Die Funktionsweise des VELscopes basiert auf der natürlichen Gewebefluoreszenz der Schleimhaut. Das VELscope emittiert blaues Licht mit einer Wellenlänge von 400-460 nm auf die Oberfläche der Mundschleimhaut. In maligne verändertem Gewebe ändert sich durch Absorption und Streuung das Fluoreszenzverhalten. Für den Behandler wird dies durch eine Abschwächung des grünen Lichtes und damit einer dunkel bis schwarz erscheinenden Schleimhaut im VELscope-Verfahren sichtbar gemacht. Es wurden 133 Patienten der Sprechstunde für potentiell maligne Veränderungen der Sektion für klinische und experimentelle Orale Medizin der Universitätszahnmedizin Leipzig untersucht. Das VELscope-Gerät zeigt bei der Erkennung eines Plattenepithelkarzinoms eine Sensitivität von 100 % und eine Spezifität von 76 %. Für die Erkennung einer Leukoplakie liegen Werte von 54 % für die Sensitivität und 77 % für die Spezifität vor. Die Sensitivität für potentiell maligne Veränderungen liegt bei 77 % und die Spezifität bei 87 %. Die Ergebnisse für die Erkennung einer Dysplasie sind 79 % für die Sensitivität und 33 % für die Spezifität bei einer Gesamtzahl von 35 festgestellten Dysplasien. Die nicht unerhebliche Anzahl falsch-positiver VELscope-Befunde und die damit verbundenen niedrigen Werte für die Spezifität wurden nicht nur in vorliegender Arbeit belegt und kritisiert .Besonders erythematöse und ulzerierende Läsionen gehen mit einem erhöhten Fluoreszenzverlust einher. Das große Defizit der Methode ist die niedrige Spezifität und schwierige Interpretation, die zu einer erhöhten Rate von unnötigen Überweisungen und somit zu vermeidbarem Stress für den Patienten und erhöhten finanziellen Kosten führen würde.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ................................................................................. III 1 Einführung ............................................................................................... 1 1.1 Mundschleimhauterkrankungen ........................................................ 2 1.1.1 Orale Epitheliale Dysplasie ......................................................... 2 1.1.2 Potentiell maligne Veränderungen .............................................. 4 1.1.3 Orales Plattenepithelkarzinom .................................................. 14 1.2 Diagnostik zur Früherkennung von Karzinomen ............................. 19 1.2.1 Palpation und Inspektion .......................................................... 19 1.2.2 Zytologische Untersuchung ...................................................... 20 1.2.3 Chirurgische Biopsie ................................................................. 23 1.2.4 Weitere diagnostische Möglichkeiten ....................................... 24 1.3 Autofluoreszenz .............................................................................. 27 1.3.1 VELscope- Funktionsweise ...................................................... 27 1.3.2 Diaskopie .................................................................................. 30 2 Ziele der Studie ...................................................................................... 31 3 Materialien und Methoden ..................................................................... 32 3.1 Patientenkollektiv ............................................................................ 32 3.2 Durchführung der Studie ................................................................. 32 3.3 Beurteilungsverfahren ..................................................................... 34 3.4 Auswertung ..................................................................................... 37 4 Ergebnisse ............................................................................................. 40 4.1 Patientendaten ................................................................................ 40 4.2 Klinische Befunde und Diagnosen .................................................. 41 4.3 VELscope-Befunde ......................................................................... 43 4.4 Biopsie-Entnahmestellen ................................................................ 