El present treball s'ha realitzat en el marc del Programa de Biologia Estructural i Computacional de l'IRB Barcelona, en el grup de RMN de proteïnes, sota la direcció de la Dra María J. Macías. L'interès del grup d'investigació se centra en la determinació estructural de dominis de proteïna, en l'estudi d'interaccions i en entendre els mecanismes per a la seva regulació. Concretament, aquest treball està enfocat en l'estudi estructural de dominis FF.En el nostre grup es va començar a estudiar els dominis FF a partir de l'observació que aquests dominis es troben sovint en proteïnes que també contenen WW, un petit domini d'interacció proteïna-proteïna que ha estat i continua sent la línia d'investigació principal del grup, i del qual s'han realitzat nombrosos i detallats estudis. En canvi, el dominis FF han estat identificats fa poc temps i la informació estructural i funcional de la qual es disposa és, a dia d'avui, escassa. En part, el pocs estudis realitzats amb aquests dominis pot ser conseqüència de que només els trobem en un conjunt reduït de proteïnes. De fet, la seva presència es limita a tres famílies de proteïnes: els factors d'splicing FBP11, Prp40 i URN1, el factor de transcripció CA150 i una família de proteïnes reguladores de RhoGTPases, les p190 RhoGAPs.Al meu grup, l'estudi amb dominis FF es va iniciar amb la resolució de l'estructura tridimensional del primer FF de la proteïna Prp40 de llevat, que va representar la segona estructura resolta per a un domini FF. En aquest treball l'objectiu ha estat aprofundir en el coneixement dels dominis FF, bàsicament des d'un punt de vista estructural utilitzant com a tècnica principal la resonànica magnètica nuclear (RMN). Aquesta tesi doctoral s'ha dividit en tres parts i en cada una d'elles s'ha treballat amb els dominis FF de les tres famílies de proteïnes esmentades anteriorment. L'enfoc també ha estat lleugerament diferent a cada part. Així, en el primer capítol, centrat en els dominis FF presents als factors d'splicing URN1 i Prp40, el gruix de la feina va ser l'obtenció de noves estructures tridimensionals per RMN d'aquests dominis. En canvi, en el segon capítol ens vam centrar en l'estudi de la interacció dels dominis FF de CA150 amb el seu primer lligand descrit, un motiu doble fosforilat del domini C-terminal de la RNA-polimerasa II (fosfo-CTD). Finalment, en la tercera part l'interès es va dirigir a l'estudi de la regulació de l'associació dels dominis FF de p190-A RhoGAP amb el factor de transcripció TFII-I, per mitjà d'una fosforilació sobre el primer FF de p190-A RhoGAP. / The present work has been done in the protein NMR group from the Structural and Computational Biology at the IRB Barcelona, under the direction of Dr. Maria J. Macias.The group's main interest is the structural determination of protein domains, in the study of their interactions and in the understanding of the mechanisms for their regulation. In particular, this work is focused in the structural study of FF domains.In our group, the study of FF domains began from the observation that these domains are often found in proteins that also contain WW domains, a small protein-protein interaction domain that has been, and continues to be the central research line of the group and that has been object of numerous and detailed studies.Conversely, FF domains have been recently identified and the structural and functional information available on them is, to date, limited. One of the reasons of the few studies reported for these domains could be consequence of their reduced presence in proteins. In fact, FF domains are only present in three protein families: the splicing factors FBP11, Prp40 and URN1, the transcription factor CA150 and a family of RhoGTPase regulators, the p190 RhoGAPs.In our group, the work with FF domains started with the solution of the three-dimensional structure of the first FF domain from yeast Prp40, which just represented the second solved structure for an FF domain. In the present work the aim has been to gain insight into FF domain knowledge, basically from a structural point of view, using nuclear magnetic resonance (NMR) as the principal methodology for the structural studies.This thesis has been divided in three parts, and in each of them we have work with FF domains from the different families mentioned above. The subject of study has been also slightly different in each part. In the first chapter, focused in FF domains present in Prp40 and URN1 splicing factors, the principal work consisted in the obtaining of novel three-dimensional structures for these domains by NMR. In contrast, in the second chapter the main interest was the study of the interaction of CA150 FF domains with their first described ligand, a doubly phosphorylated motif of the RNA polymerase II C-terminal domain (phospho-CTD). Finally, in the last part our efforts were focused in the study of the regulation of p190-A RhoGAP FF domains association with the general transcription factor TFII-I through phosphorylation on the first FF domain of p190-A RhoGAP.

