Ph.D. / Bovine babesiosis, or redwater, is at present known to be caused by Babesia bigemina and Babesia bovis in the Republic of South Africa. Until recently, however, the only information on the natural transmission of these parasites in the country was based on observations made during the early part of this century and information on the developmental cycle of the parasites in their vectors was superficial or nonexistent ...

O carrapato Rhipicephalus microplus é um ectoparasito hematófago de grande importância para a pecuária por ser responsável por perdas massivas na produção animal, de forma que o seu controle é economicamente relevante. Este carrapato, além dos danos que causa por si só, é também um importante vetor para a transmissão de microorganismos patogênicos, entre eles o hemoprotozoário intraeritrocítico Babesia bovis. O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma linhagem de B. bovis capaz de expressar um antígeno protetor, uma glutationa S-transferase do carrapato Haemaphysalis longicornis (HlGST), e o teste desta linhagem como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato R. microplus. B. bovis, em cultivo, da linhagem S74-T3B foram eletroporados em presença de plasmídeo contendo o promotor bidirecional de B. bovis Ef-1 aresponsável pela expressão independente de dois genes: o repórter fusionado ao agente para seleção (GFP-BSD) e HlGST fusionada à sequência codificadora do peptídeo sinal de MSA-1 (merozoite surface antigen-1). Após a eletroporação, foi feita a seleção com blasticidina para obtenção da linhagem nomeada HlGST. A linhagem HlGST é composta por parasitos contendo diferentes padrões de inserção dos genes exógenos, tanto dentro quanto fora do locus Ef-1. Uma linhagem clonal denominada HlGST-Cln expressando HlGST e GFP-BSD foi obtida a partir da linhagem HlGST. Dois ensaios, independentes, de imunização de bovinos com os parasitos clonais foram realizados, sendo usado como controle uma linhagem clonal previamente caracterizada denominada GFP-Cln. Todos os animais inoculados desenvolveram uma forma branda de babesiose, indicando que ambas as linhagens clonais são atenuadas, mas apenas os animais imunizados com a linhagem HlGST-Cln foram capazes de produzir anticorpos anti-HlGST. O segundo procedimento de imunização foi seguido por um desafio com larvas de R. microplus. O desenvolvimento dessas larvas no hospedeiro levou a fêmeas adultas de menor peso e fertilidade. Coletivamente, esses dados mostram a possibilidade de uso de linhagens transfectadas de B. bovis como vacinas de vetor vivo. / The tick Rhipicephalus microplus is a notorious blood-feeding ectoparasite of cattle, responsible for massive losses in animal production. It is the main vector of pathogenic microorganisms, including Babesia bovis, an intraerythrocytic apicomplexan protozoan parasite responsible for bovine babesiosis. This study describes the development and testing of a live B. bovis vaccine expressing the protective tick antigen glutathione S-transferase from Haemaphysalis longicornis (HlGST). The B. bovis S74- T3B parasites were electroporated with a plasmid containing the bidirectional Ef-1 promoter of B. bovis controlling expression of two independent genes, the selectable marker GFP-BSD, and HlGST fused to the MSA-1 (merozoite surface antigen-1) signal peptide from B. bovis. Electroporation followed by blasticidin selection resulted in the emergence of a mixed B. bovis transfected line (termed HlGST) in in vitro cultures, containing parasites with distinct patterns of insertion of both exogenous genes, either in or outside the Ef-1 a locus. A B. bovis clonal line termed HlGST-Cln expressing HlGST and GFP-BSD was then derived from the mixed parasite line HlGST. Two independent calf immunization trials were performed via intravenous inoculation of the HlGST-Cln and a control consisting of an irrelevant transfected clonal line of B. bovis designated GFP-Cln. The control GFP-Cln line contains a copy of the GFP-BSD gene inserted into the Ef-1 locus of B. bovis in an identical fashion as the HIGST-Cln parasites. All animals inoculated with the HlGST-Cln and GFP-Cln transfected parasites developed mild babesiosis indicating that both transfected cloned parasite lines are attenuated. All animals immunized with HlGST-Cln produced detectable anti-glutathione-S-transferase antibodies. After immunization with HlGST-Cln, calves were challenged with R. microplus larva. Development of these larva produce fully engorged female tick with reduced weight and fertility. Collectively, these data show that transfected B. bovis parasites can be used as vectors in live vectored vaccines.