45 4.5 Diagnostische Treffsicherheit .......................................................... 46 4.5.1 Positiver und negativer prädiktiver Wert ................................... 49 4.6 Ergebnisse auf Lokalisationen bezogen .......................................... 50 5 Diskussion ............................................................................................. 54 5.1 Bewertung der Fluoreszenzbefunde hinsichtlich des Patientenkollektivs .................................................................................... 55 5.2 Bewertung und Vergleich der Fluoreszenzbefunde ......................... 56 5.3 Bewertung unterschiedlicher Mundschleimhautveränderungen mittels Autofluoreszenz ........................................................................................ 60 5.4 Bewertung unterschiedlicher Lokalisationen mittels Autofluoreszenz . ........................................................................................................ 62 5.5 Bewertung der Quantifizierung der Fluoreszenzbefunde ................ 63 5.6 Bewertung der Methodik ................................................................. 66 5.7 Autofluoreszenzdiagnostik im Vergleich mit anderen Methoden zur Früherkennung von Mundkrebs ................................................................ 71 6 Zusammenfassung der Arbeit ................................................................ 76 7 Literaturverzeichnis ................................................................................ 80 8 Anlagen ................................................................................................. 96 8.1 Ergebnisse für Lokalisationen für b) und c) ..................................... 96 8.2 Kreuztabellen .................................................................................. 99 8.3 Aufklärungsbogen für Patienten .................................................... 100 8.4 Dokumentationsbogen .................................................................. 102 9 Selbstständigkeitserklärung ................................................................. 103 10 Danksagung ..................................................................................... 104 11 Lebenslauf ........................................................................................ 105

Tumoren der Mundhöhle und der Lippen sind laut Angaben der Internationalen Agen-tur für Krebsforschung (IARC) ursächlich für jährlich circa 150.000 Sterbefälle welt-weit. Über 90 % der Tumoren sind orale Plattenepithelkarzinome. Diese entstehen zum Großteil aus oralen potentiell malignen Veränderungen, wie Leukoplakien, Erythroplakien und dem oralen Lichen planus. Eine frühe Diagnostik der malignen Transformation dieser Vorläuferläsionen bietet eine gute Möglichkeit die Erkrankung besser zu behandeln und die Mortalität zu senken. Ziel dieser Arbeit ist es, das VELscope®-Gerät, das basierend auf Autofluoreszenz zur vereinfachten und frühen Diagnostik entwickelt wurde, im Rahmen einer klini-schen Anwendung in einer unselektierten Patientenpopulation ohne Risikofaktoren zu beurteilen. Zudem soll beurteilt werden, inwieweit das Gerät geeignet ist, um einem allgemein tätigen Zahnarzt als Hilfsmittel zur Entscheidungsfindung bei verdächtigen Schleimhautläsionen zu dienen und inwieweit dafür eine Einteilung des Fluoreszenzverlustes in verschiedene Stufen von Vorteil sein kann. Es wurden dazu 483 Patienten mittels VELscope®-Gerät untersucht. Die Ergebnisse für die Diagnostik von Mundhöhlenkarzinomen liegen bei einer Sensitivität von 100 % (95 % KI: 29,24 % - 100 %) und einer Spezifität von 52 % (95 % KI: 47,92 % - 57,04 %). Bei einer abgestuften Einschätzung werden geringgradige Fluoreszenzverluste als negatives Ergebnis gewertet. Dabei sinkt die Sensitivität auf 66,7 % (95 % KI: 9,43 – 99,16 %) und die Spezifität steigt auf 70,6 % (95 % KI: 66,33 % - 73,67 %). Durch die geringe Spezifität und die bei Abstufung eingeschränkte Sensitivität sind die Autofluoreszenz und deren Quantifizierung vorerst nicht für den Gebrauch beim allgemein tätigen Zahnarzt zu empfehlen.