In human there are 518 protein kinases reported and many of them are involved in several cellular processes and also in important pathologies. Kinases have a diverse specificity for the sequences they phosphorylate, and it has been shown that their in vivo specificity is guided by several elements such as the sequence surrounding the phosphorylated amino acid in the substrate, the co-localization with the substrate, interactions mediated by docking sites and the association of kinases to adaptor or scaffold proteins (AS). The objective of the current thesis has been the identification and quantification of the contribution to the specificity of i) the phosphorylated site and its surrounding residues in sequence and ii) the association of kinases to AS proteins. By integrating data from public resources we compiled a set of kinase-phosphorylation sites in human corresponding to 325 (62.7%) kinases, 1856 substrates and 5946 phosphorylation sites. We have used sequence logos for representing the phosphorylation motifs recognized by the kinases in our set and we have used these logos to guide the classification of kinases attending to the residue composition of the sequences surrounding the phosphorylation site. We have used position-specific scoring matrices (PSSMs) as the probabilistic representation of the sequences phosphorylated by the kinases. Based on the score in the PSSMs relative to the phospho-acceptor amino acid, we classified several residues as specificity-determinant residues (SDR) for several kinase families. The identity, position in the sequence alignment and the frequency of the SDRs identified vary considerably among the kinase families analyzed. The statistical significance of the PSSMs was assessed taking into account their recall and their information content (IC). We found negative correlations between the the number of seed sequences and i) the recall of the PSSMs and ii) the IC of the PSSMs. Based on the IC value, and in the comparison to random distributions, we found that statistically significant PSSMs differ from the non-statistically significant ones regarding their IC, recall, number of seed phosphorylation sites and AUC-ROC. We have developed a computational strategy for the identification of proteins with known function as adaptors or scaffolds of human kinases (kAS). In total, we have identified a set of 191 kAS proteins which is enriched in domains and functional terms that support their role as AS. These 191 kAS associate to 55% of human kinases, which suggest that the association to this type of AS molecules is common among human kinases. Our results suggest that, when compared to random proteins, kAS proteins are five times more likely to interact with a significantly large fraction of the substrates of a the kinases to which the kAS are associated. Starting from a set of 156 human kinases for which we count with at least five substrates, we identified a set of 279 proteins with a potential function as adaptor or scaffold (pAS). This set is enriched in protein domains and functional terms related to the predicted function and that also suggest a relationship to signalling processes. Our analysis on cellular co-localization suggest that, for 74.6% of the kinase-pAS associations found, the pAS protein may play a role in the co-localization of the kinases and their corresponding sets of substrates. Finally, we have analyzed the relationship between the association of different kinases to common AS proteins and the number of in vivo substrates shared by the kinases. Our results suggest that kinases with AS proteins in common do not share more in vivo substrates than what would be expected only due to chance. To our opinion, this suggests that AS proteins may diminish the substrate crossed specificity of the kinases to which they associate.

La fermentación alcohólica es un proceso complejo en el que los azúcares presentes en el mosto se convierten mayoritariamente en etanol y CO2 (Fleet and Heard, 1993), gracias a la acción de las levaduras, principalmente Saccharomyces cerevisiae. Durante la vinificación, las levaduras tienen que hacer frente a un conjunto de situaciones de estrés, de las que destacamos el estrés hiperosmótico al inicio del proceso, debido las elevadas concentraciones de azúcares en los mostos (150-250 g/L) (Attfiled, 1997), o el causado por el agotamiento de nutrientes, especialmente la depleción de nitrógeno. Existen diferentes trabajos en los que se estudia la respuesta de las levaduras a diferentes situaciones de estrés. En el llevado a cabo por Gasch et al. (2000) se describen alrededor de 900 genes que ven alterada su expresión cuando se exponen a diferentes tipos de estrés, lo que se denominó respuesta a estrés ambiental (ESR). Existen otros trabajos centrados en el proceso de la fermentación alcohólica, como el de Rossignol et al. (2003) donde se observó que más de 2000 genes variaban sus niveles durante la vinificación. En la primera parte se describe la respuesta de las levaduras al agotamiento de nitrógeno y la adición de diferentes fuentes. Se observa que la adición de estas fuentes a vinificaciones limitantes permite completar el proceso fermentativo de forma similar a la vinificación control, aunque la naturaleza de éstas sí influye, en el perfil organoléptico del producto final (Jiménez-Martí et al., 2007), como también influye en la reprogramación celular tras las adiciones (Jiménez-Martí et al., 2008). Asimismo, se han descrito posibles marcadores moleculares de la limitación de nitrógeno como la actividad arginasa o los niveles de expresión del gen ACA1 (Jiménez-Martí et al., 2007). En la segunda parte se estudia la respuesta de las levaduras al estrés hiperosmótico causado por elevadas concentraciones de glucosa. Se deduce que hay una mayor represión por catabolito de carbono en 20% de glucosa que en 2%. Se analizó también la implicación de algunas de las principales rutas de señalización en respuesta a este tipo particular de estrés; observándose la implicación de la ruta HOG y