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-07T19:51:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2564154 bytes, checksum: ee2fe00d1c7a56d422a883011419d135 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-07T19:51:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2564154 bytes, checksum: ee2fe00d1c7a56d422a883011419d135 (MD5) Previous issue date: 2002-09-09 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Foram isoladas células endoteliais de veia umbilical bovina (BUVECs) com a finalidade de determinar a expressão de moléculas de adesão como ICAM-1, VCAM, PECAM-1, E-selectina e trombospondina na fisiopatologia de B. bovis num estudo in vitro. Posteriormente esta expressão foi confirmada, num estudo in situ, em tecidos (cérebro, pulmão e rim) de animais que morreram após inoculação com amostra patogênica de Babesia bovis (BbovUFV1 7 a passagem). Eritrócitos dos animais infectados foram testados quanto à capacidade de aderir em BUVECs determinando a cinética de adesão. Os mesmos testes de adesão foram realizados em BUVECs estimuladas com plasma de animais infectados com B. bovis e sobrenadante de cultura de PBMC bovino estimulado com peptídeo sintético proveniente da RAP-1 de B. bovis contendo citocinas quantificadas (IFN-γ, TNF-α e IL-12). Houve aumento significativo na adesão de eritrócitos de animais inoculados em BUVECs estimuladas com plasma e sobrenadante de PBMC. Entretanto, adesão foi observada somente para eritrócitos não parasitados, sugerindo que antígenos livres de B. bovis no soro marcam eritrócitos não parasitados, ou ainda uma possível expressão de uma isoforma de VESA-1 não aderente. Aderência não foi observada nos testes com amostras dos animais negativos. As células estimuladas com plasma de animais infectados e com sobrenadante de PBMC mostraram imunomarcação positiva muito mais intensa de ICAM-1, VCAM, PECAM-1, E-selectina e trombospondina que as células que não receberam estímulo. Igualmente no estudo in situ foi observado aumento na expressão de ICAM- 1, VCAM, PECAM-1, E-selectina e trombospondina em tecidos como cérebro, pulmão e rim dos bovinos infectados com B. bovis em comparação ao grupo controle. Estes resultados sugerem que as interleucinas, liberadas na fase aguda da babesiose, estimulam a expressão das moléculas de adesão relacionadas à fisiopatologia da babesiose causada por B. bovis, fato demonstrado in vitro pela expressão das moléculas em BUVECs e a citoaderência de eritrócitos. Estes achados demonstram similaridades na fisiopatologia de B. bovis e do Plasmodium falciparum. / Endothelial cells from bovine umbilical vein (BUVECs) were isolated with the purpose of determining the expression of ICAM-1, VCAM, PECAM- 1, E-selectin and thrombospondin in the physiopathology of Babesiosis caused by B. bovis. Later, this expression was confirmed by in situ study, using tissue samples (brain, lung and kidney) of animals that died after inoculation with a pathogenic strain of B. bovis (BbovUFV1 7th passage). Erythrocytes of infected animals were tested in order to observer capacity of binding to BUVECs and its adhesion kinetics. The same adhesion tests were made on BUVECs stimulated with plasma of animals infected with B. bovis and culture supernatant of bovine PBMC, stimulated with the synthetic peptide RAP-1 of B. bovis containing quantified cytokines (IFN-γ, TNF-α and IL-12). There was a significant increase in the adhesion of erythrocytes of animals inoculated in BUVECs stimulated with plasma and supernatant of PBMC. However, adhesion was observed only on non-parasitised erythrocytes, suggesting that free antigens of B. bovis in the serum can prime erythrocytes non-parasitised, or still a possible expression of an isoform of VESA-1 non adherent. Adherence was not observed in the tests with samples of the negative animals. Cells stimulated with infected animals xiiiplasma and with supernatant of PBMC showed stronger expression of ICAM- 1, VCAM, PECAM-1, E-selectine and thrombospondin, them cells that didn't receive stimuli. In the same way, it was observed strong expression of ICAM- 1, VCAM, PECAM-1, E-selectine and thrombospondin in tissue samples of brain, lung and kidney in bovines infected with B. bovis, when comparing to the control group. These results suggest that Interleukins, liberated in the acute phase the Babesiosis, stimulate the expression of adhesion molecules related to the physiopathology of Babesiosis caused by B. bovis, as demonstrated by the expression of molecules in BUVECs and erythrocytes cytoadhesion. These date demonstrate physiopathologycal similarities between B. bovis and Plasmodium falciparum.

