[EN] Citrus is a diverse genus within the Aurantioideae subfamily that comprises an undetermined number of pure species natively found in a vast territory extending from India to Japan and Australia. Besides pure species, countless citrus admixtures of commercial interest such as mandarins, oranges and lemons have been traditionally included in this genus, even though they are the product of several interspecific crosses between pure species. Recently, a genome-wide analysis provided the backbone of the Citrus phylogeny, showing that the wild species diverged from an ancestral citrus in a rapid radiation during the Late Miocene. Understanding the processes that shaped the evolution and domestication of the genus will provide novel insights in the field of plant genome evolution. In this doctoral thesis, multiple genomic approaches have been used to expand the existing knowledge on major determinants driving the processes of evolution, diversification and domestication in Citrus. First, a genome-wide Aurantioideae phylogeny was generated, revealing the existence of several independent dispersal events in this subfamily in the last 10 million years, from Asia to Africa and Australia, and rooting the Citrus genus within this subfamily. The Citrus phylogeny was then studied under the multispecies coalescent model, which can capture the variability generated during fast radiations. The dating of the speciation events allowed to advance original proposals on the paleogeographic events triggering the migration of the Citrus species through the South East Asian region. The Citrus radiation generated the great genetic and phenotypic diversity found in this genus. To investigate the effects of the Late Miocene climate change on the genomic structure of the Citrus pure species, the activity and evolution of retrotransposons, which can significantly alter the genome of their hosts, was analyzed. Most of the Citrus retrotransposon families are shared with Severinia buxifolia, an Aurantioideae species that diverged from Citrus more than 10 million years ago, implying that few retrotransposon families are specific to the genus Citrus. However, estimations of the retrotransposon insertion rates within Citrus revealed that, shortly after the radiation, the transposon activity rapidly changed among the different species. Hence, the data indicates that retrotransposon dynamics are linked to the stress caused by the Late Miocene climate change and the Citrus speciation, although specific responses likely depend on the particular evolutionary history of each species. The differences of gene expression in fruits of domesticated and wild cultivars were then studied to understand the role of interspecific hybridizations during Citrus domestication. The results presented suggest that these events, together with asexual propagation, were key for the domestication process. Different mechanisms explaining commercially relevant Citrus traits are also proposed. For example, pulp acidity in citrons and lemons is linked to an increased proton influx to the pulp vacuoles. The data also indicate that the peel pigmentation might be controlled by the additive effect of several minor genes, and not by a single gene or mechanism. Finally, an allele-dependent expression pattern of a chalcone synthase, involved in the flavonoid biosynthesis, advocates for the existence of a stepwise evolution in the mandarin flavonoid accumulation. All in all, the transcriptomic approach used in this work allowed to generate broader hypotheses that stand from a genus-wide perspective. Overall, the results provide a comprehensive framework of Citrus phylogenetic relationships, the effect of the mobile elements during its diversification and the role of interspecific hybridizations in the citrus domestication. The insights here exposed reveal the inherent complexity of the evolutionary history of this fascinating genus. / [ES] El género Citrus (Aurantioideae) abarca un número desconocido de especies puras, nativas en buena parte del sudeste asiático y Oceanía. Muchas variedades comerciales, como mandarinas o naranjas, también forman parte de este género. Recientemente, la estructura de la filogenia del género Citrus ha sido publicada en un estudio el que se propone que los cítricos actuales surgieron en un proceso de radiación rápida durante el Mioceno tardío, hace 8 millones de años. Una mejor comprensión de los procesos involucrados en la evolución y posterior domesticación del género Citrus proporcionaría nuevas perspectivas en el ámbito de la genómica de plantas. En esta Tesis Doctoral se han empleado diversas estrategias genómicas para ampliar el conocimiento existente sobre los procesos implicados en la evolución, diversificación y domesticación de los cítricos. En primer lugar, se generó un árbol filogenético de las Aurantioideae, anclando el género Citrus dentro esta subfamilia. Esta filogenia reveló varios eventos de dispersión entre estas especies, generalmente desde Asia hacia África u Oceanía. Después, se estudió la filogenia del género Citrus empleando el modelo coalescente de multiespecie, que refleja la variabilidad inherente a los procesos de radiación. La datación de los distintos eventos de especiación ha permitido hacer nuevas propuestas sobre la paleogeografía y su papel en la distribución actual de los cítricos a lo largo del sudeste asiático. Para investigar los efectos del cambio climático del Mioceno tardío en el genoma de los cítricos, se analizó la actividad y la evolución de los retrotransposones como fuente de variabilidad genética en distintas especies de cítricos. Muchos de los retrotransposones de los cítricos también se encuentran en Severinia¿ un género de las aurantioideas que divergió del ancestro de los cítricos hace 10 millones de años, sugiriendo que pocos de los retrotransposones de cítricos son exclusivos de este género. En cambio, las tasas de inserción de retrotransposones en cítricos revelaron que la actividad de estos elementos cambió drásticamente entre especies poco después de la radiación de los cítricos. Por tanto, es posible que dicha actividad