también una cierta participación de las rutas PKA y TOR. Se identificaró un grupo de genes de función desconocida más expresados en 20% de glucosa que en 2%. Uno de ellos es YHR087W, cuyo mutante de deleción muestra defectos de crecimiento y consumo de glucosa en medios conteniendo elevadas concentraciones de glucosa, además de presentar mayor susceptibilidad a otras condiciones de estrés que su cepa parental, por lo que se considera un gen de respuesta a estrés. Estudios proteómicos comparativos entre dicho mutante y su cepa parental en medios con 20% de glucosa muestran cambios en los niveles de expresión de proteínas pertenecientes a la categoría de plegamiento de proteínas. También se realizó un estudio transcriptómico global comparativo entre una cepa vínica y de laboratorio frente a elevadas concentraciones de azúcares. Los resultados sugieren que la mayor viabilidad de la vínica en estos medios podría estar relacionada con una mayor expresión de los genes implicados en glicolisis, fermentación y procesos biosintéticos. Finalmente, se llevaron a cabo diferentes aproximaciones con la intención de mejorar el comportamiento fermentativo de algunas cepas vínicas. Esto se consiguió, por un lado con la preadaptación de cepas con problemas al inicio de la fermentación en medios de rehidratación con determinadas concentraciones de glucosa. Por otro lado, se realizaron manipulaciones genéticas de los genes HSP26 e YHR087W. Éstas resultan, en general, en un aumento de los niveles de expresión de los genes, y en algunos casos en una mayor resistencia a diferentes condiciones de estrés, así como un menor tiempo para finalizar la fermentación (Jiménez-Martí et al., 2009). / Alcoholic fermentation is a complex process in which sugars presents in grape must become ethanol and CO2 through the action of yeasts, especially Saccharomyces cerevisiae. Throughout wine production yeast cells are affected by a plethora of stress conditions, such as nitrogen starvation, or osmotic stress due to high glucose concentrations. In this work we analyzed the effect of adding different nitrogen sources (ammonia, amino acids or a combination of both) under nitrogen depletion condtions in order to understand yeast metabolic changes. We found that the nature of the nitrogen source added introduces changes to the volatile compounds profile and to the gene expression, and also there is a differential cellular reprogramming after addition depending on the nitrogen source. On the other hand, arginase activity and the expression of ACA1 gene are useful as a molecular markers of nitrogen depletion/addition during vinification. Besides, we present a comprehensive study of the response to high glucose stress which indicates important transcriptomic changes, especially in terms of the genes involved in both stress response and respiration, and the implication of the HOG pathway. We also describe several genes of an unknown function highly expressed under 20% (w/v) glucose than under 2% . In this work we focus on the YHR087W gene, whose relevance for the response to high sugar and other stress conditions and the relationship of the encoded protein with several Hsp proteins suggest its implication in stress response. Indeed, we introduce several genetic manipulations in HSP26 and YHR087W in two different wine yeasts in order to improve their fermentative behavior. Our results indicate that some of these modifications result in strains with higher expression of these genes, better resistance to certain stress conditions, and even improved fermentative behavior. We also compare several laboratory and wine yeast strains in terms of their ability to start growth in must. We propose several clues for yeast strains to adapt to the wine production conditions: the high expression of genes involved in both biosynthetic processes and glycerol biosynthesis and content. Moreover, we demonstrate the usefulness of pre-adaptation of wine yeast with problems at the beginning of the process introducing a certain percentage of glucose in the rehydratation media.

Pel resum en català vegeu lldresum1de1.pdf.Resum en anglèsChemical and computer graphics studies on the topography of the ribonuclease A active site cleft. A model of the enzyme pentanucleotide substrate complex The affinity labelling of bovine pancreatic ribonuclease A with 6-chloropurine 5' ribonucleotide allowed us to postulate the existence of a new phosphate-binding subsite, P2, adjacent to the main purine-binding subsite. The study of this reaction in greater detail together with the study of a complex of the enzyme with the pentanucleotide pApUpApApG by means of model building and computer graphics indicate that at least five phosphate groups of the RNA molecule can interact with five positive regions of the enzyme. In each one a lysine residue is present: Lys-104, -66, -41, -7 and -37 appear sequentially in the 5' - 3' direction. The distance between each lysine is 0.7-0.8 nm, the same distance as that found between the phosphate groups on the RNA molecule. The study also enabled many amino acid residues of the enzyme to be described as forming part of, or being near, the different binding subsites. Keywords: affinity labelling/computer graphics/enzyme/substrate complex/protein/nucleic acid interation/ribonuclease A.