Tumoren der Mundhöhle und der Lippen sind laut Angaben der Internationalen Agen-tur für Krebsforschung (IARC) ursächlich für jährlich circa 150.000 Sterbefälle welt-weit. Über 90 % der Tumoren sind orale Plattenepithelkarzinome. Diese entstehen zum Großteil aus oralen potentiell malignen Veränderungen, wie Leukoplakien, Erythroplakien und dem oralen Lichen planus. Eine frühe Diagnostik der malignen Transformation dieser Vorläuferläsionen bietet eine gute Möglichkeit die Erkrankung besser zu behandeln und die Mortalität zu senken. Ziel dieser Arbeit ist es, das VELscope®-Gerät, das basierend auf Autofluoreszenz zur vereinfachten und frühen Diagnostik entwickelt wurde, im Rahmen einer klini-schen Anwendung in einer unselektierten Patientenpopulation ohne Risikofaktoren zu beurteilen. Zudem soll beurteilt werden, inwieweit das Gerät geeignet ist, um einem allgemein tätigen Zahnarzt als Hilfsmittel zur Entscheidungsfindung bei verdächtigen Schleimhautläsionen zu dienen und inwieweit dafür eine Einteilung des Fluo-reszenzverlustes in verschiedene Stufen von Vorteil sein kann. Es wurden dazu 483 Patienten mittels VELscope®-Gerät untersucht. Die Ergebnisse für die Diagnostik von Mundhöhlenkarzinomen liegen bei einer Sensitivität von 100 % (95 % KI: 29,24 % - 100 %) und einer Spezifität von 52 % (95 % KI: 47,92 % - 57,04 %). Bei einer abgestuften Einschätzung werden geringgradige Fluoreszenzverluste als negatives Ergebnis gewertet. Dabei sinkt die Sensitivität auf 66,7 % (95 % KI: 9,43 – 99,16 %) und die Spezifität steigt auf 70,6 % (95 % KI: 66,33 % - 73,67 %). Durch die geringe Spezifität und die bei Abstufung eingeschränkte Sensitivität sind die Autofluoreszenz und deren Quantifizierung vorerst nicht für den Gebrauch beim allgemein tätigen Zahnarzt zu empfehlen.

Hintergrund: Tumoren des zentralen Nervensystems zählen zu den seltenen Krebserkrankungen des Erwachsenenalters, aber haben eine vergleichsweise hohe Letalität. Bei allen Hirntumorerkrankungen inklusive der Hirnmetastasen bestehen zudem besondere Anforderungen aufgrund der intrakraniellen Lage hinsichtlich der chirurgischen Therapie. Eine Operation stellt meist eine Gratwanderung zwischen Tumorresektion und Schädigung des umgebenden Hirnparenchyms dar. Da maligne Hirntumoren das umgebende Hirngewebe infiltrieren, ist die optische und taktile Unterscheidung insbesondere von Gliomen und deren Infiltrationsrändern vom umgebenden Hirnparenchym durch Operierende aber nicht sehr sensitiv. Da der Residualtumor den größten prädiktiven Faktor des Patient:innen-Überlebens darstellt, wird klar, dass sensitive Methoden entwickelt werden müssen, um es Operierenden zu erleichtern, intraoperativ Residualtumor zu erkennen und zu resezieren. Neben den bereits etablierten Verfahren der intraoperativen Bildgebung wie der Neuronavigation, der intraoperativen MRT oder der 5-ALA-Fluoreszenzmikroskopie, ist die schnitt- und färbefreie Technik der Raman-Spektroskopie in den letzten Jahren zur Unterscheidung von Tumor und Hirnparenchym sowie zur Erkennung von infiltrativ wachsenden Tumoren hervorgetreten. Die Raman-Spektroskopie basiert auf der Detektion von inelastisch gestreutem Licht an Molekülen im Sinne des Raman-Effekts. So kann in Sekundenschnelle eine biochemische Signatur des untersuchten Gewebes erstellt werden. Darüber hinaus stellt die Raman-Spektroskopie ein Autofluoreszenzspektrum bereit, welches ebenso zur Analyse von Gewebe benutzt werden kann. Fragestellung: Aufgrund der Notwendigkeit einer besseren intraoperativen Visualisierung von Tumorgewebe in der Neurochirurgie, soll in dieser Arbeit das Potenzial der intraoperativen