chain. To obtain pure transgenic T cell populations, 1C6 mice were crossed with RAG-1 deficient mice. The RAG proteins (RAG-1 and RAG-2) together form a complex responsible for V(D)J rearrangement. Functional impairment of only one of the two genes was believed to eliminate any endogenous TCR expression. The role played by allelic inclusion in shaping the TCR repertoire of 1C6 mice is unclear. In the first part of the thesis, I have investigated that allelic inclusion is crucial in 1C6 mice for the suppression of severe CNS autoimmunity. I have used 1C6 x Rag1[exposant -/-] mice which are derived by crossing 1C6 with NOD Rag1[exposant -/-] mice. These mice cannot rearrange endogenous TCRα and β chains due to absence of Rag1. In 1C6 x Rag1[exposant -/-] mice numbers of both CD4⁺ and CD8⁺ T cells have diminished. We showed that 1C6 x Rag1[exposant -/-] mice develop spontaneous EAE but not 1C6 x Rag1[exposant +/+]. They also rapidly develop fatal EAE upon immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein MOG[₃₅₋₅₅] despite the lack of splenic CD8⁺ T cells. Our data show a critical role for endogenously rearranged TCR chains in mediating T cell survival and disease susceptibility in 1C6 mice. In the second part of the thesis, I have investigated the role of ER-associated degradation (ERAD) in Th1 and Th17 subsets of CD4⁺ T cells. ERAD is a protein quality system that removes misfolded, misassembled proteins in the ER by selectively dislocating them into the cytosol where they are subsequently degraded by the cytosolic ubiquitin proteasome system (UPS). Sec61 plays an important role in the import of newly synthesized proteins into the endoplasmic reticulum (ER), while the p97 translocon is crucial for the retrotranslocation i.e., reverse transport of misfolded proteins to the cytosol. However, while the role of sec61 and p97 has been investigated extensively in neurodegenerative diseases and cancer, their function in autoimmune disease, and in T cell function, are incompletely understood. Previous studies have shown that mycolactone-mediated Sec61 blockade has immediate inhibitory effects on the production of cytokines in immune cells. However, the suppression of cytokines by sec61 inhibitors is not completely explored in MS. Our aim is to investigate the effect of Sec61 and p97 inhibitors in different T cell subsets. In this study, we use three different inhibitors: (1) Eeyarestatin I (ErsI): inhibition of sec61 as well as p97 (2) NMS873: specific inhibitor of p97 (3) Apratoxin A (Apra A): specific inhibitor of Sec61. In this study we have observed that above inhibitors of ERAD substantially suppress the production of pro-inflammatory cytokines in Th1 and Th17 cells. Also decreases protein levels of major transcription factors Stat-1 and Stat-3 involved in differentiation of Th1 and Th17 cells, respectively. We also observed that administration of NMS873 reduces EAE severity in C57BL/6J mice. In future work, we will explore the mechanism by which these inhibitors regulate T cell signaling. Our work thus potentially uncovers novel molecules and pathways in CD4⁺ T cells that could be target for future therapy in MS.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires et représente un problème de santé publique majeur. A l'heure actuelle, les biothérapies anti-TNF sous forme de protéines recombinantes constituent une avancée considérable dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde (PR). Néanmoins, il convient de développer des approches thérapeutiques alternatives pour traiter les 40% de patients non-répondeurs ainsi queceux qui échappent à plusieurs années de traitement. La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques est indispensable pour proposer des approches alternatives à ces biothérapies. Par ailleurs, les techniques de transfert de gène offrent une alternative thérapeutique possible pour pallier aux limitations des biothérapies actuelles, à condition de les adapter aux contraintes du tissu cible de la PR, les articulations. Les projets ont consisté à développer et valider dans des modèles expérimentaux d'arthrite de nouvelles stratégies anti-inflammatoires basées sur l'utilisation de l'ARN interférence comme outil thérapeutique. En effet, la possibilité d'interférer au niveau des mécanismes responsables de l'expression des protéines,la régulation de la stabilité des ARNm et de l'efficacité de la machinerie traductionnelle, présente un intérêt thérapeutique supérieur