esté ligada al estrés climático durante el Mioceno tardío, así como a la especiación de los cítricos, aunque también parece verse afectada por las condiciones evolutivas particulares de las especies estudiadas. Por último, se estudiaron las diferencias en la expresión génica entre variedades domesticadas y especies salvajes para conocer el papel de las hibridaciones interespecíficas en la domesticación de los cítricos. Los resultados obtenidos sugieren que dichas hibridaciones, junto a la propagación clonal, fueron clave para el proceso de domesticación. Estos resultados también permiten proponer un mecanismo que explica la acidez de la pulpa de cidros y limones basado en el flujo de protones al lumen vacuolar. Los datos también parecen indicar que el color de los cítricos no depende de un único gen, sino que depende del efecto aditivo de varios genes en conjunto. Finalmente, se descubrió una copia del gen de la chalcona sintasa, necesario para la síntesis de flavonoides, que tan solo se expresa en mandarinas y variedades derivadas, lo que sugiere que la acumulación de flavonoides en estas variedades proviene de un proceso evolutivo escalonado. La obtención de estos resultados fue posible gracias a la estrategia de análisis transcriptómico escogida, que abarca varias especies del género Citrus. En conclusión, los resultados presentados en este trabajo aportan un marco de trabajo global en la filogenia del género Citrus, además de realizar nuevas propuestas sobre el efecto de los elementos móviles en la diversificación de los cítricos y el papel de las hibridaciones interespecíficas durante su domesticación. Los datos presentados en este trabajo revelan la compl / [CAT] El gènere Citrus (Aurantioideae) comprèn un nombre desconegut d'espècies pures, natives en un ampli territori que s'estén pel sud-est asiàtic i Oceania. Un gran nombre de varietats comercials de cítrics, com mandarines, taronges o llimes, també s'inclouen dins del gènere Citrus. L'estructura bàsica de la filogènia del gènere Citrus ha sigut publicada recentment, a un estudi al que es proposa que els cítrics actuals sorgiren en un procés de radiació ràpida que va tindre lloc en el Miocè superior, fa 8 milions d'anys. Una millor comprensió dels processos involucrats en l'evolució i posterior domesticació del gènere Citrus podria proporcionar noves perspectives dins de l'àmbit de l'evolució del genoma de plantes. Al llarg d'aquesta Tesi Doctoral s'han emprat diverses estratègies genòmiques per a ampliar el coneixement existent sobre els processos que van dirigir l'evolució, diversificació i domesticació dels cítrics. En primer lloc, es va generar una filogènia de les aurantioideas, ancorant el gènere Citrus dins d'aquesta subfamília. Esta filogènia va revelar l'existència de diversos esdeveniments de dispersió en estes espècies, generalment des d'Àsia cap a Àfrica o Oceania. Després, la filogènia dels cítrics es va estudiar emprant el model evolutiu coalescent multiespècie, que reflecteix la variabilitat inherent als processos de radiació ràpida. La datació de la especiació dels cítrics han permès fer noves propostes sobre la paleografia i el seu paper en la distribució actual dels cítrics per tot el sud-est asiàtic. Per a investigar els efectes del canvi climàtic ocorregut durant el Miocè superior en l'estructura genòmica dels cítrics, s'analitzà l'activitat i evolució dels retrotransposons com a font de variabilitat genètica en distintes espècies de cítrics. La majoria dels retrotransposons dels cítrics també es troben en Severinia¿ un gènere de les aurantioidees que va divergir de l'avantpassat dels cítrics fa 10 milions d'anys, la qual cosa suggereix que tan sols unes poques famílies de retrotransposons son exclusives dels cítrics. En canvi, l'estimació de les taxes d'inserció dels retrotransposons revela que l'activitat d'aquests elements va patir canvis dràstics entre espècies poc després de la radiació dels cítrics. Per tant, l'esmenada activitat podria estar lligada a l'estrès climàtic de finals del Miocé, així com a l'especiació dels cítrics, encara que també sembla veure's afectada per les condicions evolutives particulars de cada espècie. Finalment, es van estudiar les diferències a l'expressió gènica entre varietats domesticades i espècies salvatges per a conèixer el paper de les hibridacions interespecífiques en el procés de domesticació dels cítrics. Els resultats suggereixen que aquestes hibridacions, junt a la propagació clonal de les varietats de interès, foren clau en la domesticació. Els resultats també han permès proposar un mecanisme que explica l'acidesa de la polpa de poncems i llimes basat en el flux de protons al lumen vacuolar. D'altra banda, el color dels cítrics no pareix dependre d'un únic gen, sinó de l'efecte additiu de diversos gens en conjunt. Finalment, s'ha trobat una còpia del gen de la chalcona sintasa, necessària per a la síntesi de flavonoides, que tan sols s'expressa en mandarines i varietats derivades, suggerint que l'acumulació de flavonoides en aquestes varietats és el resultat d'un procés evolutiu escalonat. L'obtenció d'aquests resultats fou possible gràcies a l'estratègia d'anàlisi escollida, que inclou diverses espècies del gènere Citrus. En conclusió, els resultats presentats en aquest treball aporten un marc de treball global a la filogènia dels cítrics, a banda de permetre realitzar noves propostes sobre el efecte dels elements mòbils en la diversificació dels cítrics i el paper de les hibridacions interespecífiques durant la seua domesticació. Les dades presenta / Borredá Fernández, C. (2021). A genomic approach to the evolution, diversification and domestication of the genus Citrus [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/176003 / TESIS

