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Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Human cord blood (CB) derived circulating endothelial colony forming cells (ECFCs) display a hierarchy of clonogenic proliferative potential and possess de novo vessel forming ability upon implantation in immunodeficient mice. Since survival of ECFC post-implantation is a critical variable that limits in vivo vasculogenesis, we tested the hypothesis that activation of Notch signaling or co-implantation of ECFC with human platelet lysate (HPL) would enhance cultured ECFC vasculogenic abilities in vitro and in vivo. Co-implantation of ECFCs with Notch ligand Delta-like 1 (DL1) expressing OP9 stromal cells (OP9-DL1) decreased apoptosis of ECFC in vitro and increased vasculogenesis of ECFC in vivo. The co-culture of ECFC with HPL diminished apoptosis of ECFC by altering the expression of pro-survival molecules (pAkt, pBad and Bcl-xL) in vitro and increased vasculogenesis of human EC-derived vessels both in vitro and in vivo. Thus, activation of the Notch pathway by OP9-DL1 stromal cells or co-implantation of ECFC with HPL enhances vasculogenesis and augments blood vessel formation by diminishing apoptosis of the implanted ECFC. The results from this study will provide critical information for the development of a cell therapy for limb and organ re-vascularization that can be applied to recovery of ischemic tissues in human subjects.

Endometriosis is a gynecological disease in which endometrial glands and stroma are present outside the uterus. Pelvic pain, infertility and decreased quality of life are the main problems caused by this disease carrying epidemiological and social impact. Peritoneal endometriosis which is characterized by the presence of red, black and white pelvic endometriotic lesions is clearly a multifactorial pathology associated with a local inflammatory response in the pelvic cavity. In vitro studies suggest that the transcription factor nuclear factor-kappaB (NF-êB) is implicated in the transduction of proinflammatory signals in endometriosis. The aim of this study was to investigate the involvement and role of the NF-êB pathway in endometriosis in vivo. Firstly, NF-êB activation and intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 expression were investigated in thirty-six peritoneal endometriotic lesions from women. Constitutive NF-êB activation, involving p65- and p50-containing dimers, was demonstrated in peritoneal endometriotic lesions by electrophoretic mobility shift assays and supershift analyses, as well as NF-êB (p65) DNA-binding activity immunodetection assays. NF-êB activation and ICAM-1 expression were significantly higher in red lesions than black lesions, while IêBá (NF-êB inhibitory protein) expression was constant, as shown by Western blot analyses. Secondly, endometriosis was induced in nude mice by intraperitoneal injection of fluorescent labeled menstrual endometrium. Two NF-êB inhibitors (BAY 11-7085 and SN-50) were injected intraperitoneally and endometriotic lesions were recovered on day 5. Both NF-êB inhibitors induced a significant reduction in lesion development compared to control mice. NF-êB activation and ICAM-1 expression of endometriotic lesions were significantly reduced in treated mice, and cell proliferation in BAY 11-7085-treated mice. Both inhibitors produced a significant increase in apoptosis of endometriotic lesions, as assessed by active caspase-3 immunostaining and the TUNEL method. In conclusion, this is the first study to show constitutive NF-êB activation in peritoneal endometriotic lesions collected from women and during the initial development of endometriotic lesions in an animal model. Differential levels of NF-êB activation have been established between red and black lesions, providing more evidence on the distinct inflammatory status of these two types of peritoneal endometriotic lesions. In addition, this study offers further insight into the pathways implicated in NF-êB activation in endometriotic lesions, showing the involvement of p50/p65 dimers and suggesting participation of the canonical pathway of NF-êB activation. This study also demonstrates, for the first time, that NF-êB inhibition reduces the initial development of endometriotic lesions by inhibiting the inflammatory response and cell proliferation, and inducing apoptosis of endometriotic lesions. The NF-êB pathway therefore looks to be a promising therapeutic target for endometriosis prevention and treatment.

