El càncer és una malaltia dinàmica durant la qual les cèl·lules proliferen, es diferencien i migren accedint a programes genètics i epigenètics reminiscents de l’embriogènesis. Aquest procés està dirigit per la comunicació bidireccional entre les cèl·lules cancerígenes i el microambient tumoral que està format per una matriu extracel·lular (ECM) tridimensional (3D) i cèl·lules de l’estroma, incloent fibroblasts, cèl·lules del sistema immune i del sistema vascular. Moltes biomolècules i enzims (ex. citoquines, factors de creixement i proteases) són contínuament secretades per les cèl·lules cancerígenes i de l’estroma, influenciant-se entre elles i modificant l’estructura i composició de l’ECM. Aquests canvis ambientals provoquen plasticitat i heterogeneïtat cel·lular. En el camp d’enginyeria de teixits, els investigadors intenten deconstruir el microambient tumoral en models cel·lulars 3D més simples i predictius que permetin analitzar el paper de senyals químics, mecànics i/o físics en la progressió de la malaltia. L’etapa més crítica de la progressió tumoral és la invasió i metàstasis, la qual provoca aproximadament el 90% de morts de càncer. Durant la present tesis, es van desenvolupar models 3D per recapitular la transició des d’un microambient 2D a un 3D que experimenten les cèl•lules cancerígenes quan s’escapen de la monocapa epitelial i envaeixen el teixit connectiu mesenquimal. Els experiments van demostrar que els cultius 3D van ser capaços de trencar l’organització epitelial, induint diferents fenotips tipus-mesenquimal dependent de la composició i rigidesa de la matriu. Per tant, les cèl·lules mostraven capacitat per adaptar-se a entorns canviants. A més, els cultius 3D provocaven la disminució de l’expressió de l’E-cadherina, suggerint la dissociació de les adhesions epitelials cèl·lula-cèl·lula i la conseqüent activació dels primers estadis de la transició epitelial-mesenquimal. Aquest patró d’expressió estava molt influenciat per la presencia i concentració dels motius d’unió de la ECM. Els mecanismes de regulació d’E-cadherina es van caracteritzar a nivell epigenètic i transcripcional. Els cultius 3D també poden contribuir al descobriment i avaluació terapèutica de nous tractaments anti-cancerígens. Part d’aquesta tesis es va focalitzar en investigar la teràpia fotodinàmica. En concret, els cultius 3D van emergir com valuoses plataformes per processos de cribratge de fotosensibilitzadors ja que van aconseguir recrear els gradients moleculars del fàrmac i l’oxigen. Aquestes condicions van crear un microambient protector per les cèl·lules localitzades en la part interior central del cultiu, causant una baixa eficàcia terapèutica i, per tant, mimetitzant les limitacions actuals de la pràctica clínica. En una altra part de la tesis, es va estudiar l’activitat de fàrmacs anti-cancerígens dirigits a inhibir determinats receptors de tirosina quinases. Els resultats van evidenciar que les cèl·lules desenvolupaven diferents estratègies de supervivència per escapar-se o evadir de l’efecte dels fàrmacs depenent de la composició de la matriu. Es va formular la hipòtesis que la ECM podia proporcionar a les cèl·lules accés a una gran i redundant xarxa de cascades de senyalització que complementaven l’activitat dels receptors bloquejats. Per tant, les cèl·lules cancerígenes presentaven un comportament adaptatiu sostingut gràcies al dinàmic i complex microambient tumoral. Aquesta sèrie de descobriments reforçava la necessitat de desenvolupar cultius 3D per estudiar els mecanismes de resistència dels fàrmacs. / El cáncer es una enfermedad dinámica en la cual las células proliferan, se diferencian y migran accediendo a programas genéticos y epigenéticos reminiscentes de la embriogénesis. Este proceso está dirigido por la comunicación bidireccional entre las células cancerígenas y el microambiente tumoral que está formado por una matriz extracelular (ECM) tridimensional (3D) y células del estroma, incluyendo fibroblastos, células del sistema inmune y células del sistema vascular. Muchas biomoléculas y enzimas (ej. citoquinas, factores de crecimiento y proteasas) son continuamente secretadas por las células cancerígenas y del estroma, influenciándose entre ellas y modificando la estructura y composición de la ECM. Esta serie de cambios ambientales provocan plasticidad y heterogeneidad celular durante el cáncer. En el campo de la ingeniería de tejidos, los investigadores intentan deconstruir el complejo microambiente tumoral en modelos celulares 3D más simples y predictivos con el objetivo de analizar el papel específico de señales químicas, mecánicas y/o físicas en la progresión de la enfermedad. La etapa más crítica de la progresión tumoral es la invasión y metástasis, la cual provoca aproximadamente el 90% de muertes. Durante la presente tesis, se desarrollaron modelos 3D para recapitular la transición desde un microambiente 2D a uno 3D que experimentan las células cancerígenas cuando se escapan de la monocapa epitelial e invaden el tejido conectivo mesenquimal. Los experimentos demostraron que los cultivos 3D eran capaces de romper la organización epitelial, induciendo diferentes fenotipos tipo-mesenquimales dependiendo de la composición y rigidez de la matriz. Por lo tanto, las células mostraban capacidad para adaptarse a entornos cambiantes. Los cultivos 3D provocaban la disminución de la expresión de la E-cadherina, sugiriendo la disociación de las adhesiones epiteliales célula-célula y la activación de los primeros estadios de la transición epitelial-mesenquimal. Este patrón de expresión estaba influenciado por la presencia y concentración de motivos de unión de la ECM. Los mecanismos de regulación de E-cadherina se caracterizaron a nivel epigenético y transcripcional. Los cultivos 3D también pueden contribuir al descubrimiento y evaluación terapéutica de nuevos tratamientos. Parte de esta tesis se focalizó en investigar la terapia fotodinámica. Los cultivos 3D emergieron como valiosas plataformas en procesos de cribado de fotosensibilizadores ya que pudieron recrear los gradientes moleculares de fármaco y el oxígeno. Estas condiciones crearon un microambiente protector para las células localizadas en la parte interior central del cultivo, causando una baja eficacia terapéutica y, por lo tanto, mimetizando las limitaciones actuales de la práctica clínica. En otra parte de la tesis, se estudió la actividad de fármacos anticancerígenos dirigidos a inhibir determinados receptores de tirosina quinasas. Los resultados evidenciaron que las células desarrollaron distintas estrategias de supervivencia para escaparse o evadir el efecto de los fármacos dependiendo de la composición de la matriz. Se formuló la hipótesis que la ECM podía proporcionar a las células acceso a una gran y redundante red de cascadas de señalización que complementan la actividad de los receptores bloqueados. Por lo tanto, las células cancerígenas presentaron un comportamiento adaptativo sostenido gracias al dinámico y complejo microambiente tumoral. Estos descubrimientos reforzaban la necesidad de desarrollar cultivos 3D para estudiar los mecanismos de resistencia a los fármacos. / Cancer is a dynamic disease in which cells proliferate, differentiate and migrate by accessing to reminiscent genetic and epigenetic programs of embryogenesis. This process is driven by the crosstalk between cancer cells and tumor microenvironment, which comprises a three-dimensional (3D) extracellular matrix (ECM) and stroma cells including fibroblasts, vasculature and immune system cells. Effector biomolecules and enzymes (e.g. cytokines, growth factors and proteases) are continuously secreted by cancer and stroma cells, influencing each other and modifying the structure and composition of ECM. These environmental changes lead to cell plasticity and heterogeneity during cancer. In tissue engineering field, researchers try to deconstruct this complex tumor microenvironment into simpler and predictable 3D cell models in order to analyze the role of specific chemical, mechanical and/or physical signals in disease progression. The most critical tumor stage is local invasion and metastasis, which accounts for approximately 90% of all cancer deaths. In the present thesis, 3D cell models were developed to recapitulate the transition from a 2D to a 3D milieu that cancer cells experience when they escape from epithelial layer and invade mesenchymal connective tissue. Experiments revealed that 3D cultures compromised epithelial organization, inducing different mesenchymal-like phenotypes depending on composition and stiffness of scaffold. Therefore, cells showed the capacity to adapt to changing microenvironmental conditions. Moreover, 3D cultures induced E-cadherin downregulation, suggesting the disruption of epithelial cell-cell adhesions and the activation of early stages of epithelial to mesenchymal transition. Its expression pattern was influenced by the presence and concentration of ECM binding motifs. E-cadherin regulatory mechanisms were characterized at epigenetic and transcriptional level. 3D cultures can also help in the discovery and therapeutic assessment of cancer medicines. Part of this thesis work was focused in photodynamic therapy research. In particular, 3D cultures emerged as powerful platforms for photosensitizers screening processes since they could recreate molecular gradients for drug and oxygen. These conditions induced the development of a protective microenvironment for cells located in the core of the culture, accounting for the low therapeutic efficacy found in clinical practice. In a different part of the thesis, cancer drugs targeted to inhibit receptor tyrosine kinases activity were studied. Significantly, results evidenced that cells developed different survival strategies to evade or escape from drugs action depending on the composition of scaffold. We hypothesized that ECM could provide cells with access to a large and redundant spectrum of signaling pathways, complementing the activity of the blocked cellular receptors. Therefore, cancer cells presented an adaptive behavior supported by the dynamic and complex tumor microenvironment. These findings reinforced the necessity to develop 3D cultures to study cell resistance mechanism.