En la biología de sistemas, una ruta biológica representa una secuencia de reacciones o interacciones entre un grupo de genes expresados que participan en un proceso biológico. Durante la última década, el análisis de las rutas biológicas se ha convertido en una estrategia clave para la comprensión de los significados biológicos de experimentos de alto rendimiento sobre un grupo de genes. Detrás de la idea del análisis de estas rutas existe el supuesto de que, para muchos fenómenos celulares complejos, resulta muy difícil encontrar una explicación mediante estudios que sólo se centran en una mirada al nivel de los genes. En particular esta tesis se centra en la investigación de técnicas de análisis de diafonía (cross-talk) entre rutas biológicas (pathways), enriqueciendo esta información por datos de experimentos de microarray mediante biclustering. De esta forma, se busca proveer una metodología bioinformática que identifique relaciones entre rutas biológicas y las explique, proporcionando información útil para asistir a expertos en biología molecular. Para cumplir este objetivo se desarrollaron métodos computacionales para el análisis tanto topológico como de enriquecimiento a nivel de rutas biológicas. Una de las herramientas desarrolladas, BAT(Gallo, Dussaut, Carballido, & Ponzoni, 2010), plantea la ejecución del algoritmo BiHEA(Gallo, Carballido, & Ponzoni, 2009), que realiza biclustering sobre los datos. Esto permite la identificación de grupos de genes co-expresados bajo ciertos subconjuntos de condiciones experimentales. Esta herramienta es utilizada en conjunto con otra, denominada PET, diseñada para utilizar datos topológicos relevantes a nivel de genes y proyectarlos a nivel de rutas biológicas para una mejor comprensión de los mecanismos de señalización que coordinan distintos procesos celulares. Se estudiaron y validaron estos métodos con datos de la enfermedad de Alzheimer, contrastando los resultados con los obtenidos por otros métodos publicados recientemente. De este modo, se puso en evidencia la relevancia de combinar técnicas de análisis topológico con enriquecimiento basado en datos de expresión y detección de sincronización entre rutas biológicas mediante el uso de métodos de biclustering como una estrategia integral para la identificación de diafonía entre procesos biológicos. / In systems biology, a pathway represents a sequence of reactions or interactions between a group of expressed genes involved in a biological process. During the last decade, the analysis of biological pathways has become a key strategy for the understanding of biological meanings in high throughput experiments on a group of genes. Behind the idea of the analysis of these pathways there is the assumption that, for many complex cellular phenomena, it is very difficult to find an explanation through studies that focus only at a gene level. In particular, this thesis focuses on the investigation of cross-talk analysis techniques between biological pathways, also enriching this information by microarray experiments data usingbiclustering. By means of this combination, the idea is to count with a bioinformatics approach that identifies and explains relationships between biological pathways thus providing useful information to assist experts in molecular biology information. To meet this objective, computational methods for analysis of biological pathways, including enrichment analysis, and analysis at a topological level,has been developed. One of the tools developed, BAT (Gallo, Dussaut, Carballido, & Ponzoni, 2010)raises the algorithm execution BiHEA (Gallo, Carballido, & Ponzoni, 2009), which is a biclustering multi-objective algorithm. This allows the identification of clusters of co-expressed subsets of genes under certain experimental conditions. This tool is used in conjunction with other, called PET, designed to use topological data relevant at gene level and project biological pathways for better understanding of the signaling mechanisms that coordinate various cellular processes. We studied these methods and validated them with data from Alzheimer's disease, contrasting results with those of other recently published methods. Thus, is highlighted the importance of combining topological analysis techniques with enrichment expression data based on detection and synchronization between biological pathways using methods of biclustering as a comprehensive strategy for identifying crosstalk between biological processes.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-09-01T11:35:24Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1224162 bytes, checksum: ffa39059159020ac910ed3e05b3cfdbc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T11:35:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1224162 bytes, checksum: ffa39059159020ac910ed3e05b3cfdbc (MD5) Previous issue date: 2016-12-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nesta tese, os dados do sequenciamento do genoma da variedade de cana-de-açúcar RB867515 e de outros 508 genótipos provenientes de 100 famílias de meios-irmãos são analisados com os seguintes objetivos: (I) montar as sequências dos genomas nuclear, cloroplastidial e mitocondrial da variedade RB867515; (II) predizer e anotar funcionalmente os genes e demais elementos presentes nas sequências obtidas; (III) analisar os polimorfismos de nucleotídeo único presentes nos genomas dos genótipos de cana-de-açúcar; (IV) associar os polimorfismos identificados com as características fenotípicas dos genótipos usando estudos de associação ampla do genoma; (V) criar um banco de dados integrando as sequências, os polimorfismos e as informações funcionais obtidas. As bibliotecas genômicas foram sequenciadas usando as tecnologias de sequenciamento de nova geração da Illumina e as sequências obtidas foram trimadas e selecionadas, produzindo um conjunto de dados contendo 1,39 bilhões de sequências da variedade RB867515 e 2,43 bilhões de sequências dos genótipos. As sequências dos genomas nuclear, cloroplastidial e mitocondrial da variedade RB867515 foram montadas usando algoritmos de montagem De Novo e estratégias baseadas em genomas de referência. Os genes foram identificados usando métodos ab initio e empíricos, e as informações funcionais foram preditas a partir de pesquisas de similaridade. Na genotipagem, as sequências dos genótipos foram mapeadas no genoma da variedade RB867515 e os polimorfismos de nucleotídeo único foram identificados seguindo os métodos recomendados para a