O carrapato Rhipicephalus microplus é um ectoparasito hematófago de grande importância para a pecuária por ser responsável por perdas massivas na produção animal, de forma que o seu controle é economicamente relevante. Este carrapato, além dos danos que causa por si só, é também um importante vetor para a transmissão de microorganismos patogênicos, entre eles o hemoprotozoário intraeritrocítico Babesia bovis. O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma linhagem de B. bovis capaz de expressar um antígeno protetor, uma glutationa S-transferase do carrapato Haemaphysalis longicornis (HlGST), e o teste desta linhagem como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato R. microplus. B. bovis, em cultivo, da linhagem S74-T3B foram eletroporados em presença de plasmídeo contendo o promotor bidirecional de B. bovis Ef-1 aresponsável pela expressão independente de dois genes: o repórter fusionado ao agente para seleção (GFP-BSD) e HlGST fusionada à sequência codificadora do peptídeo sinal de MSA-1 (merozoite surface antigen-1). Após a eletroporação, foi feita a seleção com blasticidina para obtenção da linhagem nomeada HlGST. A linhagem HlGST é composta por parasitos contendo diferentes padrões de inserção dos genes exógenos, tanto dentro quanto fora do locus Ef-1. Uma linhagem clonal denominada HlGST-Cln expressando HlGST e GFP-BSD foi obtida a partir da linhagem HlGST. Dois ensaios, independentes, de imunização de bovinos com os parasitos clonais foram realizados, sendo usado como controle uma linhagem clonal previamente caracterizada denominada GFP-Cln. Todos os animais inoculados desenvolveram uma forma branda de babesiose, indicando que ambas as linhagens clonais são atenuadas, mas apenas os animais imunizados com a linhagem HlGST-Cln foram capazes de produzir anticorpos anti-HlGST. O segundo procedimento de imunização foi seguido por um desafio com larvas de R. microplus. O desenvolvimento dessas larvas no hospedeiro levou a fêmeas adultas de menor peso e fertilidade. Coletivamente, esses dados mostram a possibilidade de uso de linhagens transfectadas de B. bovis como vacinas de vetor vivo. / The tick Rhipicephalus microplus is a notorious blood-feeding ectoparasite of cattle, responsible for massive losses in animal production. It is the main vector of pathogenic microorganisms, including Babesia bovis, an intraerythrocytic apicomplexan protozoan parasite responsible for bovine babesiosis. This study describes the development and testing of a live B. bovis vaccine expressing the protective tick antigen glutathione S-transferase from Haemaphysalis longicornis (HlGST). The B. bovis S74- T3B parasites were electroporated with a plasmid containing the bidirectional Ef-1 promoter of B. bovis controlling expression of two independent genes, the selectable marker GFP-BSD, and HlGST fused to the MSA-1 (merozoite surface antigen-1) signal peptide from B. bovis. Electroporation followed by blasticidin selection resulted in the emergence of a mixed B. bovis transfected line (termed HlGST) in in vitro cultures, containing parasites with distinct patterns of insertion of both exogenous genes, either in or outside the Ef-1 a locus. A B. bovis clonal line termed HlGST-Cln expressing HlGST and GFP-BSD was then derived from the mixed parasite line HlGST. Two independent calf immunization trials were performed via intravenous inoculation of the HlGST-Cln and a control consisting of an irrelevant transfected clonal line of B. bovis designated GFP-Cln. The control GFP-Cln line contains a copy of the GFP-BSD gene inserted into the Ef-1 locus of B. bovis in an identical fashion as the HIGST-Cln parasites. All animals inoculated with the HlGST-Cln and GFP-Cln transfected parasites developed mild babesiosis indicating that both transfected cloned parasite lines are attenuated. All animals immunized with HlGST-Cln produced detectable anti-glutathione-S-transferase antibodies. After immunization with HlGST-Cln, calves were challenged with R. microplus larva. Development of these larva produce fully engorged female tick with reduced weight and fertility. Collectively, these data show that transfected B. bovis parasites can be used as vectors in live vectored vaccines.