Els gens homeòtics són els responsables del correcte desenvolupament dels organismes. A Drosophila, aquests gens es troben agrupats en dos clusters: el Complex Antenapèdia i el Complex Bitòrax (BX-C). El BX-C codifica per a tres gens homeòtics: l'Ultrabithorax, l'Abdominal A i l'Abdominal-B (Abd-B). L'expressió de l'Abd-B està conduïda per quatre dominis reguladors (iab-5 a iab-8) que controlen la seva expressió en els segments posteriors de l'organisme. En aquest treball, ens hem centrat en l'estudi dels elements reguladors que controlen l'expressió del l'Abd-B i en la contribució de les proteïnes dSAP18 i GAGA a la seva regulació.En primer lloc, assajos de digestió amb DNasaI realitzats a embrions de Drosophila ens han permès identificar diverses regions hipersensibles entre els dominis iab-5 i iab-6, suggerint l'existència de diversos elements reguladors en aquesta regió. Mitjançant un sistema en que el gen reporter white és control·lat pel seu propi promotor i enhancer, vam observar que la regió hipersensible més proximal promovia silenciament i Pairing-Sensitive Silencing (PSS) de l'expressió del gen reporter. Tant el silenciament com el PSS depenien de proteïnes del Grup Polycomb (Pc-G), indicant que aquesta regió actua com a un PRE (Polycomb Response Element). Hem anomenat aquesta regió iab6PRE.D'altra banda, hem observat que l'existència de regions lliures de nucleosomes als elements reguladors del BX-C és una característica molt conservada al llarg del desenvolupament de la mosca; també hi són presents a elements reguladors ectòpics i no depenen ni de l'estat transcripcional de la regió ni en el recrutament de proteïnes Pc i Trithorax (Trx) als PREs. No obstant, aquests llocs hipersensibles només estan presents a elements reguladors actius, ja que l'iniciador IAB6, que està implicat en la regulació del gen homèotic al principi del desenvolupament, mostra llocs lliures de nucleosomes a embrió, però no durant el desenvolupament larvari.Per tal d'analitzar l'organització nuclear del BX-C hem realitzat assajos de Chromosome Conformation Capture a cèl·lules S2 de Drosophila, que no expressen el gen Abd-B. Vam observar que l'element iab6PRE contacta amb el promotor del gen homeòtic així com amb d'altres elements de manteniment del complex, com l'MCP i el bxdPRE. L'element iniciador IAB6, en canvi, que es troba localitzat a només 5 Kb de l'iab6PRE, no interacciona amb cap d'aquests elements reguladors, suggerint que els elements de manteniment poden interaccionar a través de la formació de loops de cromatina.A més a més, hem vist que mosques mutants per a la proteïna dSAP18 mostren una disminució del silenciament conduït pels elements Fab-7 i iab7PRE en còpies ectòpiques; no obstant, aquesta disminució no és deguda ni a un canvi a les modificacions de les histones ni del patró de posicionament dels nucleosomes.Finalment, hem vist que una disminució de la quantitat de la proteïna GAGA mitjançant la inducció d'RNAs d'interferència a estadis tardans del desenvolupament larvari, promou la transformació homèotica del segment A6 a l'A5, suggerint una desregulació de l'expressió de l'Abd-B al segment A6. Aquesta desregulació indica que els patrons d'expressió establerts per les proteïnes Pc i Trx poden canviar al llarg del desenolupament de la mosca. No obstant, hem vist que la transformació tampoc és deguda a cap canvi en el patró d'hipersensibilitats a DNasaI ni a l'element Fab-7 ni a l'iab6PRE. / The homeotic genes are responsible for the correct development of the organisms. In Drosophila, these genes are clustered in two complexes: the Antenapedia Complex and the Bithorax Complex (BX-C). The BX-C encodes for three homeotic genes: Ultrabithorax, Abdominal-A and Abdominal-B (Abd-B). The expression of the Abd-B is driven by 4 regulatory domains (iab-5 to iab-8), which control its expression at the most posterior segments of the organism. In this work, we have focused on the study of the regulatory elements that control Abd-B expression and the contribution of the dSAP18 and GAGA proteins to its regulation.First of all, DNaseI digestion assays performed in Drosophila embryos have allowed us to identify some hypersensitive regions among iab-5 and iab-6 domains, suggesting the existence of several regulatory elements within this region. By means of a reporter gene system in which the white gene was controlled by its own promoter and enhancer, we observed that the most proximal hypersensitive region promotes silencing and Pairing-Sensitive Silencing (PSS) of the reporter gene expression. Both silencing and PSS depend on Polycomb Group (Pc-G) proteins, indicating that this region acts as a PRE (Polycomb Response Element). We have named this region iab6PRE.On the other hand, we have observed that the existence of nucleosome-free regions on regulatory elements of the BX-C is a very conserved feature along the fly development; they are also present in ectopic regulatory elements and they do not depend either on the transcriptional state of the region or on the Pc and Trithorax (Trx) recruitment to PREs. However, these hypersensitive sites are present only at active regulatory elements, since the iniciator IAB6, which is implicated in the homeotic gene regulation at the beginning of the development, shows nucleosome free regions at embryo state, but not later during larval development.In order to analyse the nuclear organization of the BX-C, we have done Chromosome Conformation Capture assays in Drosophila S2 cells, which don't express the Abd-B gene. We observed that the iab6PRE element contacts with the homeotic gene promoter as well as with other maintenance elements of the complex, such as the MCP and the bxdPRE. The iniciator element IAB6, on the other hand, which is just located 5 Kb far from the iab6PRE, does not interact with any of these regulatory elements, suggesting that the maintenance elements may interact through the formation of chromatin loops.Furthermore, we have seen that dSAP18 mutant flies show a decrease in the silencing driven by Fab-7 and iab7PRE elements in ectopic copies; however, this decrease is not due to any change either in histone modification or in nucleosome position patterns.Finally, we have observed that a decrease in the amount of GAGA protein by inducing interference RNAs at later stages of larval development, promotes a homeotic transformation of the A6 segment to A5, suggesting a misregulation of the Abd-B expression in the A6 segment. This misregulation indicates that the expression patterns established by Pc and Trx proteins may change along the fly development. However, we have seen that the transformation is not due to any change in the DNaseI hypersensitive pattern neither of the Fab-7 nor of the iab6PRE elements.

No description available.