descoberta de variantes a partir de dados de sequenciamento de nova geração. No estudo de associação ampla do genoma, a associação dos polimorfismos com as características fenotípicas dos genótipos foi avaliada usando o método enriched compressed mixed linear model (ECMLM). O genoma nuclear da variedade RB867515 foi montado em 484.719 sequências com um tamanho total de 552,97 megabases (Mb), sendo preditos 75.715 genes codificadores de proteínas. Esses genes foram funcionalmente anotados e as suas proteínas foram classificadas em diferentes grupos funcionais. A análise dos polimorfismos identificou 40.663 loci contendo polimorfismos de nucleotídeo único em 7.890 genes e apenas um polimorfismo no gene da enzima isocitrato desidrogenase apresentou associação significativa com a característica fenotípica conteúdo de sacarose na cana em percentagem (PC) no estudo de associação ampla de genoma. O genoma cloroplastidial da RB867515 foi montado em uma única sequência contendo 141,18Kb, sendo identificados 88 genes codificadores de proteínas, 8 genes de rRNA e 39 genes de tRNA. A sequência desse genoma é idêntica ao genoma da variedade de cana-de-açúcar Q155, originária da Austrália. A análise dos polimorfismos mostrou que apenas oito genótipos incluídos na família da variedade RB982639 (g011, g030, g031, g094, g103, g246, g425 e g441) apresentam polimorfismos em suas sequências. Esses polimorfismos estão localizados em regiões intergênicas do genoma e nos genes petB e ndhF. O genoma mitocondrial da variedade RB867515 foi montado em dois segmentos subgenômicos circulares com um tamanho total de 445,52Kb, sendo identificados 34 genes codificadores de proteínas, 6 genes de rRNA e 22 genes de tRNA. A análise dos polimorfismos identificou 6 SNPs e 23 indels localizados em regiões intergênicas do genoma mitocondrial dos genótipos. Todas essas informações geradas nesta tese auxiliarão na aplicação das ciências genômicas nos PMGCA, permitindo a integração entre as sequências dos genes e suas respectivas proteínas, os polimorfismos e as informações funcionais. O banco de dados Sugarcane DB (http://sugarcane.ccb.ufv.br) foi criado para organizar essas informações e torna-las disponíveis aos PMGCA. A missão do Sugarcane DB é ser um repositório público permanente de informações genômicas relacionadas à cana-de-açúcar e se tornar uma ferramenta importante para auxiliar os melhoristas na identificação de novos alvos para o melhoramento genético da cana-de-açúcar. / In this thesis, genome sequencing data of the sugarcane cultivar RB867515 and other 508 sugarcane genotypes from 100 half-sib families are analyzed with the following objectives: (I) assemble the sequences of the nuclear, chloroplastidial and mitochondrial genomes of sugarcane cultivar RB867515; (II) predict and functionally annotate the genes and other elements in the assembled sequences; (III) analyze the single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the genomes of sugarcane genotypes; (IV) to associate the identified SNPs to the phenotypes of sugarcane genotypes using genome wide association studies (GWAS); (V) create a database integrating sequences, polymorphisms and functional information. Genomic libraries were sequenced using Illumina's next generation sequencing technologies and sequenced reads were trimmed and selected, yielding a dataset containing 1.39 billion reads of the cultivar RB867515 and 2.43 billion reads of the sugarcane genotypes. Nuclear, chloroplastidial and mitochondrial genome sequences of the cultivar RB867515 were assembled using De Novo assembly algorithms and reference-guided approaches. Genes were identified using ab initio and empirical methods, and functional information were predicted by using sequence similarities searches. In genotyping, the sequenced reads of the sugarcane genotypes were mapped in the genome of cultivar RB867515, and SNPs were predicted following guidelines for variant discovery from next-generation sequencing data. In the genome-wide association study, the association of SNPs with the phenotypes of sugarcane genotypes was evaluated using the enriched compressed mixed linear model (ECMLM). The nuclear genome of the cultivar RB867515 was assembled in 484,719 sequences with 552.97 megabases (Mb), containing 75,715 protein-coding genes. These genes were functionally annotated and the encoded proteins were classified into different functional groups. The polymorphisms analysis identified 40,663 loci containing SNPs in 7,890 genes. In GWAS, only one SNP in the isocitrate dehydrogenase enzyme gene showed significant association with sugarcane sucrose content in percentage (PC). The chloroplast genome of the cultivar RB867515 was assembled in a single sequence containing 141.18Kb, containing 88 protein-coding genes, 8 rRNA genes and 39 tRNA genes. Chloroplast genome sequence of cultivar RB867515 is identical to the sequence of Q155 cultivar from Australia. The polymorphisms analysis showed that only eight genotypes of the RB982639 family (g011, g030, g031, g094, g103, g246, g425 and g441) have SNPs in their chloroplast genome sequences. These polymorphisms (7 SNPs and 4 indels) are located in intergenic regions of chloroplast genome and in petB and ndhF genes. The mitochondrial genome of the cultivar RB867515 was assembled in two circular subgenomic segments with a total size of 445.52Kb, containing 34 protein-coding genes, 6 rRNA genes and 22 tRNA genes. The polymorphisms analysis identified 6 SNPs and 23 indels located in intergenic regions of the mitochondrial genome of sugarcane genotypes. All data generated in this thesis will contribute to the application of the genomic sciences in sugarcane breeding, allowing the integration among gene and protein sequences, polymorphisms and functional information. The Sugarcane DB database (http://sugarcane.ccb.ufv.br) was created to organize these data and make it available to the PMGCA. Sugarcane DB aims to be a permanent public repository of sugarcane genomic information and to become an important tool to assist breeders in identifying new targets for the genetic improvement of sugarcane.