O carrapato Rhipicephalus microplus é um ectoparasito hematófago de grande importância para a pecuária por ser responsável por perdas massivas na produção animal, de forma que o seu controle é economicamente relevante. Este carrapato, além dos danos que causa por si só, é também um importante vetor para a transmissão de microorganismos patogênicos, entre eles o hemoprotozoário intraeritrocítico Babesia bovis. O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma linhagem de B. bovis capaz de expressar um antígeno protetor, uma glutationa S-transferase do carrapato Haemaphysalis longicornis (HlGST), e o teste desta linhagem como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato R. microplus. B. bovis, em cultivo, da linhagem S74-T3B foram eletroporados em presença de plasmídeo contendo o promotor bidirecional de B. bovis Ef-1 aresponsável pela expressão independente de dois genes: o repórter fusionado ao agente para seleção (GFP-BSD) e HlGST fusionada à sequência codificadora do peptídeo sinal de MSA-1 (merozoite surface antigen-1). Após a eletroporação, foi feita a seleção com blasticidina para obtenção da linhagem nomeada HlGST. A linhagem HlGST é composta por parasitos contendo diferentes padrões de inserção dos genes exógenos, tanto dentro quanto fora do locus Ef-1. Uma linhagem clonal denominada HlGST-Cln expressando HlGST e GFP-BSD foi obtida a partir da linhagem HlGST. Dois ensaios, independentes, de imunização de bovinos com os parasitos clonais foram realizados, sendo usado como controle uma linhagem clonal previamente caracterizada denominada GFP-Cln. Todos os animais inoculados desenvolveram uma forma branda de babesiose, indicando que ambas as linhagens clonais são atenuadas, mas apenas os animais imunizados com a linhagem HlGST-Cln foram capazes de produzir anticorpos anti-HlGST. O segundo procedimento de imunização foi seguido por um desafio com larvas de R. microplus. O desenvolvimento dessas larvas no hospedeiro levou a fêmeas adultas de menor peso e fertilidade. Coletivamente, esses dados mostram a possibilidade de uso de linhagens transfectadas de B. bovis como vacinas de vetor vivo. / The tick Rhipicephalus microplus is a notorious blood-feeding ectoparasite of cattle, responsible for massive losses in animal production. It is the main vector of pathogenic microorganisms, including Babesia bovis, an intraerythrocytic apicomplexan protozoan parasite responsible for bovine babesiosis. This study describes the development and testing of a live B. bovis vaccine expressing the protective tick antigen glutathione S-transferase from Haemaphysalis longicornis (HlGST). The B. bovis S74- T3B parasites were electroporated with a plasmid containing the bidirectional Ef-1 promoter of B. bovis controlling expression of two independent genes, the selectable marker GFP-BSD, and HlGST fused to the MSA-1 (merozoite surface antigen-1) signal peptide from B. bovis. Electroporation followed by blasticidin selection resulted in the emergence of a mixed B. bovis transfected line (termed HlGST) in in vitro cultures, containing parasites with distinct patterns of insertion of both exogenous genes, either in or outside the Ef-1 a locus. A B. bovis clonal line termed HlGST-Cln expressing HlGST and GFP-BSD was then derived from the mixed parasite line HlGST. Two independent calf immunization trials were performed via intravenous inoculation of the HlGST-Cln and a control consisting of an irrelevant transfected clonal line of B. bovis designated GFP-Cln. The control GFP-Cln line contains a copy of the GFP-BSD gene inserted into the Ef-1 locus of B. bovis in an identical fashion as the HIGST-Cln parasites. All animals inoculated with the HlGST-Cln and GFP-Cln transfected parasites developed mild babesiosis indicating that both transfected cloned parasite lines are attenuated. All animals immunized with HlGST-Cln produced detectable anti-glutathione-S-transferase antibodies. After immunization with HlGST-Cln, calves were challenged with R. microplus larva. Development of these larva produce fully engorged female tick with reduced weight and fertility. Collectively, these data show that transfected B. bovis parasites can be used as vectors in live vectored vaccines.