aux biothérapies actuelles basées sur l'inhibition des protéines sécrétées (anticorps ou récepteurs solubles) mais nécessite cependant de posséder un vecteur qui transduit efficacement les cellules productrices de la molécule ciblée. / Rheumatoid arthritis (RA) is the most frequent chronic inflammatory systemicautoimmune disease that remains a major medical challenge as the exact causes of the disease are not completely elucidated. The principal treatment strategies arebased on the inhibition of TNF-α, one of the major inflammatory cytokine in RA.Although risk and benefit analyses are in favour of the use of monoclonal antibodiesagainst TNF-α, the most currently used biotherapy, they are not devoid from multipleside effects. The search for new therapeutic targets is essential to proposealternative approaches to non responders to such biotherapies. The possibility to interfere in the mechanisms responsible for regulating mRNA stability andeffectiveness of the translational machinery also present a therapeutic benefitsuperior to current biologic therapies based on inhibition secreted proteins(antibodies or soluble receptors). Such approach however requires developingvectors that efficiently transduced the specific cell type producing the targeted gene.Projects of my PhD fellowship have included both the development of gene therapyvehicles for RNAi-based intervention in experimental mouse models of arthritis andevaluation of novel candidate genes for alternative anti-inflammatory therapy in RA.

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie auto-immune orpheline. Elle est caractérisée par une atteinte microvasculaire et une fibrose touchant la peau et les organes internes. La ScS est une maladie sévère avec une surmortalité significative. Jusqu’à présent, aucun essai thérapeutique n’a permis de démontrer qu’un produit ait une action anti-fibrosante et améliore significativement le pronostic de cette maladie. La physiopathologie de la ScS fait intervenir une combinaison de facteurs environnementaux et de facteurs de susceptibilité génétique. Récemment TNFSF4 a été identifié comme facteur de susceptibilité génétique à la ScS. TNFSF4 code pour OX40 ligand (OX40 L). Le couple OX40-OX40L est impliqué dans la co-stimulation tardive des lymphocytes T, mais aussi dans la genèse et la réactivation de lymphocytes T mémoires et dans la prolifération et différenciation des lymphocytes B. Bloquer OX40L s’est avéré prometteur dans des modèles précliniques d’encéphalomyélite auto-immune, de polyarthrite rhumatoïde, de colite inflammatoire, de réaction du greffon contre l’hôte et d’asthme. Par ailleurs, ce blocage permettrait d’inhiber uniquement les lymphocytes T pathogènes récemment activés et d’éviter ainsi une immunosuppression globale, contrairement aux biothérapies actuellement disponibles en rhumatologie. L’observation d’une surexpression de la protéine OX40L dans le derme des patients ScS nous a incités à étudier le rôle d’OX40L dans la ScS. L’objectif de mon travail de thèse a été d’étudier l’efficacité d’une thérapie ciblée anti-OX40L dans la ScS, par l’utilisation de modèles murins complémentaires de la maladie. Nous avons tout d’abord cherché à optimiser le modèle de fibrose induite par la bléomycine, qui est un modèle bien validé, utilisé en général en première intention pour évaluer des anti-fibrosants potentiels, en particulier lorsqu’il s’agit de cibles inflammatoires. Nous avons également étudié si l’échographie à haute fréquence pouvait apporter une aide à l’évaluation cutanée chez ces animaux, mais nos résultats n’ont pas permis de démontrer une place spécifique à cet outil dans ce contexte. Les approches anti-OX40L ont débuté par l’utilisation de souris KO qui ont montré des résultats prometteurs dans le modèle induit par la bléomycine. Ensuite, des approches pharmacologiques ont été développées en utilisant un anticorps monoclonal neutralisant anti-OX40L dans le modèle de fibrose dermique induite par la bléomycine. L’intérêt du blocage d’OX40L a été conforté par la démonstration de propriétés non seulement de prévention mais aussi curatives contre la fibrose établie. L’étude des voies modulées par OX40L a mis en avant l’infiltrat inflammatoire et le relargage de cytokines pro-fibrotiques (IL-6 et TNF-α). De plus, le blocage d’OX40L semblait prévenir la fibrose dermique en inhibant l’activation des fibroblastes dépendant de la voie de signalisation AP-1. Le rôle d’OX40L dans la phase