Die Entwicklung innovativer Therapiekonzepte für die Knochenregeneration erfordert validierte segmentale Knochendefekt-Tiermodelle. Dabei ist das Mausmodell für die präklinische Testung von zentraler Bedeutung, jedoch fehlen in der wissenschaftlichen Literatur bislang Angaben zu validierten, extern stabilisierenden kritischen segmentalen Knochendefektmodellen an der immundefizienten Maus. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung und in vivo Evaluierung eines zuverlässigen und einfach zu handhabenden Modells für extern stabilisierte kritische Knochendefekte an der immundefizienten Maus. Dreißig männliche nu/nu-Mäuse (40,7±2,8 g, 95±2,6 d) wurden mittels Isofluraninhalation narkotisiert und anschließend ein externer Fixateur (MouseExFix, RISystem, AO Research Institute Davos, Schweiz) am rechten Femur angebracht. Femorale Knochendefekte der Länge 1 mm (n=10), 2 mm (n=10) und 3 mm (n=10) wurden erzeugt. Der Wundverschluss erfolgte mit Einzelknopfnähten. Röntgenaufnahmen wurden unmittelbar postoperativ und im Folgenden alle zwei Wochen innerhalb des Beobachtungszeitraums von zwölf Wochen angefertigt und im Hinblick auf Knochenregeneration und –fusion ausgewertet. Weiterhin wurden histomorphologische, histomorphometrische, immunhistochemische und µCT-Analysen zur dreidimensionalen und zellulären Beurteilung der Knochenheilung angefertigt. Alle Tiere überlebten die Operation. Sechs Tiere starben innerhalb des Beobachtungszeitraums als Folge von starkem Blutverlust (n=1), Infektion (n=1), Pinlockerung, welche die Euthanasie erforderlich machte (n=2) und durch Komplikationen bei der Anästhesie (n=2). Die µCT-Analyse nach zwölf Wochen zeigte, dass 3/8 der 1 mm-Defekte, 5/8 der 2 mm-Defekte und 8/8 der 3 mm-Defekte eine Pseudarthrose aufwiesen. Das mittlere Defektvolumen stieg signifikant (p<0,001) mit der Größe des Defektes und betrug 0,36±0,42 mm³ (1 mm-Gruppe), 1,4±0,88 mm³ (2 mm-Gruppe), bzw. 2,88±0,28 mm³ (3 mm-Gruppe). Die mittlere Defektgröße verringerte sich entsprechend um 77,6% (1 mm-Gruppe), 56,8% (2 mm-Gruppe), bzw. 28,6% (3 mm-Gruppe). Die histomorphologischen, histomorphometrischen und immunhistochemischen Analysen zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den drei experimentellen Gruppen. Das verwendete MouseExFix-System ist ein zuverlässiges und einfach zu handhabendes Verfahren zur Stabilisierung eines kritischen segmentalen Knochendefekts an der immundefizienten Maus, wenn ein 3 mm-Defekt erzeugt wird. Das im Rahmen der Studie entwickelte und validierte murine extern stabilisierte, segmentale kritische Knochendefektmodell ermöglicht die präklinische Evaluierung von Konzepten zur lokalen Knochenregeneration inklusive der Verwendung allo- und xenogener Zellen. / The development of innovative therapies for bone regeneration requires the use of advanced site-specific bone defect small animal models. In this context, murine models are of major importance as they allow for sufficient sample sizes prior to preclinical testing using larger animals. Owing to the small dimensions of the murine femur only a few custom fabricated fixation devices have been described in the literature so far. The aim of this investigation was to develop and validate a new, externally fixated critical size bone defect model for immunodeficient mice. Thirty male nu/nu mice (40.7 ± 2.8 g, 95 ± 2.6 days old) were anesthetized by isoflurane inhalation and an external fixation device (MouseExFix, RISystem, AO Research Institute Davos, Switzerland) was attached to the right femur. Femoral bone defects of 1 mm (n=10), 2 mm (n=10) and 3 mm (n=10) were created. Wounds were closed without any additional treatment. X-ray films obtained immediately after surgery and every 2 weeks postoperatively during the 12 week postoperative observation period were evaluated for bony regeneration and fusion. Furthermore, histomorphology, histomorphometry, immunohistochemistry and µCT analysis were performed. All of the animals survived the operation. Twenty four out of 30 animals reached the twelfth postoperative week. µCT analyses after twelve weeks showed that 3/8 of the 1 mm defects, 5/8 of the 2 mm defects and 8/8 of the 3 mm defects remained as nonunions. The defect