Orientador: Guilherme Targino Valente / Resumo: A crescente demanda por combustíveis fósseis e as instabilidades econômicas relacionadas à sua utilização despertam o interesse no desenvolvimento de biocombustíveis tais como o bioetanol. O processo de produção mais comum do bioetanol é a tecnologia de primeira geração, no qual o organismo mais amplamente utilizado é a levedura Saccharomyces cerevisiae. No entanto, a alta concentração de etanol gera toxicidade para S. cerevisiae e constitui um dos fatores limitantes na produção deste bioetanol. Assim, a produção de linhagens mais resistentes a esse estressor constitui um ponto chave no desenvolvimento dos processos biotecnológicos relacionados ao bioetanol. Nesse contexto, análises sistêmicas são pouco empregadas para o entendimento do fenômeno de tolerância ao etanol, deixando a busca por genes candidatos algo bastante laborioso e custoso. Assim, as diferenças entre linhagens pouco tolerantes (LT) e altamente tolerantes (HT) ao etanol (EtOH) foram analisadas por meio de ferramentas de bioinformática como a biologia de sistemas e a análises de transcriptomas. Os resultados mostraram que as linhagens HT e LT utilizam inicialmente um sistema de resposta à estresse comum, mas que devido as mudanças na estrutura das redes metabólicas, regulatórias e de interação proteína-proteína de cada linhagem, mecanismos de resposta ao estresse por etanol distintos são ativados em cada grupo. As linhagens LT mantém a homeostase da célula com o ciclo celular ativo, efetuando o ajuste dos meta... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The increasing demand and economic instabilities related to the use of fossil fuels raised interest in the development of biofuels such as bioethanol. The most common bioethanol production process is from the first generation technology, in which the most widely used organism is the yeast Saccharomyces cerevisiae. However, the high concentration of ethanol generates toxicity to S. cerevisiae and this is one of the limiting factors in the bioethanol production. Thus, the production of more resistant strains to this stressor is crucial to the development of biotechnological processes related to bioethanol. The systems analyzes are poorly explored to understand the ethanol tolerance phenomenon, leading the search for candidate genes labor intensive and expensive. Thus, the differences between low tolerant (LT) and high tolerant (HT) strains to ethanol (EtOH) were analyzed using bioinformatics tools like systems biology and transcriptome analysis. The results showed that HT and LT strains initially used a common stress response system but due to changes in the network structure of metabolic, regulatory, and protein-protein interactions of each strain, different mechanisms of stress response are activated in each group. LT strains maintain the cellular homeostasis activating cell cycle, and adjusting metabolisms, despite activation of transposable elements and disruption of important anti-oxidant agents production, allowing the occurrence of DNA damage. HT strains disrupt the cell... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientadora: Maysa Furlan / Coorientador: Ana Maria Soares Pereira / Banca: Angela Regina Araújo / Banca: Rafael Victorio Carvalho Guido / Banca: Mario Sergio Palma / Banca: Fernando Continguiba da Silva / Resumo: Plantas biossintetizam uma ampla variedade de metabólitos secundários cujas atividades farmacológicas são consolidadas. No entanto, a obtenção em escala de metabólitos secundários a partir de plantas, muitas vezes, é restringida pelo acúmulo minoritário desses compostos em seus tecidos. Como muitas dessas moléculas apresentam elevada complexidade estrutural, sua obtenção por síntese orgânica pode ser ainda mais dificultada, tanto do ponto de vista econômico quanto ecológico. Contudo, as elucidações das vias metabólicas utilizadas pelas plantas na biossíntese dessas moléculas, sobretudo do ponto de vista enzimático, podem subsidiar o desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas, como a engenharia metabólica, para enfrentar esses desafios. Nesse contexto, surge a espécie Maytenus ilicifolia (Celastraceae), uma planta medicinal conhecida por produzir uma gama de metabólitos secundários bioativos, em especial, os triterpenos quinonametídeos (TQs), moléculas com pronunciada e abrangente atividade antitumoral. Desta forma, no presente trabalho foi realizado um estudo proteômico de células de M. ilicifolia com o objetivo principal de inventariar as enzimas de suas vias metabólicas secundárias, principalmente relacionadas a biossíntese dos TQs. Para isso, culturas de células de M. ilicifolia produtoras de TQs, maitenina (1) e 22-β-hidroximaitenina (2), foram elicitadas com metil jasmonato (100 µM) por 12, 24, 48 e 96 h e monitoradas quanto a produção dos TQs por CLAE-DAD. Das célul... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Plants biosynthesize a wide variety of secondary metabolites with consolidated pharmacological activities. However, the large - scale production of secondary metabolites by plants is often restricted by minor accumulation of these compounds in their tissues. Many of these molecules shows high structural complexity so their obtainment by organic synthesis can be further complicated both economically and ecologically. However, the elucidation of metabolic pathways used by plants in the biosynthesis of these mol ecules, especially from the enzymatic point of view, can support the development of biotechnological tools such as metabolic engineering, to address these challenges. In this context, emphasis can be given to Maytenus ilicifolia species (Celastraceae), a m edicinal plant that produces a range of bioactive compounds, including quinonamethide triterpenes (QMTs). Thus, in this study we performed a proteomic study of M. ilicifolia cells with the primary goal to provide an enzyme inventory of their secondary meta bolic pathways, mainly for biosynthesis of QMTs. Based on it, M. ilicifolia cell cultures producing the QMTs maytenin ( 1 ) and 22 - β - hydroxymaytenin ( 2 ) were elicited with methyl jasmonate (100 μM) during 12, 24, 48 and 96 h and monitoring for QMTs productio n by HPLC - DAD. Cells that showed a higher QMTs accumulation (when comparing elicited and control cells.) were submitted to protein extractions and analyzed by LCMS - IT - TOF, using shotgun strategy. We have found 1319 proteins in both cells by comparison with proteins of the model plants from databases. Among them, enzymes involved in the biosynthesis of QMTs, including the cytochrome P450 (CYP450s) that potentially catalyze the final steps of this synthesis. We also have found enzymes involved in the biosynth esis of others secondary metabolites characteristic of the species, and proteins related to primary... / Doutor