inflammatoire du remodelage matriciel a été abordé par l’utilisation du modèle de cicatrisation cutanée. En revanche, le blocage d’OX40L n’a pas eu d’effet dans le modèle de fibrose non-inflammatoire qui caractérise les souris Tsk-1. Etant donné le rôle clé en clinique de l’atteinte d’organe, notre approche a été enrichie par l’utilisation de souris transgéniques Fra2, qui sont un nouveau modèle de ScS caractérisé par une fibrose pulmonaire inflammatoire et une HTAP. L’effet de l’anticorps anti-OX40L a été remarquable dans ce contexte avec au scanner et à l’histologie une réduction significative de la fibrose pulmonaire, du remodelage vasculaire et des signes d’HTAP. Enfin, l’étude longitudinale des sérums collectés dans notre cohorte de patients a montré que la forme soluble d’OX40L pourrait être un potentiel biomarqueur dans la ScS pour identifier les patients à risque de progression sévère. (...) / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune orphan disease which is characterized by alterations of the microvasculature and fibrosis affecting the skin and internal organs. SSc is the most severe connective tissue disease associated with a high risk of mortality. Until now, there is no effective treatment to counteract the fibrotic process and to improve the prognosis of this disease. SSc results from the combination of genetic and environmental factors. TNFSF4 was recently identified as a genetic risk factor for SSc. TNFSF4 encodes OX40L, which is involved in late T-cell co-stimulatory signals, but also in generation and reactivation of memory T cells and promotion of plasma cell phenotype. OX40L blockade was effective in reducing clinical symptoms in several animal models of autoimmune and inflammatory diseases, such as rheumatoid arthritis, colitis, asthma or graft-versus-host-disease. The anti-OX40L antibody presents the advantage of a targeted therapy against pathogenic recently activated T cells, which might not expose patients to increased risk of infections, unlike other conventional immunosuppressants. Following the observation of an increased expression of OX40L in fibrotic skin in SSc-patients, we aimed to investigate the contribution of OX40L in SSc and to assess the efficacy of a targeted therapy against OX40L in SSc, using complementary experimental mouse models. First, we characterized the optimum in vivo parameters required for the successful induction of dermal fibrosis in the widely used bleomycin-induced dermal fibrosis mouse model, which is usually the first step in most of pharmacological studies assessing anti-fibrotic therapies. We also aimed to determine whether ultrasonography could be used to assess skin fibrosis in this model, but our results showed that it was not efficient enough to assess dermal thickening in this model. Invalidation of OX40L prevented dermal fibrosis in the bleomycin mouse model. Then pharmacologic approaches, using a monoclonal anti-OX40L antibody, demonstrate that blockade of OX40L not only prevented dermal fibrosis, but also induced regression of established fibrosis in this model. We also showed that OX40L acts directly on both dermal fibroblasts and inflammatory cells and on cytokine release (IL-6, TNF-α), by regulating NF kappa B and AP 1 pathways. We observed that OX40L inhibition interfered with early inflammatory stages of matrix remodeling using the excisional wound healing mouse model. Conversely, blocking OX40L did not display antifibrotic properties in the non-inflammatory Tsk-1 mouse model. Given that interstitial lung involvement and pulmonary arterial hypertension (PAH) are key prognostic factors in SSc, we aimed to assess the effects of OX40L pharmacological inhibition in a new murine model: the fra-2 transgenic mice, which are characterized by both fibrosing alveolitis and PAH. In this model, using both CT-scan and histology, we demonstrated that mice treated by anti-OX40L antibody were markedly protected from fibrosing alveolitis and vessel remodeling leading to PAH. Furthermore, longitudinal analyses of our cohort of SSc-patients showed that soluble OX40L is a promising serum biomarker to predict the worsening of lung and skin fibrosis. Altogether, our results show that OX40L is as an attractive target in inflammation-driven fibrosis. This work also strengthens the relation between inflammation and fibrosis in SSc-pathogenesis. This work underlines advantages of combination of several animal models in translational approach to SSc.