volume was 0.36 ± 0.42 mm³ (1 mm group), 1.40 ± 0.88 mm³ (2 mm group), and 2.88 ± 0.28 mm³ (3 mm group) (p<0.001, between all groups). The defect size decreased by 77.6% (1-mm group), 56.8% (2-mm group) and 28.6% (3-mm group) (p=0.152, between all groups). Our method using the MouseExFix device has proven to be a reliable and easy-to-handle external fixation system for the stabilization of critical-size segmental bone defects in immundeficient mice when 3 mm defects are generated. This mouse model allows for high-throughput translational evaluation of concepts for site-specific bone regeneration including strategies using allogenic and xenogenic cell types.

Micro (mi)RNAs have recently been found to play an important role in cancer biology. In order to further understand how miRNAs affect prostate tumour progression, we evaluated miRNA expression in two invasive prostate tumour lines, PC3 and DU145. We then focused our evaluation on a novel miRNA, miR-105, whose levels were significantly decreased in both tumour cell lines as compared to normal prostate epithelial cells. As miR-105 levels were reduced in prostate tumour cell lines, we restored its expression following transfection of cells with mimic constructs to over-express miR-105 in both cell lines, in order to determine its effect on various tumourigenic properties. Over-expression caused decreased tumour cell proliferation, anchorage-independent growth and invasion in vitro and inhibited tumour growth in vivo. We further identified CDK6 as a putative target of miR-105, which likely contributed to its inhibition of tumour cell growth. Our results suggest that miR-105 inhibits tumour cell proliferation and may be an interesting target to regulate tumour growth or potentially used as a biomarker to differentiate between less and more aggressive tumours in patients.

Micro (mi)RNAs have recently been found to play an important role in cancer biology. In order to further understand how miRNAs affect prostate tumour progression, we evaluated miRNA expression in two invasive prostate tumour lines, PC3 and DU145. We then focused our evaluation on a novel miRNA, miR-105, whose levels were significantly decreased in both tumour cell lines as compared to normal prostate epithelial cells. As miR-105 levels were reduced in prostate tumour cell lines, we restored its expression following transfection of cells with mimic constructs to over-express miR-105 in both cell lines, in order to determine its effect on various tumourigenic properties. Over-expression caused decreased tumour cell proliferation, anchorage-independent growth and invasion in vitro and inhibited tumour growth in vivo. We further identified CDK6 as a putative target of miR-105, which likely contributed to its inhibition of tumour cell growth. Our results suggest that miR-105 inhibits tumour cell proliferation and may be an interesting target to regulate tumour growth or potentially used as a biomarker to differentiate between less and more aggressive tumours in patients.

Micro (mi)RNAs have recently been found to play an important role in cancer biology. In order to further understand how miRNAs affect prostate tumour progression, we evaluated miRNA expression in two invasive prostate tumour lines, PC3 and DU145. We then focused our evaluation on a novel miRNA, miR-105, whose levels were significantly decreased in both tumour cell lines as compared to normal prostate epithelial cells. As miR-105 levels were reduced in prostate tumour cell lines, we restored its expression following transfection of cells with mimic constructs to over-express miR-105 in both cell lines, in order to determine its effect on various tumourigenic properties. Over-expression caused decreased tumour cell proliferation, anchorage-independent growth and invasion in vitro and inhibited tumour growth in vivo. We further identified CDK6 as a putative target of miR-105, which likely contributed to its inhibition of tumour cell growth. Our results suggest that miR-105 inhibits tumour cell proliferation and may be an interesting target to regulate tumour growth or potentially used as a biomarker to differentiate between less and more aggressive tumours in patients.