Camundongos são modelos valiosos para o entendimento dos processos e mecanismos moleculares e fisiológicos em mamíferos. A maioria do nosso conhecimento sobre esses processos e mecanismos vem de experimentos realizados com camundongos de linhagens isogênicas. Essas linhagens, criadas normalmente por sucessivos cruzamentos irmão-irmã, surgiram no início do século XX visando reduzir a interferência da variabilidade genética, aumentando a reprodutibilidade dos experimentos. Caracterizar o background genético das linhagens isogênicas permite não só traçar possíveis relações de parentesco entre linhagens, mas também permite o controle genético oriundo de possíveis contaminações e mutações espontâneas que possam surgir na população. Além das linhagens isogênicas, os camundongos mutantes também são importantes como modelos para o estudo de doenças humanas. O uso desses modelos murinos permite a elucidação e associação de fatores genéticos a manifestações fenotípicas diversas, como síndromes hereditárias e predisposições a doenças. Esses mutantes podem ser gerados por uma abordagem de varredura de mutagênese pelo agente mutagênico ENU, que inclui a caracterização de fenótipos interessantes e a busca pelas mutações causativas induzidas. O presente trabalho teve como objetivo utilizar o sequenciamento completo de exomas para caracterizar o background genético das linhagens isogênicas C57BL/6ICBI e BALB/cICBI, mantidas há quase 20 anos no Brasil e distribuídas pelo ICB-USP a pesquisadores de todo país. O trabalho também usou o sequenciamento de nova geração (NGS) para a busca das mutações causadores de fenótipo em um grupo de sete mutantes induzidos por ENU oriundos de uma varredura prévia. Através da aplicação de uma estratégia de análise de dados e filtragem de mutações foi possível encontrar mutações candidatas com alto potencial de impacto para todos os mutantes avaliados, validadas por sequenciamento Sanger. Os genes afetados pelas mutações encontradas indicam que os mutantes possam se tornar interessantes modelos para o estudo de doenças neuromusculares e neurológicas. A avaliação do exoma das linhagens C57BL/6ICBI e BALB/cICBI descartou a possibilidade de contaminação das colônias com outras linhagens, e revelou similaridades relacionadas com o parentesco das sublinhagens brasileiras em relação a linhagens gold-standard. As informações obtidas serão uma fonte importante de informação no planejamento e análise dos resultados obtidos com o uso tanto dos mutantes quanto com as linhagens fornecidas pelo Biotério do Departamento de Imunologia ao ICB a instituições de todo o Brasil. / Mice are valuable models for the comprehension of molecular processes and underlying physiological mechanisms in mammals. Most of the knowledge about those processes came from experiments with isogenic mice. Those strains, arose in the 1900s by successive inbreeding, are very important as they reduce genetic variability across the experiments increasing reproducibility. Isogenic lineages are kept as isolated colonies in animal facilities and supplied to researchers, as they needed. Thus, is possible to trace relationships among strains all over the world using the characterization of their genetic backgrounds. It is also possible to detect putative contaminations and spontaneous mutations which can arise in the populations. Mutant mice are also important tools as human disease models, allowing associations between genetic factors and phenotypes. Those mutants could be generated in forward genetics approaches by screenings using mutagens as ENU. The aims of this work were to characterize the genetic background of two mouse strains used at ICB-USP C57BL/6ICBI and BALB/cICBI and to find causative mutations of seven mutants generated by a previous ENU-mutagenesis screening. We used whole-exome sequencing followed by resequencing data-analysis approaches to detect SNVs for both isogenic strains and mutants. Exome evaluation of isogenic strains C57BL/6ICBI and BALB/cICBI did not reveal any evidence for cross-contamination and provided insightful details related to other strains and substrains. A specific filtering strategy was applied to select candidates for phenotypecausative mutations in the seven ENU-induced mutants. We are able to select candidates for all mutants at a high global Sanger validation rate when considering only the main candidates for each mutant. Considering affected genes and phenotypes all mutants have potential to become interesting mouse models for human diseases. Taken together, our results are a reliable and confident source of genetic information for experimental analysis for researchers who use isogenic strains provided by animal facility at ICB-USP and research groups interested in further characterization of mutant study neuromuscular, neuronal or development processes using mice as animal models.

A metabolômica é uma ciência emergente na era pós-genômica que almeja a análise abrangente de pequenas moléculas orgânicas em sistemas biológicos. Técnicas de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS) figuram como as abordagens de amostragem mais difundidas. A extração e detecção simultânea de metabólitos por LC-MS produz conjuntos de dados complexos que requerem uma série de etapas de pré-processamento para que a informação possa ser extraída com eficiência e precisão. Para que as abordagens de perfil metabólico não direcionado possam ser efetivamente relacionadas às alterações de interesse no metabolismo, é estritamente necessário que os metabólitos amostrados sejam anotados com confiabilidade e que a sua inter-relação seja interpretada sob a pressuposição de uma amostra conectada do metabolismo. Diante do desafio apresentado, a presente tese teve por objetivo desenvolver um arcabouço de software, que tem como componente central um método probabilístico de anotação de metabólitos que permite a incorporação de fontes independentes de informações espectrais e conhecimento prévio acerca do metabolismo. Após a classificação probabilística, um novo método para representar a distribuição de probabilidades a posteriori em forma de grafo foi proposto. Uma biblioteca de métodos para o ambiente R, denominada ProbMetab (Probilistic Metabolomics), foi criada e disponibilizada de forma aberta e gratuita. Utilizando o software ProbMetab para analisar um conjunto de dados benchmark com identidades dos compostos conhecidas de antemão, demonstramos que até 90% das identidades corretas dos metabólitos estão presentes entre as três maiores probabilidades. Portanto, pode-se enfatizar a eficiência da disponibilização da distribuição de probabilidades a posteriori em lugar da classificação simplista usualmente adotada na área de metabolômica, em que se usa apenas o candidato de maior probabilidade. Numa aplicação à dados reais, mudanças em uma via metabólica reconhecidamente relacionada a estresses abióticos em plantas (Biossíntese de Flavona e Flavonol) foram automaticamente detectadas em dados de cana-de-açúcar, demonstrando a importância de uma visualização centrada na distribuição a posteriori da rede de anotações dos metabólitos. / Metabolomics is an emerging science field in the post-genomic era, which aims at a comprehensive analysis of small organic molecules in biological systems. Techniques of liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) figure as the most widespread approaches to metabolomics studies. The metabolite detection by LC-MS produces complex data sets, that require a series of preprocessing steps to ensure that the information can be extracted efficiently and accurately. In order to be effectively related to alterations in the metabolism of interest, is absolutely necessary that the metabolites sampled by untargeted metabolic profiling approaches are annotated with reliability and that their relationship are interpreted under the assumption of a connected metabolism sample. Faced with the presented challenge, this thesis developed a software framework, which has as its central component a probabilistic method for metabolite annotation that allows the incorporation of independent sources of spectral information and prior knowledge about metabolism. After the probabilistic classification, a new method to represent the a posteriori probability distribution in the form of a graph has been proposed. A library of methods for R environment, called ProbMetab (Probilistic Metabolomics), was created and made available as an open source software. Using the ProbMetab software to analyze a set of benchmark data with compound identities known beforehand, we demonstrated that up to 90% of the correct metabolite identities were present among the top-three higher probabilities, emphasizing the efficiency of a posteriori probability distribution display, in place of a simplistic classification with only the most probable candidate, usually adopted in the field of metabolomics. In an application to real data, changes in a known metabolic pathway related to abiotic stresses in plants (Biosynthesis of Flavone and Flavonol) were automatically detected on sugar cane data, demonstrating the importance of a view centered on the posterior distribution of metabolite annotation network.