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie auto-immune orpheline. Elle est caractérisée par une atteinte microvasculaire et une fibrose touchant la peau et les organes internes. La ScS est une maladie sévère avec une surmortalité significative. Jusqu’à présent, aucun essai thérapeutique n’a permis de démontrer qu’un produit ait une action anti-fibrosante et améliore significativement le pronostic de cette maladie. La physiopathologie de la ScS fait intervenir une combinaison de facteurs environnementaux et de facteurs de susceptibilité génétique. Récemment TNFSF4 a été identifié comme facteur de susceptibilité génétique à la ScS. TNFSF4 code pour OX40 ligand (OX40 L). Le couple OX40-OX40L est impliqué dans la co-stimulation tardive des lymphocytes T, mais aussi dans la genèse et la réactivation de lymphocytes T mémoires et dans la prolifération et différenciation des lymphocytes B. Bloquer OX40L s’est avéré prometteur dans des modèles précliniques d’encéphalomyélite auto-immune, de polyarthrite rhumatoïde, de colite inflammatoire, de réaction du greffon contre l’hôte et d’asthme. Par ailleurs, ce blocage permettrait d’inhiber uniquement les lymphocytes T pathogènes récemment activés et d’éviter ainsi une immunosuppression globale, contrairement aux biothérapies actuellement disponibles en rhumatologie. L’observation d’une surexpression de la protéine OX40L dans le derme des patients ScS nous a incités à étudier le rôle d’OX40L dans la ScS. L’objectif de mon travail de thèse a été d’étudier l’efficacité d’une thérapie ciblée anti-OX40L dans la ScS, par l’utilisation de modèles murins complémentaires de la maladie. Nous avons tout d’abord cherché à optimiser le modèle de fibrose induite par la bléomycine, qui est un modèle bien validé, utilisé en général en première intention pour évaluer des anti-fibrosants potentiels, en particulier lorsqu’il s’agit de cibles inflammatoires. Nous avons également étudié si l’échographie à haute fréquence pouvait apporter une aide à l’évaluation cutanée chez ces animaux, mais nos résultats n’ont pas permis de démontrer une place spécifique à cet outil dans ce contexte. Les approches anti-OX40L ont débuté par l’utilisation de souris KO qui ont montré des résultats prometteurs dans le modèle induit par la bléomycine. Ensuite, des approches pharmacologiques ont été développées en utilisant un anticorps monoclonal neutralisant anti-OX40L dans le modèle de fibrose dermique induite par la bléomycine. L’intérêt du blocage d’OX40L a été conforté par la démonstration de propriétés non seulement de prévention mais aussi curatives contre la fibrose établie. L’étude des voies modulées par OX40L a mis en avant l’infiltrat inflammatoire et le relargage de cytokines pro-fibrotiques (IL-6 et TNF-α). De plus, le blocage d’OX40L semblait prévenir la fibrose dermique en inhibant l’activation des fibroblastes dépendant de la voie de signalisation AP-1. Le rôle d’OX40L dans la phase inflammatoire du remodelage matriciel a été abordé par l’utilisation du modèle de cicatrisation cutanée. En revanche, le blocage d’OX40L n’a pas eu d’effet dans le modèle de fibrose non-inflammatoire qui caractérise les souris Tsk-1. Etant donné le rôle clé en clinique de l’atteinte d’organe, notre approche a été enrichie par l’utilisation de souris transgéniques Fra2, qui sont un nouveau modèle de ScS caractérisé par une fibrose pulmonaire inflammatoire et une HTAP. L’effet de l’anticorps anti-OX40L a été remarquable dans ce contexte avec au scanner et à l’histologie une réduction significative de la fibrose pulmonaire, du remodelage vasculaire et des signes d’HTAP. Enfin, l’étude longitudinale des sérums collectés dans notre cohorte de patients a montré que la forme soluble d’OX40L pourrait être un potentiel biomarqueur dans la ScS pour identifier les patients à risque de progression sévère. (...) / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune orphan disease which is characterized by alterations of the microvasculature and fibrosis affecting the skin and internal organs. SSc is the most severe connective tissue disease associated with a high risk of mortality. Until now, there is no effective treatment to counteract the fibrotic process and to improve the prognosis of this disease. SSc results from the combination of genetic and environmental factors. TNFSF4 was recently identified as a genetic risk factor for SSc. TNFSF4 encodes OX40L, which is involved in late T-cell co-stimulatory signals, but also in generation and reactivation of memory T cells and promotion of plasma cell phenotype. OX40L blockade was effective in reducing clinical symptoms in several animal models of autoimmune and inflammatory diseases, such as rheumatoid arthritis, colitis, asthma or graft-versus-host-disease. The anti-OX40L antibody presents the advantage of a targeted therapy against