Die Entwicklung innovativer Therapiekonzepte für die Knochenregeneration erfordert validierte segmentale Knochendefekt-Tiermodelle. Dabei ist das Mausmodell für die präklinische Testung von zentraler Bedeutung, jedoch fehlen in der wissenschaftlichen Literatur bislang Angaben zu validierten, extern stabilisierenden kritischen segmentalen Knochendefektmodellen an der immundefizienten Maus. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung und in vivo Evaluierung eines zuverlässigen und einfach zu handhabenden Modells für extern stabilisierte kritische Knochendefekte an der immundefizienten Maus. Dreißig männliche nu/nu-Mäuse (40,7±2,8 g, 95±2,6 d) wurden mittels Isofluraninhalation narkotisiert und anschließend ein externer Fixateur (MouseExFix, RISystem, AO Research Institute Davos, Schweiz) am rechten Femur angebracht. Femorale Knochendefekte der Länge 1 mm (n=10), 2 mm (n=10) und 3 mm (n=10) wurden erzeugt. Der Wundverschluss erfolgte mit Einzelknopfnähten. Röntgenaufnahmen wurden unmittelbar postoperativ und im Folgenden alle zwei Wochen innerhalb des Beobachtungszeitraums von zwölf Wochen angefertigt und im Hinblick auf Knochenregeneration und –fusion ausgewertet. Weiterhin wurden histomorphologische, histomorphometrische, immunhistochemische und µCT-Analysen zur dreidimensionalen und zellulären Beurteilung der Knochenheilung angefertigt. Alle Tiere überlebten die Operation. Sechs Tiere starben innerhalb des Beobachtungszeitraums als Folge von starkem Blutverlust (n=1), Infektion (n=1), Pinlockerung, welche die Euthanasie erforderlich machte (n=2) und durch Komplikationen bei der Anästhesie (n=2). Die µCT-Analyse nach zwölf Wochen zeigte, dass 3/8 der 1 mm-Defekte, 5/8 der 2 mm-Defekte und 8/8 der 3 mm-Defekte eine Pseudarthrose aufwiesen. Das mittlere Defektvolumen stieg signifikant (p<0,001) mit der Größe des Defektes und betrug 0,36±0,42 mm³ (1 mm-Gruppe), 1,4±0,88 mm³ (2 mm-Gruppe), bzw. 2,88±0,28 mm³ (3 mm-Gruppe). Die mittlere Defektgröße verringerte sich entsprechend um 77,6% (1 mm-Gruppe), 56,8% (2 mm-Gruppe), bzw. 28,6% (3 mm-Gruppe). Die histomorphologischen, histomorphometrischen und immunhistochemischen Analysen zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den drei experimentellen Gruppen. Das verwendete MouseExFix-System ist ein zuverlässiges und einfach zu handhabendes Verfahren zur Stabilisierung eines kritischen segmentalen Knochendefekts an der immundefizienten Maus, wenn ein 3 mm-Defekt erzeugt wird. Das im Rahmen der Studie entwickelte und validierte murine extern stabilisierte, segmentale kritische Knochendefektmodell ermöglicht die präklinische Evaluierung von Konzepten zur lokalen Knochenregeneration inklusive der Verwendung allo- und xenogener Zellen.:1 Einleitung 1 1.1 Hintergrund 1 1.2 Das Mausmodell 2 1.3 Übersicht Tierversuche mit Knochendefekten 5 1.4 Frakturheilung 6 1.4.1 Allgemeines 6 1.4.2 Räumliche Gliederung 7 1.4.3 Expression von Proteinen der extrazellulären Matrix 8 1.4.4 Das Vier-Phasen-Modell der Frakturheilung 9 1.4.5 Das anabolisch/ katabolische Modell der Frakturheilung 12 