A visao sobre o dogma central da biologia molecular passou por aperfeicoamentos na virada deste seculo. Muito se deve ao interesse por pesquisas feitas para compreensao do que ate entao eram regioes do genoma conhecidas como DNA Lixo. Neste contexto, projetos de transcriptoma, avancos em tecnologias de sequenciamento, bem como analises em bioinformatica, contribuiram para elucidar o que estava sendo transcrito. Tais regioes foram denominadas como RNAs nao-codificadores ou non-coding RNA (ncRNA) que eram transcritas, mas nao traduzidas em proteinas. Apesar da quantidade de metodos para o estudo in silico dos ncRNAs, existem lacunas a serem preenchidas nas pesquisas desta molecula, tais como: metodos de anotacao em geral, caracterizacao de novas classes e mecanismos alternativos de busca por similaridade de sequencia primaria. Alem disso, nao se havia uma ferramenta que reunisse num unico local as informacoes dos bancos de dados publicos de ncRNA disponiveis. Neste trabalho, buscou-se preencher tais lacunas, contribuindo para o desenvolvimento de metodos computacionais nas pesquisas em ncRNAs. Foram utilizados os genomas de Hymenoptera e Diptera como sistema biologico para aplicar e testar os metodos desenvolvidos. / The classical vision of the central dogma of molecular biology was not changes dramatic until the end of the 20th century. At this time the scientific communities were interesting to understand what have in the regions of the genome known as \"Junk DNA\". Transcriptome projects together with sequencing Technologies anda bioinformatics analysis help to elucidate that this transcripts were regions that do not coding proteins and maybe has function. These transcripts are called non-coding RNA (ncRNA). Although there are a lot of computational approaches to the in silico research of ncRNA, there is a gap of research about this molecule such: approaches to the general annotation of ncRNA; identification of new classes of ncRNA; and alternatives search mechanisms of ncRNA. Besides that, there are not any central repository of public non-coding RNA databases that could help search for the information about it. In this report, we fill this gap. We tried to contributing to the development of computational methods in research on ncRNAs. We also used the Hymenoptera and Diptera genomes as a biological system to apply and test our developed approaches.

A comparação de genomas é uma importante tarefa na qual a bioinformática pode ser aplicada, uma vez que ela permite a identificação de genes patogênicos, o que, por sua vez, pode auxiliar a combater ou a prevenir o surgimento de doenças. A partir da comparação de genomas, também é possível realizar a análise filogenética, que permite entender as relações evolutivas entre diferentes organismos. Em genomas de bactérias, essa análise geralmente é realizada com base no gene 16S rRNA. Entretanto, apesar de ser amplamente utilizado, filogenias com base nesse gene podem ter dificuldades para diferenciar organismos muito próximos evolutivamente. Essa importância da comparação de genomas e a necessidade de uma metodologia que permita distinguir organismos evolutivamente próximos na análise filogenética motivaram este trabalho, que teve como objetivo implementar ferramentas computacionais para identificar genes homólogos em genomas e, com base nesses genes, gerar filogenias e analisar se é possível distinguir os organismos evolutivamente próximos nessas filogenias. Para tanto, as ferramentas desenvolvidas para identificação de genes homólogos recebem resultados de alinhamentos e os filtram, de modo que dois genes são considerados homólogos se o alinhamento entre eles satisfizer os limiares definidos. Após a identificação das famílias de genes homólogos, tabelas são geradas com informações a respeito dos genes homólogos em cada genoma e, com base nessas tabelas, é possível gerar matrizes de distância e utilizar métodos de agrupamento hierárquico para a geração da filogenia ou realizar alinhamentos múltiplos com os genes identificados para posterior reconstrução filogenética. Além disso, também é possível representar os genes e famílias de genes homólogos por meio de um grafo, que pode auxiliar na escolha dos limiares para filtrar os alinhamentos. Para demonstrar e analisar a aplicabilidade das ferramentas desenvolvidas e das abordagens adotadas, experimentos foram realizados utilizando genomas de bactérias do gênero Xanthomonas, que contém um grande grupo de bactérias que causam doenças em plantas. Os resultados obtidos foram então comparados com filogenias de referência e com resultados de outros experimentos realizados. Essas comparações demonstraram que as famílias de genes homólogos podem ser úteis para distinguir genomas de organismos muito próximos evolutivamente, apesar de que essa abordagem apresentou dificuldades para separar os grupos de genomas mais distantes. Em contrapartida, na filogenia gerada a partir da região 16S rRNA, foi possível diferenciar esses organismos mais distantes, mas não foi possível distinguir os organismos muito próximos. Por fim, os experimentos realizados fornecem indícios de que as ferramentas desenvolvidas e as abordagens adotadas podem ser úteis para diferenciar genomas muito próximos evolutivamente de outros procariotos além das bactérias estudadas neste trabalho / Genome comparison is an important task on which bioinformatics can be used because it allows the identification of pathogen genes which can aid the combat of diseases and to avoid the emerging of new ones. Genome comparison also allows the phylogenetic analysis which provides the understanding of evolutional relations of different organisms. In bacterial genomes, this analysis is