pathogenic recently activated T cells, which might not expose patients to increased risk of infections, unlike other conventional immunosuppressants. Following the observation of an increased expression of OX40L in fibrotic skin in SSc-patients, we aimed to investigate the contribution of OX40L in SSc and to assess the efficacy of a targeted therapy against OX40L in SSc, using complementary experimental mouse models. First, we characterized the optimum in vivo parameters required for the successful induction of dermal fibrosis in the widely used bleomycin-induced dermal fibrosis mouse model, which is usually the first step in most of pharmacological studies assessing anti-fibrotic therapies. We also aimed to determine whether ultrasonography could be used to assess skin fibrosis in this model, but our results showed that it was not efficient enough to assess dermal thickening in this model. Invalidation of OX40L prevented dermal fibrosis in the bleomycin mouse model. Then pharmacologic approaches, using a monoclonal anti-OX40L antibody, demonstrate that blockade of OX40L not only prevented dermal fibrosis, but also induced regression of established fibrosis in this model. We also showed that OX40L acts directly on both dermal fibroblasts and inflammatory cells and on cytokine release (IL-6, TNF-α), by regulating NF kappa B and AP 1 pathways. We observed that OX40L inhibition interfered with early inflammatory stages of matrix remodeling using the excisional wound healing mouse model. Conversely, blocking OX40L did not display antifibrotic properties in the non-inflammatory Tsk-1 mouse model. Given that interstitial lung involvement and pulmonary arterial hypertension (PAH) are key prognostic factors in SSc, we aimed to assess the effects of OX40L pharmacological inhibition in a new murine model: the fra-2 transgenic mice, which are characterized by both fibrosing alveolitis and PAH. In this model, using both CT-scan and histology, we demonstrated that mice treated by anti-OX40L antibody were markedly protected from fibrosing alveolitis and vessel remodeling leading to PAH. Furthermore, longitudinal analyses of our cohort of SSc-patients showed that soluble OX40L is a promising serum biomarker to predict the worsening of lung and skin fibrosis. Altogether, our results show that OX40L is as an attractive target in inflammation-driven fibrosis. This work also strengthens the relation between inflammation and fibrosis in SSc-pathogenesis. This work underlines advantages of combination of several animal models in translational approach to SSc.

L’expression de ZAP-70 dans la leucémie lymphoïde chronique (LLC) est associée à une hypersignalisation du BCR et à la survenue de cytopénies auto-immunes (CAI). Les LB non tumoraux expriment aussi ZAP-70, expression corrélée à celle dans les LB tumoraux et aux CAI. Nous avons montré que ces LB non tumoraux ZAP-70+ sont polyclonaux, sans lien moléculaire entre eux ni avec le clone tumoral et qu’il n’existe pas de stéréotypie de leur BCR. Ces LB présentent par contre un enrichissement en BCR autoréactifs. Notre modèle murin knock in Zap-70+/- // Mb1-Cre+/- a montré qu’une forte expression précoce de ZAP-70 dans les LB est associée à un avantage sélectif médullaire, un enrichissement en cellules potentiellement autoréactives de type zone marginale, à un blocage partiel de la maturation et de la différentiation périphérique, ainsi qu’au développement de caractéristiques de la LLC : hypogammaglobulinémie, enrichissement en auto-anticorps circulants, hyperactivation et prolifération cellulaires augmentées. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives impliquant ZAP-70 dans la compréhension du développement B et de la physiopathologie de la rupture de tolérance et de la transformation néoplasique. / ZAP-70 expression in chronic lymphocytic leukemia (CLL) is associated with BCR hypersignalling and autoimmune cytopenia (AIC) occurrence. Non tumoral B cells also express ZAP-70, which is correlated with those in tumoral B cells and AIC. We have shown that these non tumoral B cells ZAP-70+ are polyclonal, without molecular link between each other and tumoral B cells, and without BCR stereotypy. These cells are however enriched in autoreactive BCR. Our mouse model knock in Zap-70+/- // Mb1-Cre+/- revealed that a high and early ZAP-70 expression is associated with medullar selective advantage, enrichment in potential autoreactive B cells of marginal zone subtype, partial block for peripheral maturation and differentiation, along with some LLC characteristics: hypogammaglobulinemia, enrichment in circulating auto-antibodies, increase in cellular activation and proliferation. These results open new opportunities involving ZAP-70 in the understanding of B cell development and physiopathology of tolerance breakdown and neoplastic transformation.