Els factors de transcripció de Drosophila GAGA i Tramtrack (TTK) tenen en comú la presència d'un domini N-terminal de tipus POZ/BTB, un motiu estructural altament conservat present en factors de transcripció, proteïnes "kelch" i proteïnes de poxvirus que media interaccions proteïna-proteïna específiques. En algunes proteïnes, el domini POZ/BTB s'ha observat que participa en la formació d'homooligòmers i, basant-se en experiments de co-expressió in vitro, s'ha proposat que els dominis POZ/BTB també poden formar heterooligòmers. A més a més, en alguns factors de transcripció, el domini POZ/BTB s'ha demostrat que està involucrat en interaccions amb varis co-repressors i desacetilases d'histones. A la primera part d'aquest treball s'ha pogut demostrar que les isoformes GAGA519 i TTK69 interaccionen tant in vitro com in vivo, en llevats i en cèl.lules de Drosophila Schneider SL2, i que els seus dominis POZ/BTB són necessaris i suficients perquè aquesta interacció tingui lloc.Com molts promotors de Drosophila, la regió reguladora even-skipped (eve) stripe 2 conté alguns llocs d'unió per GAGA i TTK els quals estan relativament propers, suggerint que la interacció GAGA-TTK descrita podria participar en la seva regulació funcional. GAGA i TTK semblaria que tenen efectes oposats en la transcripció: l'expressió de molts gens de Drosophila està regulada positivament per GAGA i a més s'ha demostrat que GAGA actua com un activador transcripcional en condicions in vitro. Per altra banda, durant el desenvolupament embrionari primerenc, TTK actua com un repressor transcripcional d'alguns gens pair-rule, incloent-hi eve. Mitjançant experiments de transfecció transitòria en cèl.lules SL2 hem pogut demostrar que GAGA activa la transcripció del promotor eve stripe 2 i que TTK inhibeix aquesta activació mediada per GAGA. La repressió per TTK del promotor eve requereix de l'activació per GAGA i depèn de la presència d'ambdós dominis POZ de TTK i GAGA, suggerint que aquesta repressió és una conseqüència de la interacció GAGA-TTK.Interessantment, el domini POZ de TTK és capaç de reprimir per sí sol l'activació mediada per GAGA, mentre que la regió C-terminal de TTK, que conté la seqüència consens P-DLS d'unió al co-repressor dCtBP, no és necessària per una repressió eficient. Consistent amb això, la substitució del domini POZ de GAGA pel domini POZ de TTK aboleix per complet la capacitat transactivadora de GAGA i converteix la proteïna de fusió POZTTKDPOZGAGA en un repressor de l'activació de GAGA, un resultat que dóna suport a la consideració del domini POZ de TTK com un motiu repressor.Com els dominis POZ dels factors de transcripció PLZF i Bcl-6 reprimeixen la transcripció per un reclutament de desacetilases, es va testar aquesta possibilitat pel domini POZ de TTK. Per aquesta raó, es varen realitzar assajos transcripcionals a cèl.lules SL2 en presència de TSA, un inhibidor de les desacetilases de classe I i II. Els resultats obtinguts indiquen que la repressió de TTK sobre l'activació mediada per GAGA no involucra un reclutament de desacetilases al promotor, ja que la presència de TSA no té cap efecte sobre l'activitat de TTK. No obstant, no es pot descartar la possibilitat que la repressió per TTK pogués estar mediada per desacetilases insensibles a TSA.Utilitzant delecions del promotor eve stripe 2, s'ha observat que la repressió per TTK pot tenir lloc en absència de llocs d'unió per TTK al promotor, indicant que aquesta repressió no requereix unió directa de TTK al DNA. Amb aquesta observació ens vàrem plantejar si TTK pot interferir en la unió de GAGA al DNA, per la qual cosa vàrem realitzar assajos in vitro EMSA i de footprinting amb DNasa I utilitzant un fragment eve sense llocs d'unió per TTK emprant proteïnes recombinants GAGA i TTK. Els resultats obtinguts mostren que TTK no interfereix en la unió de GAGA al DNA.; contràriament, els complexes GAGA-TTK semblen tenir una major afinitat d'unió al DNA.En resum, aquestes observacions suggereixen un model en el qual la repressió per TTK de l'activació mediada per GAGA implica una interacció directa GAGA-TTK la qual facilita el reclutament de TTK al promotor. No obstant, els nostres resultats no permeten diferenciar si la repressió per TTK és conseqüència d'una interferència en l'activació mediada per GAGA o a un reclutament actiu de co-repressors. / The Drosophila transcription factors GAGA and TTK share in common the presence of a N-terminal POZ/BTB-domain, a highly conserved structural motif present in transcription factors, kelch proteins and poxviruses proteins that mediates specific protein-protein interactions. In several proteins, the POZ/BTB-domain has been found to participate in the formation of homo-oligomers and, based on in vitro co-expression experiments, it has been proposed that POZ/BTB-domains can also form hetero-oligomers. In addition, in several transcription factors, the POZ/BTB-domain has been shown to be involved in interactions with various co-repressor proteins and HDACs. In the first part of this work, we have demonstrated that GAGA519 and TTK69 isoforms interact in vitro as well as in vivo, both in yeast and Schneider S2 cells, and that their POZ/BTB-domains are necessary and sufficient for this interaction to occur. As many Drosophila promoters, the even-skipped (eve) stripe 2 regulatory region contains several binding sites for GAGA and TTK which are in relatively close proximity, suggesting that the GAGA-TTK interaction described might participate in its functional regulation. GAGA and TTK appear to have opposite effects on transcription: the expression of many genes in Drosophila is positively regulated by GAGA and it has been shown that GAGA acts as a transcription activator in vitro. On the other hand, during early embryo development, TTK was shown to function as a transcription repressor of several pair-rule genes, including eve. Based on transient expression experiments in SL2 cells we have shown that GAGA activates transcription from the eve stripe 2 promoter and that TTK inhibits this GAGA-dependent activation. Repression by TTK of the eve promoter requires its activation by GAGA and depends on the presence of the POZ/BTB-domains of TTK and GAGA, suggesting that this repression is a consequence of GAGA-TTK interaction.Interestingly, the POZ domain of TTK appears to be able to repress GAGA-mediated activation, while the C-terminal region of TTK, that contains the P-DLS consensus sequence for dCtBP corepressor binding, is not necessary for an efficient repression. Consistent with this, the substitution of the POZ domain of GAGA by the POZ domain of TTK fully abolishes the transactivation activity of GAGA and converts the fusion protein POZTTKDPOZGAGA in a repressor of GAGA-activation. This result argues in favour of the repression activity of the POZ domain of TTK.As the POZ domains of PLZF and Bcl-6 transcription factors repress transcription by recruiting HDACs to the promoter, we tested this possibility for the POZ domain of TTK. For this reason, we have performed transfection assays in the presence of TSA, an inhibitor of HDACs class I and II. The results obtained indicated that TTK repression of GAGA-mediated activation doesn't involve recruitment of HDACs to the promoter, since the presence of TSA hasn't any effect in TTK activity. However, we can't discard the possibility that TTK repression should be mediated by HDACs insensitive to TSA.Using deletions of the eve stripe 2 promoter, we have observed that TTK repression could take place in the absence of TTK-binding sites in the promoter, indicating that TTK repression doesn't require direct binding of TTK to DNA. Then, we asked if TTK could interfere in GAGA-binding to DNA, so we performed in vitro EMSA and DNase I footprinting assays using an eve fragment without TTK binding sites and recombinant GAGA and TTK. The results obtained have shown that TTK doesn't interfere in the binding of GAGA to DNA.; on the contrary, GAGA-TTK complexes appear to have a higher affinity to bind DNA.In summary, these observations suggest a model in which TTK repression of GAGA-mediated activation involves a direct interaction of GAGA and TTK that facilitates TTK recruitment to the promoter. However, our results don't allow to differentiate if TTK repression is a consequence of an interference of GAGA-dependent activation or an active recruitment of co-repressors.