in-situ-Raman-Spektroskopie beurteilt werden. Neben den intraoperativ erhobenen Ramanspektren, sollen insbesondere die oft unbeachteten Autofluoreszenzeigenschaften von Tumor und umliegendem Gewebe auf mögliche Unterschiede genauer untersucht werden. Einerseits soll aufgrund der fehlenden Erfahrung mit der kommerziell erhältlichen fiberoptischen Sonde die spektrale Qualität untersucht werden sowie Validität und Reliabilität des Messsystems beurteilt werden. Für einen intraoperativen Einsatz muss andererseits die Prozedur der Sterilisation entwickelt sowie die Integration in bestehende Arbeitsabläufe und Störfaktoren bei Messungen im Operationssaal bewertet werden.:Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis III Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII Symbolverzeichnis IX 1 Einleitung 1 1.1 Hintergrund 1 1.2 Intraoperative Bildgebung 2 1.2.1 Neuronavigation 2 1.2.2 Intraoperative MRT 3 1.2.3 5-ALA-Fluoreszenz-gestützte Resektion 3 1.2.4 Raman-Spektroskopie 4 1.3 Motivation des Projektes 6 2 Material und Methoden 7 2.1 Gewebe 7 2.2 Histologie 7 2.2.1 Fixierung und Einbettung 7 2.2.2 Gefrierschnitte 8 2.2.3 Färbungen 8 2.2.4 Bestimmung der Zellzahl und des Proliferationsindex 11 2.3 Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 12 2.3.1 Aufbau des faserbasierten Messsystems 12 2.3.2 Faserbasierte Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 14 2.3.3 Referenz-Raman-Spektroskopie mit mikroskopischem System 17 2.4 Datenverarbeitung und -aufbereitung 17 2.4.1 Bestimmung der Autofluoreszenzintensität 18 2.4.2 Prozessierung des Rohspektrums 18 2.4.3 Ramanbandenintensität 19 2.4.4 Statistische Analyse 19 2.4.5 Clusteranalyse 19 3 Ergebnisse 20 3.1 Testung des faserbasierten Messsystems und Etablierung von Messprotokollen 20 3.1.1 Qualitative Beurteilung des Spektrums 20 3.1.2 Artefaktelimination 24 3.1.3 Festlegung optimaler Messparameter 27 3.1.4 Messtiefe 30 3.2 Ex-vivo-Autofluoreszenz und Raman-Spektroskopie 31 3.2.1 Autofluoreszenzintensität 32 3.2.2 Ramanspektren 35 3.3 Intraoperative in-situ-Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 47 3.3.1 Sondenaufbereitung 47 3.3.2 Evaluation der Signalstärke nach 9, 16, 21 und 31 vollständigen Wiederaufbereitungszyklen 47 3.3.3 Spektrale Qualität im Operationssaal 48 3.3.4 Analyse der Spektren 53 3.3.5 Histopathologie 63 3.3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse 64 3.3.7 Darstellung ausgewählter Patient:innen 66 4 Diskussion 74 4.1 Testung des faserbasierten Messsystems und Etablierung von Messprotokollen 74 4.2 Ex-vivo-Autofluoreszenz und Raman-Spektroskopie 79 4.3 Intraoperative in-situ-Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 81 4.4 Schlussfolgerung 89 5 Zusammenfassung 91 6 Summary 95 Literaturverzeichnis X Danksagungen XVIII Anhang XIX / :Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis III Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII Symbolverzeichnis IX 1 Einleitung 1 1.1 Hintergrund 1 1.2 Intraoperative Bildgebung 2 1.2.1 Neuronavigation 2 1.2.2 Intraoperative MRT 3 1.2.3 5-ALA-Fluoreszenz-gestützte Resektion 3 1.2.4 Raman-Spektroskopie 4 1.3 Motivation des Projektes 6 2 Material und Methoden 7 2.1 Gewebe 7 2.2 Histologie 7 2.2.1 Fixierung und Einbettung 7 2.2.2 Gefrierschnitte 8 2.2.3 Färbungen 8 2.2.4 Bestimmung der Zellzahl und des Proliferationsindex 11 2.3 Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 12 2.3.1 Aufbau des faserbasierten Messsystems 12 2.3.2 Faserbasierte Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 14 2.3.3 Referenz-Raman-Spektroskopie mit mikroskopischem System 17 2.4 Datenverarbeitung und -aufbereitung 