El conjunt de treballs duts a terme en aquesta tesi tenen per objectiu aprofundir en els mecanismes bioquímics de la comunicació feromonal dels insectes, agafant com a model els lepidòpters nocturns i estudiant-ne tant els aspectes que concerneixen la biosíntesi de llurs feromones com els relacionats amb la seva detecció. Tot i que ambdós processos (biosíntesi i detecció) estan estretament relacionats, s'ha considerat convenient dividir la tesi en dos capítols diferenciats. Així, després d'una introducció general i un capítol de metodologia comú, es presenta un primer capítol destinat a l'estudi d'enzims biosintètics i un segon destinat a l'estudi dels enzims responsables del metabolisme de la feromona un cop aquesta ha activat el receptor olfactiu. Els treballs duts a terme en el primer capítol formen part de la participació del grup en el projecte “Biosynthetic Infochemical Communication” (iCHEM, contracte EC: FP6-032275). L'objectiu del projecte era el disseny i implementació d'un dispositiu artificial capaç de mimetitzar la comunicació química dels insectes, agafant com a organisme model l'arna S. littoralis. La participació del nostre grup en el projecte es va centrar en el disseny i la implementació del dispositiu emissor, que pretenia reproduir una part de la ruta biosintètica de la feromona mitjançant la immobilització dels enzims biosintètics en un microreactor. Més enllà d'aquest propòsit, però, es va considerar interessant identificar els ortòlegs de l'insecte utilitzat com a model, la “S. littoralis”, i estudiar la seva influència en la proporció final dels compostos feromonals. Dels enzims de la ruta biosintètica que han estat postulats com a principals responsables de la proporció dels compostos feromonals, la reductasa d'àcids grassos i l'alcohol acetil transferasa no havien estat encara identificats en “S. littoralis” i se'n disposava d'escassa informació en altres insectes. Per aquest motiu es va considerar interessant centrar l'atenció en aquests dos enzims, que d'altra banda eren també els més rellevants per a l'assoliment dels objectius del projecte iCHEM. En el segon capítol es descriuen els treballs duts a terme amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les esterases antenals de lepidòpters nocturns, potencialment implicades en la finalització de l'estímul provocat per la feromona. Per a la realització d'aquests estudis es van escollir dues arnes de la família “Noctuidae”. La primera d'elles, “S. nonagrioides”, constitueix una important plaga dels conreus del blat de moro. La utilització d'inhibidors d'esterases havia resultat prometedora en assajos “in vitro” utilitzant homogeneïtzats de l'antena, així com en assajos d'electrofisiologia duts a terme pel grup (Quero et al. 2003; Quero et al. 2004), però l'absència d'una major informació sobre els enzims diana limitava la millora i optimització d'aquestes molècules amb activitat inhibidora. Pel que fa a la segona espècie escollida (“S. littoralis"), a més de constituir una important plaga arreu del món, oferia l'avantatge de poder ésser criada fàcilment en captivitat, així com el fet de disposar d'abundant informació sobre la seva biologia. Les tasques d'identificació i caracterització d'esterases en les dues espècies es va dur a terme en paral•lel, però degut a les diferències en la quantitat d'informació disponible sobre les dues arnes, es va considerar interessant utilitzar estratègies diferents per a cada insecte. / The set of works presented in this thesis aim to deepen the biochemistry of pheromone communication in insects, taking the moth as a model and investigating the biochemistry aspects of both pheromone biosynthesis and pheromone degradation. Although biosynthesis and degradation are closely related in pheromone biology, the thesis has been divided in two different chapters, the first one concerning the enzymes involved in pheromone biosynthesis and the second one concerning the antennal esterases, involved in pheromone degradation of many moth species. The tasks carried out in the first chapter were part of the European project “Biosynthetic Infochemical Communication” (iCHEM, contract EC: FP6-032275). The main role of our group in the iCHEM project was the implementation of an artificial pheromone emitter, that attempted to reproduce part of the biosynthetic route of the pheromone through the immobilization of biosynthetic enzymes in a microreactor. However, beyond this aim, it was considered to be interesting the identification of the orthologues enzymes of “S. littoralis”, and to study the influence of these enzymes in the final proportion of the pheromonal compounds. To this end, the most interesting enzymes of the biosynthetic pathway were selected for DNA isolation, recombinant expression of the protein and biochemical characterisation of the obtained enzyme. The second chapter describes the work carried out in order to deepen the knowledge of antennal esterases of moth, potentially involved in the termination of the stimulus caused by the pheromone. To this end, two moths of Noctuidae family were chosen. The first one, “Sesamia nonagrioides”, is an important pest of corn crops. The use of inhibitors of esterases had promising results “in vitro” assays previously performed using antenna homogenized, however the absence of further information on the target enzymes limited the improvement and optimization of these molecules with inhibitory activity. The second chosen species, “S. littoralis”, besides being a major pest worldwide, offered the advantage of being easily raised in captivity and the availability of abundant information about its biology. The tasks of identification and characterization of esterases in the two species was carried out in parallel, but due to the differences in the information available about two moths, it was considered interesting to use different strategies for each insect.