commonly based on 16S rRNA gene. Unfortunately, it can present some difficulties to distinguish closely related organisms. This importance of genome comparison and the necessity of a methodology to distinguish organisms that are closely related motivated this study, which aimed the development of computational tools to identify homologous genes in genomes, to use these genes to reconstruct phylogenies and to analyze if it is possible to distinguish closely related organisms on these phylogenies. To achieve this purpose, the developed tools to identify homologous genes receive the alignments results and filter it, such that two genes are homologous if their alignment satisfies the thresholds. After the identification of homologous gene families, the tools generates tables with information about the homologous genes presents in each genome and with these tables it is possible to create distance matrix to be used by hierarchical clustering methods to generate phylogenies or it is possible to perform multiple alignments with the identified genes to accomplish a phylogenetic reconstruction. Besides that, it is possible to represent the genes and homologous gene families in a graph, which can aid the choice of the thresholds to filter the alignments. To demonstrate and analyze the applicability of the developed tools and the approaches chosen in this study, experiments were performed using genomes of the bacterial genus Xanthomonas, which include a group of phytopathogenic bacteria. The results obtained were compared with reference phylogenies and with results of other experiments. These comparisons showed that homologous gene families can be used to differentiate closely related organisms, despite the fact that it presented difficulties to distinguish the groups of genomes that were evolutionarily far from each other. On the other hand, the phylogeny based on 16S rRNA region allows to distinguish the groups of genomes that were distant, but it was not possible to differentiate closely related organisms. As a conclusion, the experiments performed give pieces of evidence that the developed tools and the approaches adopted can be useful to distinguish genomes of closely related organisms of other prokaryotes besides the bacterias considered in this study

A Bioinformática tem se desenvolvido de forma intensa nos últimos anos. A necessidade de se processar os grandes conjuntos de sequências, sejam de nucleotídeos ou de aminoácidos, tem estimulado o desenvolvimento de diversas técnicas algorítmicas, de modo a tratar este problema de maneira factível. Os algoritmos de alinhamento de alinhamento múltiplo de sequências assumiram um papel primordial, tornando a execução de alinhamentos de conjuntos com mais de duas sequencias uma tarefa viável computacionalmente. No entanto, com o aumento vertiginoso tanto da quantidade de sequencias em um determinado conjunto, quanto do comprimento dessas sequencias, a utilização desses algoritmos de alinhamento múltiplo, sem o acoplamento de novas estratégias, tornou-se algo impraticável. Consequentemente, a computação de alto desempenho despontou como um dos recursos a serem utilizados, através da paralelização de diversas estratégias para sua execução em grandes sistemas computacionais. Além disso, com a contínua expansão dos conjuntos de sequências, outras estratégias de otimização passaram a ser agregadas aos algoritmos de alinhamento múltiplo paralelos. Com isso, o desenvolvimento de ferramentas para alinhamento múltiplo de sequencias baseadas em abordagens híbridas destaca-se, atualmente, como a solução com melhor aceitação. Assim, no presente trabalho, pode-se verificar o desenvolvimento de uma estratégia híbrida para os algoritmos de alinhamento múltiplo progressivos, cuja utilização e amplamente difundida, em Bioinformática. Nesta abordagem, conjugou-se a paralelização e o particionamento dos conjuntos de sequências, na fase de construção da matriz de pontuação, e a otimização das fases de construção da árvore filogenética e de alinhamento múltiplo, através dos algoritmos de colônia de formigas e simulated annealling paralelo, respectivamente. / Bioinformatics has been developed in a fast way in the last years. The need for processing large sequences sets, either nucleotides or aminoacids, has stimulated the development of many algorithmic techniques, to solve this problem in a feasible way. Multiple sequence alignment algorithms have played an important role, because with the reduced computational complexity provided by them, it is possible to perform alignments with more than two sequences. However, with the fast growing of the amount and length of sequences in a set, the use of multiple alignment algorithms without new optimization strategies became almost impossible. Therefore, high performance computing has emerged as one of the features being used, through the parallelization of many strategies for execution in large computational systems. Moreover, with the continued expansion of sequences sets, other optimization strategies have been coupled with parallel multiple sequence alignments. Thus, the development of multiple sequences alignment tools based on hybrid strategies has been considered the solution with the best results. In this work, we present the development of a hybrid strategy to progressive multiple sequence alignment, where its using is widespread in Bioinformatics. In this approach, we have aggregated the parallelization and the partitioning of sequences sets in the score matrix calculation stage, and the optimization of the stages of the phylogenetic tree reconstruction and multiple alignment through ant colony and parallel simulated annealing algorithms, respectively.