El centròmer és una estructura especialitzada del cromosoma que té un paper fonamental en la correcta segregació cromosòmica durant la mitosi i la meiosi. Tot i que les histones es troben entre les proteïnes més conservades, una característica de la cromatina centromèrica és la presència d'una variant de la histona H3: CENP-A, la qual substitueix en els nucleosomes la histona H3 canònica tant in vitro com in vivo. Les variants centromèriques de la histona H3 (CenH3) es caracteritzen per tenir un domini C-terminal amb plegament tipus histona molt conservat i, en canvi, un extrem N-terminal que no mostra cap homologia significativa entre si, ni en tamany ni en seqüència.Es creu que CENP-A és el determinant epigenètic de la identitat centromèrica, sent la seva presència necessària per l'ensamblatge del cinetocor i per una correcta segregació cromosòmica. Ara bé, encara es coneix ben poc sobre el mecanisme pel qual CENP-A es localitza exclusivament als centròmers. Només es sap que la seva localització centromèrica requereix la presència de la regió L1/?2 del domini C-terminal i que la seva deposició és independent de replicació.En aquest treball mostrem com un mecanisme de degradació via proteosoma ajuda a la localització centromèrica de Cid, la variant de Drosophila melanogaster. Al sobreexpressar Cid sota el control del seu propi promotor, mitjançant transfeccions transients en cèl·lules Kc, s'observa com Cid és capaç de depositar-se al llarg de tota la cromatina. Ara bé, a mesura que avança el cultiu, aquesta localització es restringeix al centròmer. Assajos amb inhibidors del proteosoma i anàlisis de localització de Cid a mosques que presenten mutacions en subunitats del proteosoma, suggereixen l'existència, tant in vitro com in vivo, d'un mecanisme de degradació proteolítica que estaria regulant els nivells de Cid. Aquest procés deu ser necessari per tal que tingui lloc una correcta divisió ja que hem pogut observar que la majoria de cèl·lules amb Cid deslocalitzada estan aturades a G2 i presenten problemes de segregació cromosòmica. / The centromere is a specialized structure of the chromosome that plays a key role in the process of chromosome segregation during mitosis and meiosis. Although the histones are one of the most conserved proteins, one characteristic of the centromeric chromatin is the presence of a specific histone H3 variant: CENP-A, which replaces canonical histone H3 in nucleosomes, both in vitro and in vivo. The centromeric histone H3 variants have a well conserved histone fold domain and, in contrast, an N-terminal domain without any significant homology between them, neither in length nor in sequence.CENP-A appears to dictate centromere identity, being required for the kinetochore formation and for correct chromosome segregation. However, the precise molecular mechanisms accounting for the specific deposition of CENP-A at centromeres are not well understood. It is known that targeting to centromeres is mediated by the L1/?2 region of the histone fold domain and that its deposition is not linked to replication.In this work we show how a process of proteasome mediated degradation contributes to the centromeric localization of Cid, the histone variant of Drosophila melanogaster. Expressing Cid under the control of his own promoter, using transient transfections in Kc cells, can be observed how Cid is mislocalized along the chromatin. However, as cell culture progress, its localization is restricted to the centromere. Assays in the presence of proteasome inhibitors and studies of Cid's localization in Drosophila proteasome mutants suggest the existence, both in vitro and in vivo, of a proteolytic mechanism that regulates available Cid levels. This process seems to be required for a correct cell division since we have observed that cells showing mislocalized Cid are arrested in G2 and have strong segregation defects.