Submitted by TALITA BARBAN BILHASSI null (talitabarban@yahoo.com.br) on 2016-04-26T17:24:25Z No. of bitstreams: 1 TESE TALITA BARBAN BILHASSI.pdf: 3215997 bytes, checksum: 07aede5d76602ed82d16385cc21986cf (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-04-28T18:47:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 bilhassi_tb_dr_jabo.pdf: 3215997 bytes, checksum: 07aede5d76602ed82d16385cc21986cf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T18:47:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 bilhassi_tb_dr_jabo.pdf: 3215997 bytes, checksum: 07aede5d76602ed82d16385cc21986cf (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Entre as principais causas de perdas produtivas em bovinos criados nos trópicos está a infestação pelo carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus e, consequentemente, dos hemoparasitas transmitidos por ele. A resistência dos zebuínos e de animais cruzados com raças taurinas à infestação por esse ácaro é amplamente conhecida. Entretanto, no que se refere à suscetibilidade às babesioses bovinas, existem evidências de que o grupo genético também pode interferir na resistência, seguindo o mesmo padrão observado para o carrapato vetor, com os taurinos apresentando maior sensibilidade. Assim, este estudo teve por objetivo avaliar a parasitemia por Babesia bovis e Babesia bigemina em 50 novilhas da raça Canchim ( Charolês + Zebu) naturalmente infestadas pelo R. (B.) microplus nas quatro estações do ano durante 24 meses, além de caracterizar o perfil de citocinas que podem estar associados ao fenótipo de resistência e suscetibilidade aos hemoparasitas do gênero Babesia spp. Foram realizadas contagens de fêmeas adultas de carrapatos com tamanho igual ou superior a 4,5 mm de diâmetro, presentes no lado esquerdo de cada bovino. As amostras de DNA extraídas foram submetidas à amplificação por meio da Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (qPCR), utilizando iniciadores que flanqueiam fragmentos dos genes mitocondriais do citocromo b (mt-cyt B), específicos para B. bovis e B. bigemina. O RNA extraído do sangue, foi usado para sintetizar o DNA complementar (cDNA) para análise de expressão dos genes do IFN- , TNF- , IL-10 e IL-12B por meio da quantificação relativa (RTqPCR). Foram observadas diferenças significativas (P<0,05) entre os meses das avaliações para a contagem de carrapatos. Entretanto, não houve efeito significativo (P>0,05) nas colheitas realizadas entre novembro de 2013 a janeiro de 2014 e entre os meses janeiro e fevereiro de 2015. A frequência da parasitemia no rebanho foi de 98%. Dentre as amostras de DNA que puderam ser quantificadas pela qPCR, 98% e 95,4% foram positivas para B. bovis e B. bigemina, respectivamente. Com relação ao número de cópias (NC) dos fragmentos dos genes mt-cyt B específicos para B. bovis e B. bigemina foram observados efeitos significativos (P<0,05) para ambas as espécies e interação das mesmas com as colheitas realizadas nas diferentes estações do ano. A análise do nível de expressão de mRNA do IFN- , TNF- e IL-12B revelou que houve um efeito siginificativo (P<0,05) da interação entre animais dos extremos de resistência/suscetibilidade e estações do ano, exceto para IL-10. Conclui-se que, a qPCR apresenta alta sensibilidade e especificidade para o diagnóstico das babesioses bovinas em amostras de sangue e que a oscilação na carga parasitária nas diferentes estações do ano pode estar associada com o perfil de expressão de citocinas apresentada. / Among the main causes of production losses in cattle is in the tropics infestation by Rhipicephalus (Boophilus) microplus, and consequently the hemoparasites transmitted by it. The resistance of zebu and crossbred with European breeds to infestation by this mite is widely known. However, as regards susceptibility to bovine babesiosis, there is evidence that genetic group can also interfere in resistance following the same pattern observed in the tick vector, with the taurine presenting greater sensitivity. This study aimed to evaluate parasitaemia by Babesia bovis and Babesia bigemina in 50 heifers Canchim (⅝ Charolais + ⅜ Zebu) naturally infested by R. (B.) microplus in four seasons for 24 months, and characterize the profile of cytokines that may be associated with phenotype resistance and susceptibility by gender hemoparasites Babesia spp. Adult female ticks counts with size equal to or greater than 4.5 mm in diameter, present in the left side of each calf were performed. The extracted DNA samples were subjected to amplification by Reaction Polymerase Chain Quantitative Real Time (qPCR), using primers flanking fragments of mitochondrial gene cytochrome B (mt-cyt B) specific for B. bovis and B. bigemina. The RNA extracted from the blood was used to synthesize complementary DNA (cDNA) for expression analysis of genes IFN-γ, TNF-α, IL-10 and IL-12B by relative quantification (RT-qPCR). Significant differences were observed (P <0.05) between the months of reviews for the tick count. However, there was no