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie auto-immune orpheline. Elle est caractérisée par une atteinte microvasculaire et une fibrose touchant la peau et les organes internes. La ScS est une maladie sévère avec une surmortalité significative. Jusqu’à présent, aucun essai thérapeutique n’a permis de démontrer qu’un produit ait une action anti-fibrosante et améliore significativement le pronostic de cette maladie. La physiopathologie de la ScS fait intervenir une combinaison de facteurs environnementaux et de facteurs de susceptibilité génétique. Récemment TNFSF4 a été identifié comme facteur de susceptibilité génétique à la ScS. TNFSF4 code pour OX40 ligand (OX40 L). Le couple OX40-OX40L est impliqué dans la co-stimulation tardive des lymphocytes T, mais aussi dans la genèse et la réactivation de lymphocytes T mémoires et dans la prolifération et différenciation des lymphocytes B. Bloquer OX40L s’est avéré prometteur dans des modèles précliniques d’encéphalomyélite auto-immune, de polyarthrite rhumatoïde, de colite inflammatoire, de réaction du greffon contre l’hôte et d’asthme. Par ailleurs, ce blocage permettrait d’inhiber uniquement les lymphocytes T pathogènes récemment activés et d’éviter ainsi une immunosuppression globale, contrairement aux biothérapies actuellement disponibles en rhumatologie. L’observation d’une surexpression de la protéine OX40L dans le derme des patients ScS nous a incités à étudier le rôle d’OX40L dans la ScS. L’objectif de mon travail de thèse a été d’étudier l’efficacité d’une thérapie ciblée anti-OX40L dans la ScS, par l’utilisation de modèles murins complémentaires de la maladie. Nous avons tout d’abord cherché à optimiser le modèle de fibrose induite par la bléomycine, qui est un modèle bien validé, utilisé en général en première intention pour évaluer des anti-fibrosants potentiels, en particulier lorsqu’il s’agit de cibles inflammatoires. Nous avons également étudié si l’échographie à haute fréquence pouvait apporter une aide à l’évaluation cutanée chez ces animaux, mais nos résultats n’ont pas permis de démontrer une place spécifique à cet outil dans ce contexte. Les approches anti-OX40L ont débuté par l’utilisation de souris KO qui ont montré des résultats prometteurs dans le modèle induit par la bléomycine. Ensuite, des approches pharmacologiques ont été développées en utilisant un anticorps monoclonal neutralisant anti-OX40L dans le modèle de fibrose dermique induite par la bléomycine. L’intérêt du blocage d’OX40L a été conforté par la démonstration de propriétés non seulement de prévention mais aussi curatives contre la fibrose établie. L’étude des voies modulées par OX40L a mis en avant l’infiltrat inflammatoire et le relargage de cytokines pro-fibrotiques (IL-6 et TNF-α). De plus, le blocage d’OX40L semblait prévenir la fibrose dermique en inhibant l’activation des fibroblastes dépendant de la voie de signalisation AP-1. Le rôle d’OX40L dans la phase inflammatoire du remodelage matriciel a été abordé par l’utilisation du modèle de cicatrisation cutanée. En revanche, le blocage d’OX40L n’a pas eu d’effet dans le modèle de fibrose non-inflammatoire qui caractérise les souris Tsk-1. Etant donné le rôle clé en clinique de l’atteinte d’organe, notre approche a été enrichie par l’utilisation de souris transgéniques Fra2, qui sont un nouveau modèle de ScS caractérisé par une fibrose pulmonaire inflammatoire et une HTAP. L’effet de l’anticorps anti-OX40L a été remarquable dans ce contexte avec au scanner et à l’histologie une réduction significative de la fibrose pulmonaire, du remodelage vasculaire et des signes d’HTAP. Enfin, l’étude longitudinale des sérums collectés dans notre cohorte de patients a montré