1.4.6 Beeinflussung der Frakturheilung 12 1.4.7 Das Diamantkonzept 14 1.5 Osteosynthesesysteme 14 1.6 Pseudarthrosen 15 1.6.1 Definition 15 1.6.2 Ätiologie 16 1.6.3 Klassifikation 16 1.6.4 Therapie 17 2 Material und Methoden 19 2.1 Versuchstiere 19 2.2 Operationsvorbereitung 19 2.3 Operationsablauf 20 2.4 Postoperatives Vorgehen 27 2.5 Verlaufskontrolle 28 2.6 Entnahme der Präparate 29 2.7 Anfertigung der µCT-Aufnahmen 30 2.8 Anfertigung der histologischen Schnitte 30 2.8.1 Bearbeitung der Femora 30 2.8.2 verwendete Färbungen 31 2.9 Beurteilung der Schnitte 32 2.9.1 Histologische Beurteilung 32 2.9.2 Histomorphometrische Beurteilung 33 2.10 Statistik 33 3 Ergebnisse 34 3.1 Überlebensraten und Gewichtsverlauf 34 3.2 Röntgenauswertung 35 3.3 CT-Auswertung 38 3.4 Histologische Auswertung 41 3.5 Histomorphometrische Auswertung 44 3.5.1 TRAP 44 3.5.2 Osteocalcin 46 3.5.3 Osteopontin 47 3.5.4 Osteonectin 48 4 Diskussion 50 4.1 Diskussion etablierter Modelle für kritische Knochendefekte 50 4.1.1 Diskussion der Konzeption der Modelle 50 4.1.2 Diskussion der durchgeführten Anästhesieverfahren 54 4.1.3 Diskussion der Ergebnisse 55 4.1.4 Diskussion der Defektlängen 56 4.1.5 Diskussion der verschiedenen Osteosynthesesysteme 57 4.1.6 Diskussion der Ausfaller 59 4.2 Anwendung und Nutzen immundefizienter Tiermodelle 60 4.3 Vergleich des tibialen und des femoralen murinen Frakturmodells 63 4.4 Diskussion der Beurteilung der Knochenheilung mittels bildgebender und histologischer Verfahren 63 4.5 Anwendungsmöglichkeiten 65 4.6 Schlussfolgerungen 66 5 Zusammenfassung 67 5.1 In deutscher Sprache 67 5.2 In englischer Sprache 68 6 Literaturverzeichnis 70 7 Anhang 92 7.1 Danksagung 92 7.2 Lebenslauf 93 7.3 Veröffentlichungen 95 7.4 Wertetabellen 96 7.5 Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 109 / The development of innovative therapies for bone regeneration requires the use of advanced site-specific bone defect small animal models. In this context, murine models are of major importance as they allow for sufficient sample sizes prior to preclinical testing using larger animals. Owing to the small dimensions of the murine femur only a few custom fabricated fixation devices have been described in the literature so far. The aim of this investigation was to develop and validate a new, externally fixated critical size bone defect model for immunodeficient mice. Thirty male nu/nu mice (40.7 ± 2.8 g, 95 ± 2.6 days old) were anesthetized by isoflurane inhalation and an external fixation device (MouseExFix, RISystem, AO Research Institute Davos, Switzerland) was attached to the right femur. Femoral bone defects of 1 mm (n=10), 2 mm (n=10) and 3 mm (n=10) were created. Wounds were closed without any additional treatment. X-ray films obtained immediately after surgery and every 2 weeks postoperatively during the 12 week postoperative observation period were evaluated for bony regeneration and fusion. Furthermore, histomorphology, histomorphometry, immunohistochemistry and µCT analysis were performed. All of the animals survived the operation. Twenty four out