significant effect (P>0.05) in samples taken between november 2013 and january 2014 and between the months january and february 2015. The frequency of parasitaemia in the herd was 98%. Among the samples of DNA that could be quantified by qPCR, 98% and 95.4% were positive for B. bovis and B. bigemina, respectively. Regarding the number of copies (NC) of fragments of genes mt-cyt B, specific to B. bovis and B. bigemina significant effects were observed (P<0.05) for both species and interaction between those harvests in different seasons. Analysis of the mRNA expression level of IFN-γ, TNF-α and IL-12B showed that there was a significant effect (P<0.05) interaction between the animal extreme resistance/susceptibility and seasons, except for IL-10. It is concluded that the qPCR has high sensitivity and specificity for the diagnosis of bovine babesiosis in blood samples and that the fluctuation in the parasitic load in the different seasons of the year may be associated with the profile of cytokine expression presented by herd animals Canchim during the experimental period. / FAPESP: 2013/16246-9

Babesia bovis is a causative agent of bovine babesiosis and is transmitted by vector ticks, Rhipicephalus (Boophilus) spp. The disease has a high mortality rate in susceptible cattle, causing serious economic loss. At present, the only commercial vaccine is culture-based with limited availability. No effective molecular vaccine has been developed to date. Generating a vaccine with specific critical epitopes responsible for protection against B. bovis is critically important. Immunity against B. bovis requires both innate and adaptive responses, with antigen-specific CD4+ T cells essential to the latter through production of IFN-γ. Fourteen B. bovis proteins were selected as putative vaccine candidates and their full-length genes cloned for recombinant protein production intended for evaluating peripheral blood mononuclear cell IFN-γ secretion level from experimentally infected animals in ELISPOT. All proteins expressed in insoluble form (inclusion bodies) and could not be purified. B. bovis genes were then truncated to exclude signal peptide and transmembrane regions, then cloned and expressed using pET101/D-TOPO in Escherichia coli to obtain soluble, useable proteins. Only recombinant B. bovis MSA1, MSA2b and MSA2a1 proteins were successfully expressed in soluble form. These proteins induce invasion-blocking antibodies in immunized cattle, are hypothesized to elicit protection in susceptible animals, but were previously studied by others. Due to failure to produce new candidates to assay, the animal experiments were not performed. Instead, sera from field-infected cattle were assayed for reactivity against the MSA proteins by indirect immunofluorescent antibody (IFA) and western blot (WB) analysis. Field sera from South Texas (#41) and the Mexican Yucatan (#6, #9 and #11) along with positive and negative controls were tested. In IFA test, cattle #6, #9 and #41 were positive while #11 was negative. In WB, #41 and #6 reacted with the recombinant MSA proteins and with control B. bovis whole parasite lysate. However, both #11 and #9 had no signal in WB, although the latter was positive in IFA. Several theories may explain this phenomenon, such as the different preparation process of the antigen in the two tests, strain differences between sera and test antigens, or the different design and nature of each test.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-08T16:45:52Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1089558 bytes, checksum: 71f90b61d1b8e5726e713eaa43b87a19 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-08T16:45:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1089558 bytes, checksum: 71f90b61d1b8e5726e713eaa43b87a19 (MD5) Previous issue date: 2005-11-18 / Bovinos da raça holandesa entre 3-4 meses de idade receberam quatro imunizações subcutâneas com o peptídeo sintético SBbo23290 anti-Babesia bovis mais saponina, e foram desafiados com amostra virulenta de B. bovis, sendo avaliados quanto ao desenvolvimento da resposta imune celular. Para isso, foi determinado o perfil de linfócitos circulantes (CD4 + , CD8 + , CD21 + e WC1 + ) por citometria de fluxo e seguimento dos eventos microscópicos ocorridos em linfonodos através de técnicas diferenciais (Hematoxilina & Eosina e Verde Metil Pironina) e de imunohistoquímica (Peroxidase anti-peroxidase). Os estudos histológicos mostraram reatividade evidente de centros germinativos a partir do quinto dia após a primeira imunização. A hiperplasia dos cordões medulares foi mais evidente aos três dias após a terceira imunização. O antígeno SBbo23290 foi detectado em células SBbo23290 positivas durante todo o experimento, concomitantemente às alterações histológicas em órgãos linfóides. Quando foi determinada a composição fenotípica dos linfócitos de sangue periférico circulantes, observou-se no grupo peptídeo um aumento progressivo de linfócitos WC1+ até os sete dias após a segunda coleta, que decaiu