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Heart Failure (HF) is a devastating disease with an increasing incidence that is associated with multiple comorbidities. Cognitive impairment (CI) is one of the most common coexisting chronic conditions in HF. Despite this strong association, the underlying pathophysiological mechanisms remain unknown, especially in HF with Preserved Ejection Fraction (HFpEF). We evaluated the effects of HFpEF on microglia and astrocyte activation and neuroinflammation in the hippocampal formation, a fundamental brain region in cognitive functions. The study was conducted on ZSF1‐Lean and ZSF1‐Obese rats, a metabolic risk-related HFpEF animal model. Animals were evaluated periodically through echocardiography. The numerical density of GFAP- and CD11b-immunoreactive cells in hippocampal formation were estimated using stereological procedures. Cytokine mRNA relative expression was measured. 30 week-old ZSF1-Obese rats showed an elevated left ventricular (LV) end-diastolic pressure, a higher LV mass and a higher E/E' ratio than ZSF1-Lean rats but similar ejection fraction, confirming the cardiac HFpEF phenotype in ZSF1-Obese rats. The numerical density of GFAP- and CD11b-positive cells in all of the hippocampal formation subfields were identical between groups. Although ZSF1-Obese and ZSF1-Lean rats showed no significant differences in IL-1β, IL-6 and COX-2 gene expression, expression of TNF-α was significantly increased in ZSF1-Obese rats. Our results suggest that in ZSF1‐Obese rats, an experimental model of HFpEF, there is no induction of microglial or astrocyte activation in the hippocampal formation, although there was a glial shift towards a pro-inflammatory phenotype.

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Introdução: A insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP) não detém, atualmente, uma terapêutica farmacológica eficaz com impacto na morbilidade e mortalidade. O exercício físico (EF) é reconhecido como uma ferramenta não farmacológica importante, capaz de melhorar a capacidade para o exercício e a qualidade de vida. Existe ainda evidência observacional a suportar que os pacientes com maiores níveis de atividade física têm um risco de hospitalização e mortalidade cardiovascular menor. No entanto, os mecanismos subjacentes aos efeitos benéficos do EF na população com ICFEP são, ainda, escassamente compreendidos. Objetivo: Este trabalho pretende explorar a hipótese de que o benefício do EF nos doentes com ICFEP pode ser, pelo menos em parte, devido aos seus efeitos moduladores sobre o paradigma inflamatório descrito para esta síndrome. Métodos: Em primeiro lugar foi realizada uma revisão da literatura, utilizando a base de dados PubMed, de forma a reunir a evidência existente relativamente ao efeito do exercício em cada etapa da via fisiopatológica que conduz à ICFEP. Devido à escassez de estudos na população alvo, a pesquisa literária incluiu evidência pré-clínica e estudos realizados em doentes com insuficiência cardíaca independentemente da fração de ejeção, assim como pacientes com comorbilidades comuns na ICFEP. Na segunda parte desta tese, apresentamos um estudo experimental em que recorremos a ratos obesos ZSF1 como modelo animal de ICFEP para investigar se o EF é capaz de reduzir a inflamação microvascular, a rarefação endotelial, a hipertrofia e a fibrose no miocárdio, características que estão implicadas na fisiopatologia da ICFEP. Com este propósito, foi quantificada a expressão de mieloperoxídase (MPO), molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e molécula de adesão celular endotelial plaquetária (PECAM-1) através da técnica de western blot. Foi ainda realizada uma análise histológica para determinar o efeito do exercício na área dos cardiomiócitos e no conteúdo de colagénio no miocárdio. Resultados: Até ao momento em que realizamos a nossa revisão, existia um número muito limitado de estudos clínicos a avaliar alterações moleculares promovidas pelo EF em doentes com ICFEP. Assim sendo, não existe evidência a confirmar ou refutar o impacto do EF na modulação do paradigma inflamatório e estudos futuros devem explorar esta lacuna. No entanto, o EF provou ser capaz de modular vários dos parâmetros dentro da inflamação sistémica, disfunção endotelial e rigidez miocárdica em estudos pré-clinicos e em pacientes com comorbilidades comuns na ICFEP. Relativamente ao estudo experimental, este revelou uma redução do colagénio presente no miocárdio (p<0.05) nos ratos exercitados, comparando com os controlos. Não foram detetadas alterações estatisticamente significativas na área dos cardiomiócitos nem na expressão de MPO, ICAM-1 e PECAM-1. Conclusão: Existe evidência capaz de suportar a hipótese