La isquèmia cerebral es caracteritza per una interrupció del flux sanguini, la qual cosa comporta una mort neuronal de la zona afectada. Els mecanismes cel.lulars i moleculars de la mort neuronal induïda per isquèmia es desconeixen però s'ha proposat que la depleció d'energia i la pèrdua dels gradient iònics provocarien un alliberament de glutamat, que és el neurotransmissor excitatori majoritari en sistema nerviós central de mamífers, per la reversió de la funció dels seus recaptadors de membrana. L'acumulació de glutamat comporta una sobreexcitació dels seus receptors sinàptics i desencadena una mort neuronal fulminant. Tradicionalment, aquesta mort cel.lular s'ha descrit com una mort per necrosi, però en els darrers anys, s'ha descrit l'existència d'un altre component de mort, més retardat, anomenat apoptosi. En el present treball s'ha establert un model d'isquèmia in vitro per deprivació d'oxigen i glucosa (OGD), en cultius primaris de neurones corticals de rata. El model ha permès estudiar els mecanismes que s'activen en una isquèmia cerebral i que porten a una mort neural la qual ve mediada, principalment, pel glutamat via receptor NMDA. S'ha pogut caracteritzar i quantificar la necrosi i l'apoptosi induïda per l'exposició a l'OGD. A més, l'aparició de l'apoptosi correlaciona amb l'activació de la caspasa 3, un dels marcadors més rellevants de la mort cel.lular programada, i també de les caspases 7 i 9. L'exposició a l'OGD també indueix l'alliberament de TNFa, la síntesi de ceramida de novo i la translocació a nucli del factor de transcripció NFkB, els quals medien part de l'activació de la caspasa 3 i per tant part de l'apoptosi isquèmica. D'altra banda, el model ofereix la possibilitat de controlar la finestra temporal d'intervenció farmacològica, i permet determinar l'efectivitat de les substàncies abans, durant i després de l'OGD. En estudiar el sistema histaminèrgic en l'exposició a l'OGD es va concloure que els antagonistes dels receptors H2 de la histamina, i principalment la ranitidina, disminuïen la mort cel.lular induïda per OGD majoritàriament reduint l'activació de la caspasa 3. El seu efecte neuroprotector podia observar-se fins i tot administrant l'antagonista H2 tres i sis hores després de l'exposició a l'OGD i sense pretractament .Tots aquests resultats van servir per validar el model d'isquèmia in vitro per a l'estudi dels mecanismes cel.lulars i moleculars implicats en la isquèmia cerebral. / Cerebral ischemia is characterized by an interruption of cerebral blood flow that triggers neuronal cell death. Cellular and molecular mechanisms of ischemic neuronal cell death are unknown but it has been proposed that ischemia-induced energy depletion and impairment of ionic gradients provoked a massive release of glutamate from synaptic terminals. Glutamate is the major excitatory neurotransmitter in mammalian CNS and during cerebral ischemia is released by reversed function of its neuronal and glial uptake system. Glutamate accumulation in the extracellular space produces a sobreexcitation of its synaptic receptors that triggers a fulminant neuronal death by necrosis. Traditionally ischemia-induced cell death has been described as necrotic but in the last decade, evidence of programmed cell death or apoptosis has emmerged. In the present thesis, a in vitro model model of cerebral ischemia has been stablished exposing mixed cortical neuronal-glial cell cultures to glucose and oxygen deprivation. The model allowed to study the activation of different mechanisms during in vitro cerebral ischemia that elicited NMDA-mediated cell death. Necrosis and apoptosis were characterized and quantifyed after OGD exposure. Apoptosis appearence correlated well with caspase 3 activation, one of the most rellevant apoptotic markers. Caspase 7 and caspase 9 were also activated after exposure to OGD. A in vitro cerebral ischemia triggered TNFa release, de novo ceramide production and NFkB nuclear translocation. All these factors seemed to mediate ischemia-induced caspasa 3 activation and neuronal apoptosis.On the other hand the model offered the possibility to control the therapeutic window of pharmacological intervention and allowed to study the effectiveness of different drugs before, during and after OGD exposure. After examining the relationship beetwen histaminergic system and ischemia-induced cell death, we concluded that Histamine receptor 2 antagonists and mainly Ranitidine, reduced neuronal cell death after an OGD exposure. They reduced apoptosis appearence by reducing ischemia-induced caspase 3 activation. Their neuroprotective effect was seen even if the cultures were treated three or six hours following OGD exposure . All these results validated the in vitro model of OGD to study cellular and molecular mechanisms implicated in cerebral ischemia.

La isquemia cerebral es la tercera causa de muerte en los países industrializados y constituye la principal causa de discapacidad en el adulto. A pesar de la enorme importancia socio-económica de esta enfermedad, hasta ahora el único tratamiento aprobado para paliarla es la administración del activador tisular del plasminógeno (tPA), el cual sólo se puede aplicar a un 5% de los pacientes. Por eso, es de vital importancia seguir realizando estudios destinados a profundizar en el conocimiento del los mecanismos moleculares implicados en esta patología. En los últimos años han aparecido evidencias que apoyan la idea de que en la isquemia cerebral, además de ocurrir una muerte celular necrótica, también se está produciendo una muerte más lenta de tipo apoptótico. Al tratarse la apoptosis de un proceso regulado y que requiere más tiempo para su ejecución, la ventana terapéutica que ofrece es mucho mayor. Tomando como base estas observaciones, el presente trabajo se ha centrado en el estudio de los mecanismos moleculares que subyacen a la isquemia cerebral. Para ello, se utilizó principalmente el modelo de privación de oxígeno y glucosa (OGD) en cultivos celulares mixtos de corteza cerebral de rata. La primera parte de este trabajo se ha centrado en estudiar el papel del factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) en la OGD. Se observó que la OGD provoca una liberación de TNFα que, a través del receptor TNFR1, activa la caspasa-8, la cual es responsable de activar posteriormente la caspasa-3, una proteasa clave en la ejecución de la apoptosis. Además, se observó que inhibiendo el efecto del TNFα liberado o de la caspasa-8, se reduce la muerte inducida por la OGD. Estos datos sugieren que la caspasa-8 tiene un papel clave como caspasa iniciadora de la cascada apoptótica en respuesta a la liberación de TNFα mediada por la OGD.Por otro lado, se ha estudiado el papel del estrés del retículo endoplasmático (RE) en la OGD y en la hipoxia-isquemia neonatal. En ambos modelos se observó una activación de las vías de IRE1 y PERK, además de la proteólisis de la caspasa-12. Los resultados obtenidos indican también que la activación de esta caspasa en la OGD viene mediada por la calpaína y se debe a la entrada masiva de calcio mediada por los receptores de NMDA, sugiriendo que esta activación puede ser independiente del estrés del RE.Finalmente, se ha realizado un análisis masivo de los cambios de la expresión génica inducidos por la OGD, mediante la técnica de microarray. Entre los genes cuyo incremento se detectaba en el microarray, se confirmó el incremento de expresión de varios factores de transcripción que pueden tener un papel clave en la isquemia cerebral, como atf3, egr1, cebpδ, nr4a1 y nr4a3. Además, este estudio ha permitido caracterizar los principales clusters de genes inducidos en la OGD, observándose que muchos de los genes cuyo incremento se había observado en modelos murinos de isquemia cerebral, también se encontraban incrementados en la OGD. Estos resultados ponen de relieve que el modelo de OGD en cultivos mixtos de células corticales es una buena aproximación para el estudio de la isquemia cerebral. Por lo tanto, los resultados obtenidos en los apartados anteriores, los cuales aportan nuevos datos sobre mecanismos moleculares en la OGD, pueden servir de base para su extrapolación a los mecanismos moleculares implicados en la isquemia y por tanto, para diseñar nuevas y mejores herramientas terapéuticas, con el fin de paliar esta enfermedad. / Brain ischemia is the third cause of death in industrialized countries and the main reason of adulthood incapacity. Although the great social-economic importance of this disease, the only approved treatment, until now, is the tissue plasminogen activator (tPA). That's why is really important to continue with studies focused in extending the knowledge of the molecular mechanisms involved in this pathology. In the last years mounting evidences supporting the idea that in brain ischemia both necrotic and apoptotic cell death are taking place, had appeared. Since apoptosis is a well regulated process and it takes more time, it offers longer therapeutic window. Taken in account these observations, the present work has been focused in the study of molecular mechanisms underlying brain ischemia. For this purpose, the oxygen and glucose deprivation (OGD) model in mixed cortical cells culture was used.The first part of this work was focused in studying the role of tumor necrosis factor alpha (TNFα) in OGD. It was shown that OGD evokes TNFα release, and this cytokine activates caspasa-8 through TNFR1 receptor. This initiator caspase is responsible of subsequent activation of caspase-3, a key protease in apoptosis execution. Moreover, it was shown that inhibition of TNFα or caspase-8 effect reduces the OGD-induced cell death. These data suggest that caspase-8 has a key role as initiator of apoptotic cascade in response to released TNFα in OGD. On the other hand, the role of endoplasmatic reticulum (ER) stress was studied in OGD and neonatal hypoxia-ischemia. In both models was shown the activation of IRE1 and PERK pathways, as well as the caspase-12 proteolysis. The obtained results also indicate that the activation of this caspase is mediated by calpain and it is due to the massive entrance of calcium regulated by NMDA receptors, suggesting that this activation is independent of ER stress.Finally, a massive analysis of genetic expression changes induced by OGD was performed using microarray technology. Among the increased genes detected by microarray, it was confirmed the increase of expression of several transcription factor whose could have a key role in brain ischemia, as atf3, egr1, cebpδ, nr4a1 y nr4a3. Moreover, this study has allowed the characterization of main gene clusters induced by OGD, showing that many of increased genes in murine models of brain ischemia were also increased in OGD. These results demonstrate that the OGD model in mixed cortical cells cultures is an adequate approximation for the study of brain ischemia. So, the obtained results in this work could serve as the basis for extrapolation to the molecular mechanisms involved in brain ischemia, and hence, for designing new and better therapeutic tools.