ligeiramente após a terceira inoculação, aumentando novamente após o desafio com a amostra virulenta de B. bovis, o que não aconteceu com os demais grupos experimentais, havendo diferença estatística entre os grupos. Os linfócitos CD4 + e CD21 + decresceram após a primeira inoculação, aumentando após a segunda inoculação, e decaindo nas demais coletas, havendo diferença estatística entre os grupos. A porcentagem de linfócitos T totais no grupo peptídeo foi superior aos demais grupos durante quase todo o experimento, sendo que a maior porcentagem foi obtida após a segunda coleta, não havendo diferença estatística entre os grupos nas diferentes coletas. Sendo assim, pode-se concluir que o peptídeo sintético induz de maneira eficaz uma resposta imunológica antígeno- específica, na qual encontram-se envolvidos mecanismos celulares e humorais. / Tree-four month old bovines of the Holstein Freesan breed received four under–skin immunization of the synthetic peptideo 23290 anti-Babesia bovis plus saponina. They were challenged with an virulent sample of B. bovis and they were evaluated considering the development of the cellular immune answer through identification of CD4 + , CD8 + , CD21 + , and WC1 + T lymphocytes by flow citometry and microscopic evaluation of lymph nodes using the techniques H&E and Pironin Methil Green, such as PAP. The lymphonodes analysis demonstrated germinal centers reactivity at the 5 th day after the first immunization. Medullars cords hyperplasia was more evident three days after the third immunization. SBbo32290 antigen was detected in SBbo23290 positive cells during whole experiment, and simultaneous to the histology alterations in lymphonodes. Evaluating phenotypic composition of the peripheral blood lymphocytes, a progressive increase of WC1 + lymphocytes was detected, which decreased after third immunization, and an increment was observed again after the challenge. It was not observed in the another experimental groups. The CD4 + and CD21 + lymphocytes decreased after first immunization, increased after the second immunization, and decreased again in the following immunizations; the variation was statistically significant between the groups. The variation in total number of lymphocytes wasn’t statistically significant, although an increment of this cells was observed in the peptide group xvalmost whole experiment, comparing with the another groups. We can conclude that the syntetic peptideo induct an effective immunological specific-antigen answer, in with cellular and humoral mechanisms were involved.

Submitted by Cleber Casali (clebercasali@ufv.br) on 2017-06-28T16:56:14Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 636589 bytes, checksum: 1b3995e45fbf3303781d6ef784b350eb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-28T16:56:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 636589 bytes, checksum: 1b3995e45fbf3303781d6ef784b350eb (MD5) Previous issue date: 2001-06-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bovinos inoculados com amostra atenuada de Babesia bovis (Bbo UFV-1) foram avaliados quanto ao desenvolvimento da resposta imune, por meio de estudos histopatológicos e imunohistoquímicos de cortes de linfonodos superficiais. Os estudos histopatológicos mostraram ativação da resposta imune pela reatividade de centros germinativos a partir do 3o dia pós-vacinal, sendo mais acentuada entre os 9-12 dias após a primeira exposição ao antígeno. Após a re-inoculação houve um aumento no número de centros germinativos. Níveis maiores de atividade de síntese protéica foram detectados na região medular, em plasmócitos localizados nos cordões medulares, caracterizando a produção de imunoglobulinas. Foram detectados grupos de células em apoptose, principalmente, localizados nos centros germinativos e nos cordões medulares dos linfonodos dos animais inoculados, enquanto que no linfonodo do animal negativo estas células eram observadas em menor número e distribuídas isoladamente. Antígenos de B. bovis foram detectados em células dendríticas pelo método de PAP. Concomitantemente às alterações histopatológicas em órgãos linfóides periféricos, observou-se um aumento nos níveis séricos de IgG1 e IgG2. Através da dosagem e estudo da cinética de produção de IFN-γ, TNF-α e IL-12 avaliou-se a ativação de PBMCs cultivadas com peptídeos sintéticos e previamente estimuladas reconhecimento do com peptídeo amostra sintético atenuada 23290 por de B. células bovis. de O memória, estimulou a produção dos níveis mais elevados de IFN-γ, TNF-α e IL-12 no presente estudo, caracterizando-o como um potencial imunógeno contra B. bovis. / Bovine inoculated with attenuated sample of Babesia bovis (Bbo UFV-1) were appraised about the development of the immune response through histopathologics and immunohistochemistry studies of sections of superficial lymph nodes. The histopathologics studies showed activation of the immune response through the reactivity of germinal centers starting from the 3 rd day post-vaccinal, being more