En este trabajo se han obtenido múltiples secuencias de dominios relevantes de los dos tipos de retrotranspones (RTN) con LTR: Ty1-copia y Ty3-gipsy, mediante amplificación por PCR con cebadores degenerados del DNA genómico de Citrus sinensis (naranjo dulce) de la variedad "Valencia late". Del análisis de las secuencias obtenidas se han podido identificar, en base a estudios filogenéticos, 7 familias de tipo copia (CIRE1-CIRE7) y 6 familias de gipsy (GySiA-GySiF) diferentes. Por reconstrucción genómica se ha estimado en 10.000 y 5.000 el número total de RTN tipo copia y gipsy, respectivamente, presentes en el genoma haploide del naranjo, los cuales ocuparían alrededor del 23% del genoma de C. sinensis.Se ha determinado la secuencia entera de un nuevo RTN copia CIRE1 (de aproximadamente 5 kb y con 2 LTR de alrededor de 460 pb), a partir de una secuencia parcial de la región de la transcriptasa inversa, combinando PCR inversa y PCR directa sobre DNA genómico. Este elemento (Nº Acc.: AM040263) presenta una pauta de lectura sin interrupciones por codones parada y la traducción conceptual a aminoácidos se realiza sin ningún cambio de pauta de lectura. Los motivos estructurales y funcionales están conservados comparando su secuencia con otros RTN copia caracterizados. CIRE1 representa el 2,9% del genoma del naranjo con aproximadamente 2.200 copias por genoma haploide. Se concluye que la mayoría de las copias de CIRE1 en C. sinensis están completas. Se ha descartado también una presencia significativamente importante de solo-LTR de CIRE1. Se ha comprobado, por PCR específica y Southern blot, que CIRE1 está presente en diferentes especies de cítricos así como en otras rutáceas como Fortunilla o Poncirus, sugiriendo que el RTN estaba presente en estadios tempranos de la especiación de la familia Rutaceae. En cambio, CIRE1 no se ha detectado en otras especies de monocotiledóneas o dicotiledóneas fuera de las rutáceas. La secuencia de la LTR5' de CIRE1 presenta cajas típicas de los promotores eucariotas, así como hipotéticos elementos reguladores, entre ellos motivos descritos de respuesta a auxinas, ácido jasmónico y asociados a la expresión específica en raíz. La LTR5' de CIRE1 es capaz de dirigir la actividad GUS en experimentos de transformación de sistemas heterólogos, asimismo se observa un incremento de la actividad GUS al aplicar exógenamente la auxina ácido naftalenacético (NAA). Además, CIRE1 es activo transcripcionalmente. En condiciones normales, se detectan transcritos de CIRE1 en raíz aunque no en hoja. El nivel de transcritos se incrementa considerablemente en el tejido foliar en respuesta a herida y tras la adición de las fitohormonas ácido jasmónico y naftalenacético. Por otra parte, el estudio de los RTN copia en diez especies del género Citrus y tres especies de géneros próximos de la familia Rutaceae, revela 7 nuevas familias (CIRE8-CIRE14), además de las 7 ya descritas en C. sinensis. Parte de estas secuencias han sido depositadas en la base de datos del EMBL (Nº acc.: AM117724-AM117758). Se concluye que el ancestro común de estas especies vegetales contenía ya una población heterogénea de RTN copia que se expandieron y diversificaron antes de la separación del género Citrus. Por otra parte, se ha estimado el número de elementos copia en dichas especies en el rango de 4.000 - 15.000 copias por genoma haploide, llegando a representar cerca del 22% del genoma en C. clementina. Asimismo, se ha puesto a punto la técnica de SSAP (Polimorfismo de Amplificación Específica de Secuencia) con una secuencia de la LTR de CIRE1 en cítricos. Nuestros resultados muestran polimorfismos entre las trece especies del estudio y los árboles filogenéticos derivados reflejan bien las taxonomías ya publicadas del género basadas en otros marcadores moleculares como RFLP o RAPDs. La técnica SSAP también se ha aplicado para la detección de polimorfismos de inserción de CIRE1 in planta, mostrando patrones de bandas SSAP diferentes en hoja y raíz, sugiriendo mayor transposición de CIRE1 en raíz. / We performed an analysis of Ty1-"copia" retrotransposons (RTN) of different commercial citrus species genome. Sequences from "copia"-like RTN have been cloned by PCR amplification using degenerate primers corresponding to the reverse transcriptase (RT) domain for copia [Data deposited as: EMBL accession numbers AM117724-AM117758]. Phylogenetic analysis revealed lack of concordance between phylogenetic tree obtained from RT sequences and taxonomic tree suggesting that different families of Ty1-"copia" existed before "Citrus" speciation. In fact, these elements could be divided into fourteen different families (CIRE1-CIRE14) by their RT similarity. Copy number determination also revealed that copia elements are so abundant throughout the "Citrus" genus, representing around a 22% of the genome in "C.clementina". Particularly, total LTR-RTN represent approximately 23% of the "C.sinensis" (sweet orange) genome, and "copia" (13%) are more abundant than gypsy ones (10%). "Copia" and "Gypsy" elements were divided into seven (CIRE1-CIRE7) and six (GySiA-GySiF) different families, respectively, in this specie. At least, three transcriptionally active copia families were detected by RT-PCR in roots of healthy sweet orange plants but not in leaves. Furthermore, both wounding and some hormones treatment could induce the expression of CIRE1 RTN in leaves. Moreover, complete sequence of CIRE1, which is 5 kb long and has all the features typical of a "copia"-like RTN, has been determined [EMBL accession number AM040263]. CIRE1 elements are conserved in length and have an LTR:internal domain ratio of about 2:1. On average CIRE1 contributes 2.200 full length copies, amounting to 2.9% of the "C. Sinensis" genome and representing 22% of total "copia" group. Furthermore, the LTR5' of CIRE1 can promote the expression of translational LTR-GUS fusion in transient expression assays and preliminary analysis of CIRE1 mobility by SSAP strategy suggest a possible transposition activity in roots.On the other hand, CIRE1 was used to develop retrotransposon-based molecular markers using the technique sequence-specific amplification polymorphism (SSAP), in order to asses biodiversity within "Citrus" and related genera as "Poncirus", "Fortunella" and "Microcitrus". SSAP polymorphic bands have been already observed among thirteen DNA accessions corresponding to those genera. The SSAP markers were used for phylogenetic studies among citrus species, well reflecting the established species phylogeny.