que la forme soluble d’OX40L pourrait être un potentiel biomarqueur dans la ScS pour identifier les patients à risque de progression sévère. (...) / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune orphan disease which is characterized by alterations of the microvasculature and fibrosis affecting the skin and internal organs. SSc is the most severe connective tissue disease associated with a high risk of mortality. Until now, there is no effective treatment to counteract the fibrotic process and to improve the prognosis of this disease. SSc results from the combination of genetic and environmental factors. TNFSF4 was recently identified as a genetic risk factor for SSc. TNFSF4 encodes OX40L, which is involved in late T-cell co-stimulatory signals, but also in generation and reactivation of memory T cells and promotion of plasma cell phenotype. OX40L blockade was effective in reducing clinical symptoms in several animal models of autoimmune and inflammatory diseases, such as rheumatoid arthritis, colitis, asthma or graft-versus-host-disease. The anti-OX40L antibody presents the advantage of a targeted therapy against pathogenic recently activated T cells, which might not expose patients to increased risk of infections, unlike other conventional immunosuppressants. Following the observation of an increased expression of OX40L in fibrotic skin in SSc-patients, we aimed to investigate the contribution of OX40L in SSc and to assess the efficacy of a targeted therapy against OX40L in SSc, using complementary experimental mouse models. First, we characterized the optimum in vivo parameters required for the successful induction of dermal fibrosis in the widely used bleomycin-induced dermal fibrosis mouse model, which is usually the first step in most of pharmacological studies assessing anti-fibrotic therapies. We also aimed to determine whether ultrasonography could be used to assess skin fibrosis in this model, but our results showed that it was not efficient enough to assess dermal thickening in this model. Invalidation of OX40L prevented dermal fibrosis in the bleomycin mouse model. Then pharmacologic approaches, using a monoclonal anti-OX40L antibody, demonstrate that blockade of OX40L not only prevented dermal fibrosis, but also induced regression of established fibrosis in this model. We also showed that OX40L acts directly on both dermal fibroblasts and inflammatory cells and on cytokine release (IL-6, TNF-α), by regulating NF kappa B and AP 1 pathways. We observed that OX40L inhibition interfered with early inflammatory stages of matrix remodeling using the excisional wound healing mouse model. Conversely, blocking OX40L did not display antifibrotic properties in the non-inflammatory Tsk-1 mouse model. Given that interstitial lung involvement and pulmonary arterial hypertension (PAH) are key prognostic factors in SSc, we aimed to assess the effects of OX40L pharmacological inhibition in a new murine model: the fra-2 transgenic mice, which are characterized by both fibrosing alveolitis and PAH. In this model, using both CT-scan and histology, we demonstrated that mice treated by anti-OX40L antibody were markedly protected from fibrosing alveolitis and vessel remodeling leading to PAH. Furthermore, longitudinal analyses of our cohort of SSc-patients showed that soluble OX40L is a promising serum biomarker to predict the worsening of lung and skin fibrosis. Altogether, our results show that OX40L is as an attractive target in inflammation-driven fibrosis. This work also strengthens the relation between inflammation and fibrosis in SSc-pathogenesis. This work underlines advantages of combination of several animal models in translational approach to SSc.