de que o exercício físico modela aspetos cruciais da via inflamatória descrita para a ICFEP e investigação futura que aprofunde os mecanismos celulares e moleculares subjacentes é encorajada. / Background: Heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) is currently lacking an effective pharmacological treatment with impact on morbidity and mortality. Exercise training (EXT) is recognized as an important nonpharmacological tool, capable of improving exercise capacity and quality of life. There is also observational data supporting that those patients with greater levels of physical activity have a lower risk of hospitalization and cardiovascular mortality. However, the mechanisms underlying the beneficial effects of EXT in HFpEF are poorly comprehended. Purpose: This work intends to explore the hypothesis that the benefits of exercise training in HFpEF patients could be, at least in part, due to its modulating effects over the inflammatory paradigm described for this syndrome. Methods: We first conducted a literature search using PubMed-NCBI database to review the effects of EXT throughout each step of the pathophysiological pathway leading to HFpEF. Due to the scarcity of studies in the HFpEF population, the literature search included preclinical findings and clinical evidence from patients with HF irrespective of subtype as well as patients with some of the most common comorbidities in HFpEF. Then, in the second part of this thesis, we present an experimental study using ZSF1 obese rats as an animal model for HFpEF, designed to investigate whether exercise training reduces myocardial microvascular inflammation, rarefaction, hypertrophy and fibrosis, all of which are implicated in the pathophysiology of HFpEF. For that purpose, we resorted to left ventricle samples of sedentary and exercised rats and performed western blot analysis to quantify the expression levels of myeloperoxidase (MPO), intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and platelet/endothelial cell adhesion molecule 1 (PECAM-1). We also conducted a histological analysis to determine the effect of exercise on cardiomyocytes' cross-sectional area as well as myocardial collagen content. Results: Until the moment we performed our review, there were a very limited number of clinical studies assessing the molecular changes promoted by exercise training in HFpEF patients . Thus, there is currently no data to confirm or refute the impact of EXT in the modulation of the inflammatory paradigm and future studies should specifically explore this gap. However, EXT proved to be capable in modulating systemic inflammation, endothelial dysfunction and myocardial stiffness in preclinical studies as well as in patients with comorbidities also commonly found in HFpEF. Regarding our experimental work, it revealed a reduction in myocardial collagen (p <0.05) in the exercised rats compared with the controls. No significant changes were noted for cardiomyocytes' cross-sectional area as well as for MPO, ICAM-1 and PECAM-1 expression. Conclusion: There is rationale to support the hypothesis that EXT modulates crucial aspects of the inflammatory pathway described for HFpEF and future investigation on cellular and molecular mechanisms are encouraged.

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O sistema colinérgico cerebral pode sofrer alterações funcionais e estruturais tanto em doentes epiléticos como nos modelos da doença. Contudo, a relação causal entre essas alterações e epilepsia ainda não se encontra estabelecida. Neste estudo, tentamos examinar o modo como a inibição da plasticidade colinérgica relacionada com epilepsia se pode refletir na suscetibilidade a crises epiléticas e/ou desenvolvimento de epilepsia crónica, assim como as suas consequências neurológicas. Assim sendo, foram administradas injeções intra-hipocampais com baixas doses de 192-IgG-saporina (SAP) em ratos Wistar adultos de modo a produzir uma moderada, mas significativa perda de neurónios colinérgicos na região septohippocampal, e suprimir a sua plasticidade. Os animais foram depois tratados com ácido caínico de modo a induzir status epilepticus, levando a posterior desenvolvimento de epilepsia crónica. Foi descoberto que o tratamento prévio com SAP se associa a um maior período de latência até ao início do estado de mal e a uma menor taxa de mortalidade, sugerindo que a elevada atividade das células colinérgicas septais pode potenciar crises epiléticas. Meses mais tarde, verificou-se que, em comparação com os ratos previamente tratados com SAP, uma maior percentagem de ratos com conexões colinérgicas septohipocampais intactas desenvolveram crises espontâneas. O tratamento com ácido caínico induziu perda de 40-50% dos neurónios