El sistema dopaminèrgic has estat molt estudiat en els darrers anys, principalment degut a la seva implicació en diverses patologies com la malaltia de Parkinson, la esquizofrènia o la síndrome de Tourette, així com també en l’abús de drogues. S’han descrit cinc subtipus de receptors per la dopamina (DA), tots els quals pertanyen a la família de receptors acoblats a proteïnes G (GPCRs). D’aquests cinc subtipus, els receptors D2 son la diana principal dels antipsicòtics (antagonistes) i també dels fàrmacs utilitzats en el trastament del Parkinson (agonistes). Malauradament, els efectes antagonistes sobre els receptors D2 comporten importants efectes secundaris indesitjables. Els antipsicòtics de nova generació (com l’aripiprazole) presenten menys efectes secundaris, la qual cosa s’ha atribuït a diferent selectivitat funcional sobre els receptors D2, malgrat que es necessiten més estudis per confirmar aquesta hipòtesi. En el nostre treball, hem observat diferent activitat de l’aripiprazol sobre els auto-receptors D2 en resposta a canvis en les concentracions extracel·lulars de DA, la qual cosa és coherent amb la hipòtesi de que els receptors D2 presenten “selectivitat funcional”. Per altra banda, actualment està cada cop més acceptat el concepte de heteromerització entre diferents GPCRs que co-localitzen en les mateixes mostres tissulars, i representa un nou camp per al disseny de millors teràpies. Així doncs, els estudis dirigits a la identificació de nous heteròmers que impliquin els receptors D2, permet ampliar la farmacologia del sistema dopaminèrgic. En aquesta tesis hemos observat crosstalk funcional entre dos parells de GPCRs: entre D2 i GABAB por un costat, i entre D2 i el receptor-1 de Orexina per un altre. Malgrat que els nostres resultats indiquen que és molt probable que ambdós parells de receptors formin heteròmers, es necessiten mñes dades per a corroborar-ho. La DA és clau pel sistema cerebral de la recompensa, que juga un paper primordial en el fenòmen de l’addicció. Està descrit que la administració crònica de cocaïna altera la densitat i l’afinitat dels receptors D1 i D2, així com també la seva interacció amb altres receptors. En el nostre model de auto-administració de cocaïna en rates, hem trobat canvis en la resposta del sistema dopaminèrgic a l’agonista D2 quinpirole, després de abstinència de curt i també de llarg termini. En summa, els nostres resultats sobre l’administració de cocaïna destaquen la importància del sistema dopaminèrgic en l’addicció a la cocaïna, i a més, el crosstalk funcional que hem observat entre els receptors D2 i altres GPCRs obre noves possibilitats per al disseny i desenvolupament de nous tractaments per a l’abús de drogues així com també per l’esquizofrènia. / El sistema dopaminérgico ha sido ampliamente estudiado en las últimas décadas, principalmente por su implicación en diversas patologías como la enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia o el síndrome de Tourette, así como en el abuso de drogas. Se han descrito cinco subtipos de receptores para la dopamina (DA), todos ellos pertenecientes a la familia de receptores acoplados a proteínas G (GPCRs). De estos cinco subtipos, los receptores D2 son la diana principal de los antipsicóticos (antagonistas) y también de los fármacos utilizados en el tratamiento del Parkinson (agonistas). Desafortunadamente, los efectos antagonistas sobre los receptores D2 conllevan importantes efectos secundarios indeseables. Los antipsicóticos de nueva generación (como el aripiprazole) presentan menos efectos secundarios, hecho que se ha atribuido a diferente selectividad funcional sobre los receptores D2, aunque se requieren más estudios para confirmar esta hipótesis. En nuestro trabajo, hemos observado distinta actividad del aripiprazol sobre los autoreceptores D2 en respuesta a cambios en las concentraciones extracelulares de DA, lo cual es coherente con la hipótesis de que los receptores D2 presenten “selectividad funcional”. Por otra parte, actualmente está cada vez más aceptado el concepto de heteromerización entre distintos GPCRs que co-localizan en las mismas muestras tisulares, y representa un nuevo campo para el diseño de mejores terapias. Por ello, los estudios dirigidos a la identificación de nuevos heterómeros que impliquen los receptores D2, permite ampliar la farmacología del sistema dopaminérgico. En esta tesis hemos observado crosstalk funcional entre dos pares de GPCRs: entre D2 y GABAB por un lado, y entre D2 y el receptor-1 de Orexina por otro. Aunque nuestros resultados indican que es muy probable que ambos pares de receptores formen heterómeros, se necesitan más datos para corroborarlo. La DA es crucial en el sistema cerebral de la recompensa, que juega un papel primordial en el fenómeno de la adicción. Está descrito que la administración crónica de cocaína altera la densidad y la afinidad de los receptores D1 y D2, así como también su interacción con otros receptores. En nuestro modelo de auto-administración de cocaína en ratas, hemos encontrado cambios en la respuesta del sistema dopaminérgico al agonista D2 quinpirole, después de la abstinencia de corto y también de largo plazo. En suma, nuestros resultados sobre la administración de cocaína subrayan la importancia del sistema dopaminérgico en la adicción a la cocaína, y además, el crosstalk funcional que hemos observado entre los receptores D2 y otros GPCRs abre nuevas posibilidades para el diseño y desarrollo de nuevos tratamientos para el abuso de drogas así como también para la esquizofrenia. / The dopaminergic system has been the focus of much research during the past several decades mostly because it is believed to be involved in several pathological conditions such as Parkinson’s disease, schizophrenia, Tourette’s syndrome, as well as in drug abuse. All the five subtypes of dopamine (DA) receptors belong to the family of the G-protein coupled receptors (GPCRs). Among them, D2 subtype are the primary target for all known antipsychotic drugs (antagonists) and drugs used to treat Parkinson’s disease (agonists). Unfortunately, the antagonistic effects on D2 receptors also elicit serious side effects. The low liability of side effects of the newest generation of antipsychotics (aripiprazole) is proposed to be based on selective D2 receptor functions, however further evidence is needed to support this hypothesis. In our study, we observed a variable property of aripiprazole on D2 autoreceptors in response to changes of the extracellular DA concentration, which is consistent with the D2 receptor “selective function” opinion. On the other hand, the concept of the heteromerization between colocalized GPCRs has been widely accepted and is suggested to be a new field for therapeutic improvement. Thus, the studies concerning the identification of new pairs of heteromers related to D2 receptors may broaden the pharmacology of the dopaminergic system. In this thesis, we found functional crosstalk in two pairs of GPCRs: between GABAB and D2R, and between orexin-1 and D2R. Although our results indicate the probability of their heteromerization, further studies are still needed. Dopamine is crucial in the brain reward system, which plays an important role in drug addiction. Chronic cocaine administration is widely reported to alter the dopamine D1 and D2 receptor density or affinity, as well as their interaction with other receptors. In our cocaine self-administration model, we found changes in dopamine system in response to the D2R agonist quinpirole in the long-term and short-term withdrawal rats. In conclusion, our results in cocaine administration emphasize the importance of dopamine system in cocaine addiction. Moreover, the functional crosstalk of D2 receptors with others GPCRs may supply new possibilities for developing innovative treatments in drug abuse as well as in schizophrenia.