17 2.4.1 Bestimmung der Autofluoreszenzintensität 18 2.4.2 Prozessierung des Rohspektrums 18 2.4.3 Ramanbandenintensität 19 2.4.4 Statistische Analyse 19 2.4.5 Clusteranalyse 19 3 Ergebnisse 20 3.1 Testung des faserbasierten Messsystems und Etablierung von Messprotokollen 20 3.1.1 Qualitative Beurteilung des Spektrums 20 3.1.2 Artefaktelimination 24 3.1.3 Festlegung optimaler Messparameter 27 3.1.4 Messtiefe 30 3.2 Ex-vivo-Autofluoreszenz und Raman-Spektroskopie 31 3.2.1 Autofluoreszenzintensität 32 3.2.2 Ramanspektren 35 3.3 Intraoperative in-situ-Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 47 3.3.1 Sondenaufbereitung 47 3.3.2 Evaluation der Signalstärke nach 9, 16, 21 und 31 vollständigen Wiederaufbereitungszyklen 47 3.3.3 Spektrale Qualität im Operationssaal 48 3.3.4 Analyse der Spektren 53 3.3.5 Histopathologie 63 3.3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse 64 3.3.7 Darstellung ausgewählter Patient:innen 66 4 Diskussion 74 4.1 Testung des faserbasierten Messsystems und Etablierung von Messprotokollen 74 4.2 Ex-vivo-Autofluoreszenz und Raman-Spektroskopie 79 4.3 Intraoperative in-situ-Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 81 4.4 Schlussfolgerung 89 5 Zusammenfassung 91 6 Summary 95 Literaturverzeichnis X Danksagungen XVIII Anhang XIX

Metal nanoparticles have recently gained popularity in many research areas due to their nanosize-related properties. Depending on the size of the metal nanoparticle, their mode of interaction with electromagnetic radiation and the outcome of this interaction vary; in turn the effect exerted on a protein which is conjugated to a nanoparticle varies, because different sized nanoparticles demonstrate different modes of energy transfer with electromagnetic radiation and molecules conjugated to them. Very small cluster with sizes around 1 – 1.2 nm tend to get excited by incident light and emit fluorescence, whereas larger nanoparticles absorb the incoming light very strongly due to their LSPR. In this study we observed the outcomes of the interaction between two types of nanoparticles, namely gold and gold/silver alloyed nanoparticles with the fluorescence emission of two fluorophores, namely eGFP and rPhiYFP; and demonstrated a bioassay where the fluorescence modulation by gold nanoparticles can be used as the sensing strategy. Lastly, we demonstrated the potential of autofluorescent gold nanoparticles as intracellular reporters.

Metal nanoparticles have recently gained popularity in many research areas due to their nanosize-related properties. Depending on the size of the metal nanoparticle, their mode of interaction with electromagnetic radiation and the outcome of this interaction vary; in turn the effect exerted on a protein which is conjugated to a nanoparticle varies, because different sized nanoparticles demonstrate different modes of energy transfer with electromagnetic radiation and molecules conjugated to them. Very small cluster with sizes around 1 – 1.2 nm tend to get excited by incident light and emit fluorescence, whereas larger nanoparticles absorb the incoming light very strongly due to their LSPR. In this study we observed the outcomes of the interaction between two types of nanoparticles, namely gold and gold/silver alloyed nanoparticles with the fluorescence emission of two fluorophores, namely eGFP and rPhiYFP; and demonstrated a bioassay where the fluorescence modulation by gold nanoparticles can be used as the sensing strategy. Lastly, we demonstrated the potential of autofluorescent gold nanoparticles as intracellular reporters.

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