accentuated among the 9-12 days after the first exhibition to the antigen. After the re-inoculation there was an increase in the number of germinal centers. Larger levels of protein synthesis were detected in the medullar area, in plasmacytes located in the medullars cords, characterizing the immunoglobulin production. Groups of cells were detected in apoptosis, mainly located in the germinal centers and in the medullars cords of the lymph nodes of the inoculated animals, while in the lymph node of the bovine control, these cells were observed in smaller number and distributed separately. Antigens of B. bovis were detected in dendritic cells by the method of PAP. An increase in the serics levels of IgG1 and IgG2 was observed in parallel to the histopathologics alterations in secondary lymphoids tissues. The activation of PBMCs cultivated in the presence of synthetic peptides and previously stimulated with attenuated sample of B. bovis was evaluated through the quantify and study of the kinetics of production of IFN-γ, TNF-α and IL-12. The recognition of the synthetic peptide 23290 for memory cells stimulated the production of the largest levels of IFN-γ, TNF-α and IL-12 detected in the present work, characterizing it as a potential immunogen against B. bovis.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-12-16T08:30:10Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 958308 bytes, checksum: 9c5736945cebbeb560b27c1893c60060 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-16T08:30:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 958308 bytes, checksum: 9c5736945cebbeb560b27c1893c60060 (MD5) Previous issue date: 2014-03-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Tomando como base clones de Pichia pastoris transfretados com o gene desenhado a partir do peptídeo sintético SBbo23290, iniciou-se a produção do antígeno recombinante em leveduras Pichia pastoris. O material recuperado foi filtrado e concentrado em membranas de Amicon, com tamanho de filtro de 30 kDa e 3 kDa. Para garantir o máximo de proteína antigênica purificada, para ser usada em teste como candidato vacinal em Bovinos Bos taurus taurus com idade entre 8-12 meses, os quais receberam três imunizações subcutâneas com intervalo de 30 dias do peptídeo recombinante rBbo23290 mais saponina, 30 dias após da ultima imunização, os bovinos foram desafiados com amostra virulenta de B. bovis avaliando-se parâmetros clínicos como; hematócrito, parasitemia e temperatura, além do acompanhamento do desenvolvimento da resposta imune humoral, mediante quantificação de IgG total. Os parâmetros hematológicos e a temperatura foram analisados semanalmente durante o período de imunização, e diariamente a partir do 7o dia pós-desafio com o parasita. Os exames sorológicos foram realizados semanalmente durante todo o experimento, os resultados deste experimento demostraram que o peptídeo recombinante tem atividade imunogênica que foi comprovado com o incremento nos níveis de IgG total, mas na hora do desafio biológico evidenciou-se alguma possível falha na diluição do imunógeno ou uma alta dose na inoculação do parasita patogênico, o qual desenvolveu uma resposta diferente da esperada em alguns dos animais vacinados, mesmo assim conseguiu- se demostrar que o peptídeo recombinante possui atividade imunogênica, e pode ser considerado como um potente candidato vacinal para o controle da doença causada pela B. bovis. Precisam-se estudos adicionais para medir e quantificar o tipo de resposta produzida pela imunização, a dosificação ideal para obter a melhor resposta imune nos bovinos. Também, análise das variáveis físicas químicas e biológicas do peptídeo rBbo23290 para entender a influência do tipo e a intensidade da resposta imunológica dos animais no momento da inoculação e no desafio biológico. / Pichia pastoris clones expressing the synthetic peptide SBbo23290 were used to produce this recombinant antigen. The recombinant peptide rBbo 23290 with saponin was used to vaccinate bovines Bos taurus taurus. The animals were then challenged with virulent strain Babesia bovis. As clinical parameters were monitored: hematocrit, hemoglobine, parasitemy, and temperature. Furthermore, the IgG was quantified. Our results showed that some of the vaccinated animals presented an unexpected reaction. This could be due either to a mistake on the dilution of the peptide, or to an unproved higher inoculation of the pathogen strain. Nevertheless, it was demonstrated that our synthetic antigen was immunogenic, based on the increase total levels of IgG. Therefore, it could be considered as a candidate to control bovine babesiosis by B. bovis. Nonetheless, future research is needed to measure and quantify the response activated by the immunization. Furthermore, a suitable dose should be established, aiming to obtain an optimal immunological response. Moreover, it will be worthy to analyze physical, chemical, and biological parameters of this protein, which probably influence the immunological response of the animals.