El glioblastoma (multiforme) segueix sent uns dels tumors més letals. Això és conseqüència de l’alta radiosensibilitat del teixit sà del voltant, el que impedeix la deposició de dosis curatives amb les tècniques de radioteràpia convencionals. El tractament actual d’aquests tumors es basa en l’administració de temozolomida seguida d’una irradiació completa del cervell. Tot i així, només s’obté un petit increment en la supervivència dels pacients. Amb la motivació de millorar el pronòstic dels gliomes, noves tècniques de radioteràpia basades en el fraccionament espacial de la dosi, com la Minibeam Radiation Therapy (MBRT), s’han anat desenvolupant en els sincrotrons. Degut a que variacions en les característiques dels feixos en MBRT, ponen donar lloc a efectes biològics completament diferents, experiments in vitro i in vivo són necessaris per ajudar a comprendre’ls. En aquesta tesi es recullen un dels primers resultats in vitro obtinguts amb MBRT a l’ESRF. Els diferents tipus de dany cel·lulars han estat detectats i quantificats després de les irradiacions amb MBRT, comparat-los amb els que s’originen amb un feix de sincrotró blanc i sense fraccionar (BB). Així, es van assignar els endpoints (o dosis màximes efectives) d’ambdues irradiacions, delimitant el rang de dosis on la finestra terapèutica o endpoint era esperable per aquests tractaments. L’endpoint referit tant al dany directe sobre el DNA, com a la supervivència cel·lular van ser establerts als 12 Gy de dosi (vall) per ambdues tècniques, i a 18 Gy segons la capacitat de recuperació de les cèl·lules. Tot i així, els MBRT van mostrar major efectivitat en termes de mort cel·lular, especialment per apoptosi. Es van investigar possibles maneres d’incrementar l’índex terapèutic dels tractments administrant concomitantment a la radiació compostos amb àtoms d’alt Z com el cisplatí (cisPt). Utilitzant unes vesícules biològiques, els liposomes, es va millorar l’administració del cisPt a les cèl·lules, al mateix temps que es disminuïa la toxicitat del cisPt en les cèl·lules sanes. La concentració i distribució de Pt dins de les cèl·lules vives i de les mortes es va analitzar després dels tractaments, observant-se que els liposomes permetien augmentar la concentració de Pt intracel·lular, incrementant també el Ca i el Zn. Aquest estudi ha estat un dels primers realitzats amb cèl·lules mortes. Una altra alternativa era disminuir la concentració de cisPt combinant-lo amb nanopartícules d’Au (AuNPs), obtenint un augment de l’efectivitat del tractament amb una posterior irradiació. Tanmateix, 150 Gy de dosi pic van ser estar dins els límits de tolerància en cervells sans de rates. Per tant, s’ha demostrat l’efectivitat dels MBRT en eliminar cèl·lules de glioma, així com en la capacitat d’aquesta tècnica de preservar els teixits sans després de les irradiacions. Aquests resultats converteixen a la MBRT en una tècnica molt prometedora en el tractament d’aquests tumors, amb l’avantatge afegida de que és factible la seva exportació fora dels sincrotrons. / Glioblastoma and glioblastoma multiforme are one of the most lethal tumors despite modern treatments. The high morbidity of the surrounding healthy tissues arises as the main obstacle to reach a curative treatment in conventional radiotherapy. The gold standard treatment based on temozolomide followed by a complete brain irradiation provides only a slight increase of survival. To overcome these limitations, new radiotherapy approaches such as Minibeam Radiation Therapy (MBRT) which is based on the spatial fractionation of the dose, are under development at synchrotron sources. Since the different beam widths and spacing in MBRT might lead to completely different biological effects, in vitro and in vivo experiments were warranted to understand the effects of MBRT. In this frame, this Ph.D. dissertation compiles all the results of one of the firsts in vitro experiments with MBRT. The detection and quantification of the different kinds of cell damage after MBRT irradiations were identified and compared with those caused by white broad beam (BB) irradiations. In addition, the endpoints (or threshold doses) for both radiation techniques were assessed, delimiting to some extent the range of doses where the therapeutic window (i.e., endpoint) for a new treatment could be expected. Despite the endpoint regarding direct damage on DNA and cell survival was established at 12 Gy of (valley) dose for both techniques, and at 18 Gy concerning the cell recovery, MBRT provides a higher effectiveness in terms of cell killing, specially through apoptosis. Moreover, new possible ways to increase the therapeutic index of gliomas treatments by using compounds containing high-Z atoms as cisplatin (cisPt) concomitantly to radiation were investigated as well. Biological-like vesicles, named liposomes, were used to improve the drug delivery into the cells, whereas decreasing the cisPt toxicity on healthy cells. The concentration and distribution of Pt inside both alive and dead cells were analyzed after this treatment, indicating that liposomes led to increase the Pt concentration intracellularly, increasing also the amount of Ca and Zn. Moreover, it was the first time that dead cells were studied. Another alternative explored was the reduction of cisPt concentration by combining cisPt with gold nanoparticles (AuNPs). This combination concomitantly to irradiation showed a higher effectiveness in terms of cell killing. After all the information obtained for the first time about the effects of MBRT in vitro, the tolerance doses on healthy rat brains were established at around 150 Gy of peak dose. Therefore, it could be demonstrated not only the effectiveness of MBRT in killing glioma cells, but also the sparing capability of healthy tissues after such irradiations. These results makes MBRT a very promising RT technique to be explored, with the asset that it has the potential to be extended outside synchrotrons.