Les farnesildifosfat sintases (FPS) catalitzen la condensació de dues molècules d'isopentenildifosfat (IPP) amb una molècula de dimetilal.lildifosfat (DMAPP) per produir farnesildifosfat (FPP; C15). Tant els substrats com el producte de la reacció catalitzada per les FPS ocupen una posició molt important en la via del mevalonat de síntesi d'isoprenoides, ja que són punt de partida de nombroses ramificacions cap a la síntesi de diversos productes finals. A Arabidopsis thaliana existeix una petita família multigènica integrada pels gens FPS1 i FPS2, que codifiquen tres isoenzims FPS: FPS1S, FPS1L i FPS2. L'isoenzim FPS1L conté un pèptid de trànsit que li confereix una localització mitocondrial, mentre que FPS1S i previsiblement FPS2, tenen una localització citosòlica. A l'inici d'aquest treball, s'havien clonat els gens FPS1 i FPS2, i s'havien definit els seus patrons d'expressió espaial i temporal mitjançant l'anàlisi de plantes transgèniques portadores de gens quimèrics formats pels promotors d'ambdós gens fusionats al gen reporter uidA d'E. Coli. També s'havia estudiat el paper dels isoenzims FPS1S i FPS1L en la via del mevalonat a través de la caracterització de plantes transgèniques que sobreexpressaven aquests isoenzims. La localització de l'isoenzim FPS1L a les mitocòndries ja és, en sí mateixa, una evidència d'especialització funcional. En el cas dels isoenzims FPS1S i FPS2, el fet de pensar en l'existència d'una especialització funcional deriva dels seus patrons d'expressió diferencials.Amb l'objectiu d'analitzar el paper de l'isoenzim FPS2 en la via del mevalonat, i obtenir evidències de l'especialització funcional dels isoenzims FPS1S i FPS2, en aquesta tesi es duen a terme diferents abordatges experimentals basats en l'obtenció i caracterització de mutants d'A. Thaliana amb guany i pèrdua de funció dels gens FPS1 i FPS2. Per una banda, mitjançant l'estudi dels efectes de la sobreexpressió de l'isoenzim FPS2 i de la sobreexpressió simultània dels isoenzims FPS1S i FPS2. D'altra banda, a través de l'anàlisi de mutants amb pèrdua de funció dels gens FPS1 i FPS2 i del doble mutant fps1:fps2. Aquests abordatges es complementen amb l'estudi dels efectes de la sobreexpressió en A. Thaliana de proteïnes quimèriques FPS1S/FPS2 (domain swapping), l'elaboració de models estructurals tridimensionals dels isoenzims FPS1S i FPS2 i l'anàlisi dels perfils d'expressió gènica en mutants amb pèrdua de funció dels isoenzims FPS.En aquest treball es demostra que els isoenzims FPS1S i FPS2, tot i catalitzar la síntesi del mateix producte, tenir la mateixa localització subcel.lular i uns paràmetres cinètics similars, produeixen efectes molt diferents quan són sobreexpressats en A. thaliana. La presència d'un únic isoenzim FPS és suficient per garantir la viabilitat de les plantes, ara bé, la pèrdua de funció de l'isoenzim FPS2 desencadena una resposta metabòlica compensatòria a les llavors. En conjunt, tots els resultats indiquen que els isoenzims citosòlics FPS1S i FPS2 desenvolupen funcions majoritàriament redundants, tot i que presenten una certa especialització funcional que sembla derivar del patró d'expressió especialitzat de cadascun dels gens FPS. / Farnesyldiphosphate synthases (FPS) catalyze the condensation of two molecules of isopentenyldiphosphate (IPP) with its isomer dimethylallyldiphosphate (DMAPP) to produce farnesyldiphosphate (FPP; C15). FPS is located at a key position in the mevalonic acid pathway (MVA), as both the substrates and the reaction product are precursors of a variety of isoprenoid end-products. Arabidopsis thaliana contains a small FPS gene family consisting of two genes, FPS1 and FPS2, encoding three FPS isoforms: FPS1S, FPS1L and FPS2. FPS1L isoform is located in the mitochondria, whereas FPS1S and likely FPS2, are both localized in the cytosol. The differential patterns of expression of FPS1 and FPS2, strongly suggest a functional specialization of the encoded FPS1S and FPS2 isoforms.The aim of this thesis is to analyze the role of FPS2 isozyme in the MVA pathway and to obtain evidence of a functional specialization of FPS1S and FPS2 isozymes. Different experimental approaches have been undertaken using A. thaliana mutants with gain and loss of function of FPS1S and FPS2. We have investigated the effects of FPS2 overexpression and the effects of the overexpression of both FPS isozymes simultaneously. We have also characterized A. thaliana knock-out mutants in both FPS genes and the double knock-out mutant fps1:fps2. Analysis of the effects caused by the overexpression of chimeric FPS1S/FPS2 proteins in A. thaliana, 3D modelling of FPS isozymes, and microarray analysis of FPS knock-out mutants are also included in this study.Results demonstrate that, although FPS1S and FPS2 isozymes synthesize the same reaction product, have the same subcellular localization and have similar kinetic parameters, its overexpression produce different effects in A. thaliana. The existence of a single FPS isozyme is enough to assure plant viability. However, FPS2 loss of function triggers a compensatory metabolic response in A. thaliana seeds. All these results indicate that FPS1S and FPS2 play redundant functions in the MVA pathway, although they also show a certain level of functional specialization.