Les pemphigus sont des maladies auto-immunes spécifiques d'organe qui affectent la peau et les muqueuses. Ils sont caractérisés par la production d'autoanticorps pathogènes dirigés contre des protéines du desmosome, plus particulièrement, les desmogléines qui permettent l'adhésion entre eux des kératinocytes de l'épiderme. Au cours des pemphigus superficiels (PS), la réponse auto-immune est dirigée contre la desmogléine 1 (Dsg1). Chez les malades atteints de PS, des lymphocytes T autoréactifs vis à vis de la Dsg1 sont présents et interviennent dans la production d'autoanticorps anti-Dsg1. Cet autoantigène est aussi la cible de la réponse auto-immune au cours d'autres formes de pemphigus tels que les pemphigus vulgaire et paranéoplasique et par conséquent, semble jouer un rôle clé dans ces maladies. Depuis plus d'une décennie, le rôle de l'autoantigène lui-même dans l'initiation, la propagation et la pérennisation de la réponse auto-immune a été conforté par de nombreux arguments expérimentaux. En nous appuyant sur ce concept, nous avons entrepris d'étudier l'intervention de la Dsg1 dans les mécanismes physiopathologiques qui concourent au développement des pemphigus. Dans un premier temps, nous avons démontré l'expression dans l'épiderme humain, d'une isoforme tronquée de la Dsg1 générée par épissage alternatif des transcrits DSG1. Cette Dsg1 soluble est porteuse d'une séquence peptidique spécifique qui se fixe avec une forte affinité à certaines molécules HLA de classe II de susceptibilité au PS en particulier, à la molécule DRB1*0102. Ce peptide est par ailleurs capable d'induire la prolifération de cellules mononuclées du sang périphérique chez 50% des malades atteints de la forme sporadique de PS. Ces patients expriment des allèles HLA de classe II associés à la maladie et deux d'entre eux sont porteurs de la molécule DRB1*0102. Ainsi, la modification de la Dsg1 par épissage alternatif pourrait-elle intervenir dans la rupture de la tolérance au niveau du compartiment T chez les individus prédisposés génétiquement par l'expression de certains allèles HLA de classe II et in fine, conduire à l'initiation d'une réponse auto-immune B dirigée contre la Dsg1. En second lieu, nous avons observé une diversification de la réponse anticorps chez des souris normales immunisées avec la région extracellulaire recombinante de la Dsg1. Les animaux immunisés produisent non seulement des IgG dirigées contre la Dsg1 mais aussi, contre d'autres protéines de l'épiderme. Nous avons dérivé cinq anticorps monoclonaux à partir des splénocytes isolés de ces souris et montré que trois d'entre eux sont dirigés spécifiquement contre la Dsg1. Les deux autres, 10A1 et CK1, ne réagissent pas avec la Dsg1 mais reconnaissent des protéines épidermiques de plus haut poids moléculaire, compatible avec ceux des autoantigènes de la famille des plakines spécifiquement reconnus par les anticorps au cours du pemphigus paranéoplasique, e.g. l'envoplakine et la périplakine. Grâce à une analyse protéomique ciblée combinant l'immunocriblage d'une carte protéique 2D d'épiderme humain et la spectrométrie de masse MALDI-ToF, nous avons montré que la protéine cible du 10A1 est l'envoplakine, et que le CK1 reconnaît à la fois l'envoplakine et la périplakine. Ainsi, en accord ce modèle expérimental murin, la réponse B anti-Dsg1 pourrait-elle gouverner la réponse vis à vis d'autres protéines du desmosome en particulier, les plakines, mimant de ce fait la diversité de la réponse auto-immune B observée au cours du pemphigus paranéoplasique. Enfin, nous démontrons par des analyses en PCR que l'ARNm de la Dsg1 est exprimé dans le thymus humain normal, que son expression augmente avec l'âge et de ce fait, que l'absence de l'expression thymique de cette autoantigène ne constitue pas l'origine de la rupture de la tolérance qui concoure au développement des PS. Nos résultats mettent en exergue le rôle la Dsg1 dans le processus auto-immun au cours des pemphigus, d'une part, à la phase d'initiation, avec l'intervention de cet autoantigène modifié par épissage alternatif dans la réponse lymphocytaire T et d'autre part, à la phase de propagation, avec la diversification de la réponse anticorps vis à vis d'autres antigènes desmosomiaux induite chez des souris normales immunisées avec cet autoantigène.