Las proteasas son enzimas que escinden proteínas catalizando la hidrólisis del enlace peptídico. Todas las proteínas sufren proteólisis en algún momento u otro de su ciclo de vida y de este modo las proteasas regulan casi todos los procesos biológicos. Las carboxipeptidasas son proteasas que hidrolizan el enlace C-terminal de las proteínas y péptidos. En esta tesis se estudia a las carboxipeptidasas de la familia M14 en la clasificación de MEROPS (y que describiremos como metalocarboxipeptidasas). Las metalocarboxipeptidasas controlan importantes procesos biológicos, como son la regulación de la presión sanguínea, el equilibrio entre coagulación y fibrinólisis, o el procesamiento de neuropéptidos y hormonas peptídicas. Además, están implicadas en procesos patológicos como el cáncer o las enfermedades neurodegenerativas. La información disponible sobre la función biológica de estas enzimas es muy limitada, por lo que en la presente tesis se planteó como objetivo profundizar en el estudio de la función de varias metalocarboxipeptidasas. Con esta finalidad se realizaron ensayos cinéticos, estudios de biología celular y de determinación de la estructura tridimensional. Además, se desarrollaron y aplicaron distintas técnicas proteómicas para el estudio de los sustratos de carboxipeptidasas (y que se incluyen por lo tanto dentro del campo de la degradómica). Esta tesis se compone de cuatro trabajos de investigación independientes en los que se caracteriza funcional y estructuralmente a distintas metalocarboxipeptidasas. En el primer trabajo se determinó la estructura tridimensional de una isoforma corta del gen silver de Drosophila melanogaster, correspondiente al primer dominio de la carboxipeptidasa D de mamíferos. La mutación de este gen genera moscas adultas con cutículas pálidas o plateadas y con alas puntiagudas. Esta estructura tridimensional fue obtenida en presencia del inhibidor GEMSA a una resolución de 2,7 Å y se corresponde en general con la estructura canónica de otras carboxipeptidasas de su subfamilia. Presenta sin embargo como elemento distintivo un lazo flexible fácilmente accesible a las proteasas, por lo que la proteólisis podría constituir un mecanismo de regulación de esta enzima. En el segundo trabajo se incluye la caracterización bioquímica y funcional de la carboxipeptidasa A4 humana (CPA4), la cual ha sido asociada con la agresividad del cáncer de próstata. Se determinó que esta enzima es secretada al espacio extracelular y muestra un pH óptimo neutro. Mediante aproximaciones peptidómicas se identificaron distintos péptidos bioactivos como posibles sustratos de la CPA4: la neurotensina, diversas graninas y péptidos opioides tales como la Met- o Leu- encefalina. Estos péptidos están involucrados en la proliferación y diferenciación de las células de cáncer de próstata, y permiten explicar la asociación de esta enzima con la agresividad de este tipo de cáncer. En definitiva, la CPA4 funcionaría en el procesamiento de neuropéptidos a nivel extracelular. El tercer trabajo comprende el desarrollo de una nueva aproximación proteómica para el estudio de las preferencias de sustrato de las carboxipeptidasas. Esta técnica, basada en la tecnología COFRADIC, permite aislar miles de productos de la acción de carboxipeptidasas sobre una librería de péptidos (generada a partir de un proteoma celular). Esta técnica permitió describir las poco caracterizadas preferencias de sustrato de la carboxipeptidasa de mastocitos. En el cuarto trabajo se aplicó una técnica proteómica denominada “COFRADIC C-terminal” que permite la búsqueda de sustratos naturales de carboxipeptidasas. En particular, esta técnica se aplicó a la búsqueda de sustratos naturales de la carboxipeptidasa citosólica 1 (CCP1), la cual estaría asociada a mecanismos de degeneración y regeneración neuronal que aún se desconocen. Se ha propuesto que CCP1 tiene como sustratos a la tubulina y a otras proteínas que presentan residuos de glutámico en su extremo C-terminal. En este trabajo se pudieron identificar 7 nuevos posibles sustratos protéicos para CCP1. / Proteases are enzymes that irreversibly cleave proteins by the catalysis of peptide-bond hydrolysis. With all proteins undergoing proteolysis at any point of their life cycle, proteases regulate virtually every biological process. Carboxypeptidases are proteolytic enzymes that catalyze the hydrolisis of peptidic bonds at the C-terminus of peptides and proteins. In this thesis, we studied carboxypeptidases from the M14 family (according to the MEROPS database classification), hereafter described as metallocarboxypeptidases. Metallocarboxypeptidases play key roles in controlling various biological processes, including blood coagulation/fibrinolysis, blood pressure regulation, pro-hormone and neuropeptide processing; and are also implicated in various pathological conditions such as cancer or neurodegenerative disorders. Despite the important functions performed by these enzymes, there is usually limited knowledge about their in vivo biological roles. The present thesis was aimed to gain insights into the understanding of the biological functions of different metallocarboxypeptidases. For this purpose, we applied different approaches that included kinetic studies, cell biological studies and structural characterization. In addition, we participated in the development of different proteomic tools for protease/carboxypeptidase substrate determination (degradomics). The present thesis consists of four independent research works that focus in the structural and functional characterization of different metallocarboxypeptidases. The first work presents the crystal structure of a short isoform of Drosophila melanogaster silver gene, which corresponds to the first repeat of a mammalian CPD. Silver gene is responsible for the silver mutation, characterized for adult flies that display cuticles that are pale and silvery in color, and pointed wings. This three-dimensional structure was solved in presence of an inhibitor (GEMSA) at 2.7 Å resolution and overall corresponds with the structure of other members of its subfamily of metallocarboxypeptidases. A unique structural element in the here presented structure is a surface hotspot targetable by peptidases, suggesting that this enzyme might be regulated (i.e., inactivated) by proteolysis. The second work comprises the biochemical and functional characterization of human carboxypeptidase A4 (CPA4), an enzyme that has been associated with prostate cancer aggressiveness. We found that this enzyme is secreted outside the cells and displays a neutral pH optimum that is compatible with a function in the extracellular environment. A peptidomic study identified several biologically relevant putative peptidic substrates of CPA4: neurotensin, granins, and opioid peptides such as Met- and Leu-enkephalin. These peptides are involved in the proliferation and differentiation of prostate cancer cells, potentially explaining the link between CPA4 and cancer aggressiveness. Altogether, CPA4 would function in the extracellular neuropeptide processing. The third work comprises the development of a novel proteomic approach to study the substrate preferences of carboxypeptidases. This technology can be described as a COFRADIC-based proteome-derived peptide library approach and allows for the enrichment of thousands of carboxypeptidase products from natural, proteome-derived peptide libraries. This approach served to delineate the previously little studied substrate specificity profile of mouse mast cell carboxypeptidase. In the fourth work we applied a proteomic tool (C-terminal COFRADIC) that allows searching for natural substrates of carboxypeptidases. Particularly, we searched for natural substrates of cytosolic carboxypeptidase 1 (CCP1) in a cellular system. This enzyme is considered to be a molecular link between neuronal degeneration and regeneration, although the molecular pathways in which CCP1 is implicated remain undefined. It has been proposed that CCP1 would posttranslationally modify tubulin and other proteins that present glutamate-stretches in their C-terminus. Here, we were able to identify seven new putative CCP1 protein substrates.