hipocampais e este efeito não foi melhorado com depleção colinérgica prévia. Para além disso, os défices cognitivos induzidos por ácido caínico foram detetados tanto no grupo tratado com SAP como no grupo controlo. Estes dados sugerem que a plasticidade colinérgica induzida por crises epiléticas pode, de facto, aumentar a suscetibilidade a crises e contribuir para processos epileptogénicos. Os dados obtidos não suportam a hipótese de que a hipertrofia neuronal colinérgica relacionada com epilepsia pode potenciar perda celular hipocampal e as suas respetivas limitações comportamentais. Numa subsequente parte do projeto, decidimos estudar o efeito do modelo de epilepsia com ácido caínico na população GABAérgica do septo medial e banda diagonal de Broca (MS/DB). Usamos técnicas de imunohistoquímica para identificar neurónios marcados com parvalbumina, sendo esta co-expressa nos neurónios GABAérgicos do septo medial. Foi detetada uma diminuição de 35% nesta população neuronal, o que pode justificar alguns dos achados clínicos encontrados em animais epiléticos, como défices de formação de memória e aprendizagem. Estabelecemos também uma interação funcional entre os sistemas GABAérgicos e colinérgicos ao demonstrar a existência de co-localização entre varicosidades colinérgicas e neurites e pericários imunorreativos para parvalbumina, tanto em animais tratados com ácido caínico, como animais controlo. A densidade das varicosidades das fibras colinérgicas no septo medial encontra-se aumentada 45% nos animais epiléticos, sugerindo um aumento do aporte colinérgico para as células GABAérgicas septohipocampais. Isto pode ser explicado por um mecanismo compensatório devido à perda de neurónios GABAérgicos, ou pode ser um fator que contribui para a disrupção da via septohipocampal e, subsequentemente, para a epileptogénese. / The brain cholinergic system may undergo structural and functional alterations both in human epilepsy and in respective animal models, but the causal relationships between these alterations and epilepsy remain to be established. In this study, we attempted to examine how the inhibition of epilepsy-related cholinergic plasticity may be reflected in seizure susceptibility and/or in the development of chronic epilepsy and its neurological consequences. For this purpose, adult Wistar rats received intrahippocampal injections of low doses of 192 IgG-saporin (SAP) to produce a moderate, but significant loss of septohippocampal cholinergic cells and to suppress their plasticity. Then, animals were treated with kainic acid to induce status epilepticus, which leads to the development of chronic epilepsy later in life. It was found that SAP-pretreatment was associated with longer latency to the onset of status epilepticus and with reduced mortality rate, suggesting that increased activity of septal cholinergic cells may potentiate seizures. Interestingly, months later, a greater percentage of rats with intact septohippocampal cholinergic connections showed spontaneous seizures, when compared to SAP-pretreated rats. Treatment with kainic acid produced death of 40-50% of hippocampal neurons and this effect was not ameliorated by prior cholinergic depletion. Moreover, the kainate induced cognitive deficits were detected in both SAP-pretreated and sham-pretreated groups. These data suggest that seizure-induced plasticity of cholinergic cells may indeed enhance seizure susceptibility and contribute to epileptogenic processes. They do not support the hypothesis that epilepsy-related hypertrophy of cholinergic neurons may potentiate hippocampal cell loss and respective behavioral impairments. In a subsequent part of our project, we studied the effects of epilepsy on GABAergic neurons of the medial septum. Immunohistochemistry techniques were used to identify cells stained for parvalbumin known to be co-expressed by septal GABAergic neurons. We found a 35% reduction in this neuronal population, which can justify some of the clinical findings in epileptic individuals, like learning and memory impairments. Also, we established a functional interaction between the GABAergic and cholinergic systems by showing that cholinergic fiber varicosities are co-localized with perikarya and neurites immunoreactive for parvalbumin in both KA-treated and control animals. Notably, the density of cholinergic fiber varicosities in the medial septum was increased by 45% in epileptic animals, suggesting enhanced cholinergic drive upon septohippocampal GABAergic cells, which can be explained as a compensatory mechanism for the decrease of GABAergic neurons, or as a contributing factor for septohipocampal pathway disruption and, ultimately, epileptogenesis.

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