of 30 animals reached the twelfth postoperative week. µCT analyses after twelve weeks showed that 3/8 of the 1 mm defects, 5/8 of the 2 mm defects and 8/8 of the 3 mm defects remained as nonunions. The defect volume was 0.36 ± 0.42 mm³ (1 mm group), 1.40 ± 0.88 mm³ (2 mm group), and 2.88 ± 0.28 mm³ (3 mm group) (p<0.001, between all groups). The defect size decreased by 77.6% (1-mm group), 56.8% (2-mm group) and 28.6% (3-mm group) (p=0.152, between all groups). Our method using the MouseExFix device has proven to be a reliable and easy-to-handle external fixation system for the stabilization of critical-size segmental bone defects in immundeficient mice when 3 mm defects are generated. This mouse model allows for high-throughput translational evaluation of concepts for site-specific bone regeneration including strategies using allogenic and xenogenic cell types.:1 Einleitung 1 1.1 Hintergrund 1 1.2 Das Mausmodell 2 1.3 Übersicht Tierversuche mit Knochendefekten 5 1.4 Frakturheilung 6 1.4.1 Allgemeines 6 1.4.2 Räumliche Gliederung 7 1.4.3 Expression von Proteinen der extrazellulären Matrix 8 1.4.4 Das Vier-Phasen-Modell der Frakturheilung 9 1.4.5 Das anabolisch/ katabolische Modell der Frakturheilung 12 1.4.6 Beeinflussung der Frakturheilung 12 1.4.7 Das Diamantkonzept 14 1.5 Osteosynthesesysteme 14 1.6 Pseudarthrosen 15 1.6.1 Definition 15 1.6.2 Ätiologie 16 1.6.3 Klassifikation 16 1.6.4 Therapie 17 2 Material und Methoden 19 2.1 Versuchstiere 19 2.2 Operationsvorbereitung 19 2.3 Operationsablauf 20 2.4 Postoperatives Vorgehen 27 2.5 Verlaufskontrolle 28 2.6 Entnahme der Präparate 29 2.7 Anfertigung der µCT-Aufnahmen 30 2.8 Anfertigung der histologischen Schnitte 30 2.8.1 Bearbeitung der Femora 30 2.8.2 verwendete Färbungen 31 2.9 Beurteilung der Schnitte 32 2.9.1 Histologische Beurteilung 32 2.9.2 Histomorphometrische Beurteilung 33 2.10 Statistik 33 3 Ergebnisse 34 3.1 Überlebensraten und Gewichtsverlauf 34 3.2 Röntgenauswertung 35 3.3 CT-Auswertung 38 3.4 Histologische Auswertung 41 3.5 Histomorphometrische Auswertung 44 3.5.1 TRAP 44 3.5.2 Osteocalcin 46 3.5.3 Osteopontin 47 3.5.4 Osteonectin 48 4 Diskussion 50 4.1 Diskussion etablierter Modelle für kritische Knochendefekte 50 4.1.1 Diskussion der Konzeption der Modelle 50 4.1.2 Diskussion der durchgeführten Anästhesieverfahren 54 4.1.3 Diskussion der Ergebnisse 55 4.1.4 Diskussion der Defektlängen 56 4.1.5 Diskussion der verschiedenen Osteosynthesesysteme 57 4.1.6 Diskussion der Ausfaller 59 4.2 Anwendung und Nutzen immundefizienter Tiermodelle 60 4.3 Vergleich des tibialen und des femoralen murinen Frakturmodells 63 4.4 Diskussion der Beurteilung der Knochenheilung mittels bildgebender und histologischer Verfahren 63 4.5 Anwendungsmöglichkeiten 65 4.6 Schlussfolgerungen 66 5 Zusammenfassung 67 5.1 In deutscher Sprache 67 5.2 In englischer Sprache 68 6 Literaturverzeichnis 70 7 Anhang 92 7.1 Danksagung 92 7.2 Lebenslauf 93 7.3 Veröffentlichungen 95 7.4 Wertetabellen 96 7.5 Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 109

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