El edema macular diabético (DME) es una de las primeras causas de disminución de la agudeza visual en pacientes con retinopatía diabética (DR). La rotura de la barrera hematorretiniana (BHR) debido a la disrupción de las tight junctions (TJ) es el principal factor causante del DME. Además, el incremento de las citoquinas proinflamatorias como la IL-1β juega un papel importante en la patogénesis del DME y la retinopatía diabética proliferativa (PDR). Mientras que la alteración de las proteínas implicadas en la disrupción de las TJ de la BHR interna ha sido ampliamente estudiada, existe poca información sobre este proceso en la BHR externa. En el estudio FIELD sobre DR, el tratamiento con fenofibrato redujo en un 30% la necesidad de tratamiento con láser en pacientes diabéticos. Además, en el estudio ACCORD-Eye se observó una reducción del 40% en la progresión de la DR en el grupo de pacientes diabéticos a los que se les administró fenofibrato. Sin embargo, los mecanismos a través de los cuales el fenofibrato ejerce sus efectos beneficiosos en pacientes con DR se desconocen. En base a lo explicado anteriormente, los objetivos de esta tesis han sido: 1. Estudiar el efecto de la hiperglicemia sobre la funcionalidad de la BHR externa y la expresión de las proteínas de TJ en una línea celular humana de RPE (ARPE-19). 2. Estudiar el efecto protector del ácido fenofíbrico (el metabolito activo del fenofibrato) sobre la funcionalidad y la expresión de las proteínas de TJ en células ARPE-19 cultivadas bajo diferentes concentraciones de glucosa, con o sin IL-1β. Además se evaluó la implicación de la vía de la AMPK en la hiperpermeabilidad inducida por la IL-1β y el efecto del ácido fenofíbrico sobre la activación de la AMPK. En nuestro primer trabajo observamos una disminución de la permeabilidad y un aumento de los niveles de claudina-1 en condiciones de hiperglicemia. Sin embargo, después de bloquear la expresión de claudina-1 no se detectaron cambios en la resistencia transepitelial (TER) ni en la permeabilidad. Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de claudina-1 inducida por la hiperglicemia no está relacionada con los mecanismos a través de los cuales la glucosa aumenta la función oclusiva de las TJ en las células ARPE-19. Se demuestra que es la combinación de los diferentes factores presentes en el medio diabético, y no la hiperglicemia por sí sola, los que producen una alteración de la funcionalidad de la BHR externa y la disrupción de las TJ. En el segundo trabajo utilizamos una combinación de IL-1β + hiperglicemia con el fin de simular en las células ARPE-19 la lesión producida por el medio diabético. El tratamiento con ácido fenofíbrico redujo (a 25 μmol/l) o previno (a 100 μmol/l) de manera dosis dependiente, el aumento de permeabilidad y la desorganización de las TJ inducida por la IL-1β + 25 mmol/l D-Glucosa, hecho que se asoció a una mayor preservación de la función de sellado de las células del RPE. Este efecto no está relacionado con cambios en la expresión de las proteínas de TJ y sugiere que para el correcto funcionamiento de la BHR externa es más importante una adecuada distribución y estructura de las TJ que un aumento en el contenido neto de éstas. Además, demostramos que el efecto protector del ácido fenofíbrico se debe a su capacidad para suprimir la activación de la AMPK inducida por la IL-1β, previniendo así la hiperpermeabilidad inducida por el medio diabético. Nuestros resultados contribuyen significativamente a aumentar el conocimiento sobre los mecanismos de acción a través de los cuales el fenofibrato ejerce sus efectos beneficiosos en el desarrollo y la progresión del DME. / Diabetic macular edema (DME) is one of the primary causes of poor visual acuity in patients with diabetic retinopathy (DR). The breakdown of the blood-retinal barrier (BRB) due to the disruption of tight junctions (TJ) is the main factor accounting for DME. In addition, the increase of proinflammatory cytokines such as IL-1β plays a key role in the pathogenesis of DME and proliferative diabetic retinopathy (PDR). While extensive work has been carried out to identify the factors involved in the disruption of TJ of the inner BRB, the mechanisms implicated in the outer BRB regulation have been poorly explored. In the FIELD study on DR, treatment with fenofibrate reduced the need for laser treatment for DME and PDR by 30% in diabetic patients. In addition, the ACCORD Eye Study showed a 40% reduction in DR progression in the group of patients receiving fenofibrate. However, the mechanisms by which fenofibrate exerts its beneficial effects in DR remain to be elucidated. With all this background, the main points of this thesis were: 1. To study the effects of high glucose concentration on the outer BRB function and the expression of TJ proteins in a human RPE cell line (ARPE-19). 2. To study the effect of fenofibric acid (the active metabolite of fenofibrate) on the barrier function and the levels of TJ proteins in ARPE-19 cells cultured under different glucose concentrations with and without IL-1β. In addition, we evaluated the role of AMPK in mediating the hyperpermeability induced by IL-1β and the effect of fenofibric acid on AMPK activation. Our first study showed a reduction of permeability and an increment of claudin-1 levels under hyperglycemic conditions. However, after blocking claudin-1 expression no changes in transepithelial electrical resistance (TER) and permeability were observed. These results suggest that the overexpression of claudin-1 induced by high glucose concentration is not involved in the mechanisms by which glucose increases the TJ sealing function in ARPE-19 cells. In addition, our findings demonstrate that hyperglycemia per se is not the only cause responsible for the breakdown of the outer BRB in patients with DR. It is the combination of different factors present in the diabetic milieu with hyperglycemia, the one responsible for the impairment of the outer BRB and TJ disruption. In our second study we used a combination of IL-1β + hyperglycemia to mimic the diabetic milieu and induce the breakdown of ARPE-19 monolayer. Treatment with fenofibric acid was able to reduce (at 25 μmol/l) or prevent (at 100 μmol/l) in a dose-dependent manner, the increment of permeability and the disorganization of TJ induced by IL-1β + 25 mmol/l D-Glucose, which was associated with the preservation of the sealing function of RPE cells. This effect was unrelated to changes in the content of TJ proteins, suggesting that an ordered distribution, rather than a crude assortment, of TJ proteins is essential for the efficient functioning of the outer BRB barrier. In addition, we demonstrated that the protective effect of fenofibric acid was mainly mediated by its ability to lower AMPK activation induced by IL-1β, which prevented the hypermermeability induced by the diabetic milieu. These findings contribute significantly to increasing our knowledge about the mechanisms involved in the beneficial effects of fenofibrate on the development and progression of DME.

Whether a cell enters the cell cycle, undergoes apoptosis or survives is a consequence of the integration of several cellular and environmental signals. Growth factors, cell contact, and apoptotic inductors regulate a complex system of signal transduction pathways that trigger the activation of a large number of genes. One of the key proteins in the regulation of the cell cycle and the commitment to apoptosis is the transcription factor E2F1. It has been suggested that E2F1 activity levels could determine whether a cell enters the cell cycle, cell-cycle arrest or apoptosis. In these decisions, not only is transcriptional activity important, but also the synchronization of E2F1 activity with specific signal transduction pathways. In this context it has been suggested that activation of the PI 3-kinase pathway inhibits the apoptotic effect of E2F1 overexpression. Since GSK3-beta is a downstream effector of PI 3-kinase, we performed phosphorylation and binding analyses to examine the possible relationship between GSK3-beta and E2F1. The results obtained in this thesis demonstrate that GSK3-beta phosphorylates human E2F1 in vitro at serine 403 and threonine 433. In earlier studies it has already been shown that these two residues are also phosphorylated by the TFIIH kinase, cdk7. We did not detect phosphorylation by GSK3-beta in vivo. However, immunoprecipitation experiments revealed in vivo binding of these proteins. By transient transfection experiments with GSK3-beta and E2F1 constructs, GSK3-beta -RNAi assays, and the use of PI 3-kinase and GSK3-beta specific inhibitors, we demonstrate that GSK3-beta regulates E2F1 transcriptional activity through its interaction with E2F1 transactivation domain and that GSK3-beta kinase activity is not required for this regulation.Our data obtained here integrates into a model in which translocation of GSK3-beta to the nucleus modulates E2F1 activity and, as a consequence, determines whether a cell enters the cell cycle or undergoes apoptosis. / EN CASTELLANO:La decisión de una célula de iniciar el ciclo celular, ir hacia apoptosis o sobrevivir es consecuencia de la integración de diferentes señales extracelulares. Los factores de crecimiento, los contactos entre células, así como diversos inductores de apoptosis regulan un complejo sistema de vías de transducción de señales que inducen la activación de un gran número de genes implicados en la respuesta celular de los procesos mencionados anteriormente. Una de las proteínas claves en la regulación del ciclo celular y/o de la entrada en apoptosis es el factor de transcripción E2F1. Se ha sugerido que los niveles de actividad E2F1 pudieran actuar como sensores de la entrada o parada del ciclo celular y apoptosis. En estas decisiones no sólo la actividad transcripcional es importante sino también la sincronización de E2F1 con vías de transducción específicas. Es en este contexto en el cual se ha sugerido que la activación de la vía de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI 3-quinasa) inhibe el efecto apoptótico causado por la sobreexpresión de E2F1. Debido a que la glicógeno sintasa quinasa-3-beta (GSK3-beta) es uno de los substratos fisiológicos más importantes de esta vía, se realizaron experimentos con el fin de analizar la existencia de una interacción entre estas dos proteínas.Los resultados obtenidos en esta Tesis demuestran que GSK3-beta fosforila al factor de transcripción E2F1 humano in vitro en las posiciones serina 403 y treonina 433. Estos residuos ya han sido descritos anteriormente como substratos de la fosforilación por parte del complejo quinasa TFIIH, concretamente por uno de sus miembros: cdk7. A pesar de que no podemos detectar fosforilación in vivo, experimentos de immunoprecipitación confirman la existencia de una unión in vivo entre las proteínas GSK3-beta y E2F1. Mediante transfecciones transitorias, 'RNA interference (RNAi)', y la utilización de inhibidores específicos de PI 3-quinasa y GSK3-beta demostramos que GSK3-beta regula la actividad de E2F1 a través de la interacción con su dominio transactivador y que la actividad quinasa de GSK3-beta no es requerida para esta activación.Por tanto, nuestros resultados se integrarían en un modelo en el que la translocación de GSK3-beta al núcleo modularía la actividad E2F1 y, en consecuencia, la decisión de una célula de entrar en el ciclo celular o dirigirse hacia la apoptosis.

La fortificación mandataria de harina de trigo con ácido fólico ha sido implementada en numerosos países con el objetivo de reducir el número de recién nacidos con defectos del tubo neural (DTN). Chile implementó esta intervención nutricional a partir del año 2000. El ácido fólico es la vitamina más utilizada en alimentos fortificados y suplementos vitamínicos y corresponde a una forma más oxidada que la natural. Actúa como cofactor y co-sustrato para la metilación biológica y la síntesis de ácidos nucleicos, transportando unidades activas monocarbonadas necesarias para la síntesis de purinas y timidilato, así como para la síntesis, replicación y reparación del ácido desoxirribonucleico (ADN). La revisión sistemática de estudios no controlados de diferentes países que fortifican harina con ácido fólico muestra una importante reducción de DTN. En Chile esta reducción alcanza a 55% considerando un período de diez años a partir del inicio de la fortificación. Chile monitorea el nivel de ácido fólico en harina de trigo desde el año 2005. El análisis de esta información muestra una importante dispersión del nivel de ácido fólico cuando se compara con lo establecido en la norma chilena (2.2 mg/kg). Entre los años 2005 y 2008 destaca que 50% de las muestras presentaba niveles inferiores a lo establecido por norma, 10% no contenía ácido fólico y 30% presentaba niveles muy elevados. La estimación indirecta de la ingesta de folatos totales alcanza, en algunos grupos de adultos mayores, niveles superiores al Límite Superior Tolerable de Ingesta para adultos (>1000 μg/día) que se refleja en elevados niveles de folato sérico. Estos alcanzan niveles suprafisiológicos (>20 μg/L) en 50% de adultos mayores estudiados, siendo el déficit de folato sérico casi inexistente. Una extensa información se ha publicado durante los últimos años en relación a riesgos en salud derivado de la suplementación con ácido fólico, sugiriendo un aumento del riesgo de algunos tipos de cáncer cuando se consume en altas dosis, por tiempo prolongado y asociado a la existencia de lesiones preneoplásicas previas, entre ellos, un aumento en la recurrencia de adenomas colorrectales y de cáncer de colon, sin embargo la revisión sistemática desarrollada no permite concluir la existencia de mayor riesgo. En relación con el cáncer de mama, no puede concluirse que existan beneficios o riesgos asociados a dicha suplementación, observándose sólo un efecto protector en aquellas bebedoras de alcohol y portadoras de algunos polimorfismos de enzimas del ciclo del folato. El folato y otras vitaminas relacionadas, especialmente vitamina B12, cumplen además una importante función en el crecimiento, diferenciación, desarrollo y reparación cerebral, así como también, en la cognición, encontrándose que la suplementación mejora la función cognitiva cuando los niveles de folato sérico iniciales son bajos. En adultos mayores chilenos, cuando los valores de folato sérico son bajos y los niveles de vitamina B12 elevados, el incremento de una unidad de folato sérico (1 μg/L) disminuye el riesgo de deterioro cognitivo; en cambio, el aumento de una unidad de folato sérico cuando los niveles son elevados y el nivel de vitamina B12 bajo aumenta el riesgo. En resumen, la fortificación universal de harina de trigo con ácido fólico en Chile ha sido una intervención nutricional exitosa cumpliendo con el objetivo de reducir la prevalencia de los defectos del tubo neural, determinando un beneficio para la salud y calidad de vida de los recién nacidos, pero también ha determinado un incremento importante de la ingesta de folatos totales y de folato sérico, especialmente en adultos mayores, sugiriendo revisar los niveles de fortificación que prevengan el mayor riesgo de deterioro de la función cognitiva observado en ambos extremos de la distribución de folato sérico. / Mandatory fortification of wheat flour with folic acid has been implemented in many countries in order to reduce the number of newborns with neural tube defects (NTDs). Chile has implemented this nutritional intervention since 2000. Folic acid is the most commonly used in fortified foods and supplements. Folate acts as cofactors and co-substrates for methylation, biological synthesis of nucleic acids being essential for DNA replication and repair. The systematic review of uncontrolled studies from different countries that fortified flour with folic acid shows a significant reduction in NTD. In Chile this reduction was 55 % within period of ten years from the beginning of flour fortification. Chile monitors wheat flour folic acid levels since 2005. Analysis of these data in the flour samples shows an important dispersion level when compared with the established in the Chilean rule (2.2 mg/kg). Between 2005 and 2008, 50% of samples had less folic acid that established by law, 10% did not contain folic acid, and 30 % had very high levels. Indirect estimation of total folate intake reached higher levels than adult folic acid Upper Level (>1000 mg/day) in some elderly people, which is related to the high serum folate level. Fifty percent of older adults reached supraphysiological levels (>20 μg/L) with no serum folate deficiency. An extensive literature has been lately published related to health risks derived from folic acid supplementation, suggesting an increased risk of some cancers when it is consumed in high doses, for prolonged periods and associated with preneoplastic lesions, an increase in the recurrence of colorectal adenomas and colon cancer, but it cannot be established that supplementation with folic acid would have benefits on the recurrence of colorectal adenomas or cancer prevention. It cannot be also concluded that folic acid supplementation would have benefits or risks on breast cancer. Its protective effect is only observed in women who drank alcohol and are carriers of some enzyme polymorphisms of folate cycle. Folate and related vitamins, especially vitamin B12, play an important role in growth, differentiation, brain development and repair, as well as, in cognition, finding that supplementation improves cognitive function when initial serum folate levels are low. In elderly Chileans, when serum folate values are low and vitamin B12 levels are high, each one unit (1 μg/L) increase of serum folate decreases the risk of cognitive impairment; however, the one unit increase when serum folate levels are high and the low level of vitamin B12 increases the risk. In summary, the universal wheat flour folic acid fortification in Chile has been a successful nutritional intervention that has met its goal of reducing the prevalence of NTD determining a benefit to the health and quality of life of newborns, but it has also led to an increase in the intake of total folate and serum folate, especially in older adults, suggesting to reassess folic acid fortification level to prevent the increased risk of impaired cognitive function observed at both extremes of serum folate distribution.