Orientador: Janete Apparecida Desidério / Coorientador: Guilherme Duarte Rossi / Banca: Agda Paula Facincani / Banca: Ana Maria Guidelli Thuler / Resumo: Bacillus thuringiensis é uma bactéria que pode conferir patogenicidade a uma ampla variedade de insetos, e que possui fatores associados à mortalidade de insetos por B. thuringiensis, que foram identificados e são utilizados no controle de insetos-praga como, por exemplo, as toxinas Cry, Vip e Cyt. Novos genes de B. thuringiensis que possam estar envolvidos no processo de patogenicidade a insetos têm sido identificados, entre estes, as quitinases. Enzimas capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas entre as unidades de N-acetil-glicosamina da quitina, e aparecem como uma interessante opção por também mostrarem potencial para serem utilizadas no controle de pragas. No presente trabalho, realizou-se o isolamento e a caracterização de um gene de quitinase do isolado de B. thuringiensis I_555 (chi_I555) e a produção e caracterização parcial da quitinase (Chi_I555). A análise de chi_I555 indicou uma fase de leitura aberta de 2025 pares de bases que codificam uma proteína com 674 aminoácidos e peso molecular de 74,24 kDa. Análises bioinformáticas indicaram a presença de um sítio ativo de quitinase, de um domínio de fribronectina e de um domínio ligante de quitina na proteína Chi_I555. A expressão heteróloga de Chi_I555 resultou na produção de uma quitinase ativa sobre o substrato "Chitin Azure" em uma faixa ótima de pH próxima do neutro. A proteína Chi_I555 utilizada neste estudo é altamente promissora para o uso em construções de plantas geneticamente modificadas / Abstract: Bacillus thuringiensis is a bacterium that can confer pathogenicity to a wide variety of insects, and has associated with mortality of insects by B. thuringiensis factors that have been identified and are used to control insect pests such as the Cry toxins, Vip and Cyt. New genes of B. thuringiensis that may be involved in the pathogenic process of insects have been identified among these chitinases. Enzymes capable of hydrolyzing glycosidic linkages between the units of N-acetyl-glucosamine from chitin, and appear as an interesting option to also show potential for use in pest control. In this study, we carried out the isolation and characterization of a chitinase gene from B. thuringiensis isolate I_555 (chi_I555) and the production and partial characterization of a chitinase (Chi_I555). Chi_I555 analysis indicated an open reading frame of 2025 base pairs encoding a protein of 674 amino acids and a molecular weight of 74.24 kDa. Bioinformatics analysis indicated the presence of an active site of chitinase, a fribronectin domain and a chitin binding domain of the protein Chi_I555. Heterologous expression of Chi_I555 resulted in the production of an active chitinase on the substrate "Chitin Azure" in a great range of pH close to neutral. The Chi_I555 protein used in this study is highly promising for use in construction of genetically modified plants / Mestre

Thesis deals with advanced protection options against plum fruit mothCydia funebrana in organic and integrated production. A separate chapter is devoted to the characteristics, bionomy, the hosts plants and the importance of plum fruit moth. There are possibilities of monitoring and detection of the pest described in third chapter. The experimental part is devoted to comparison of productswith the active substance Bacillus thuringiensis var. kurstaki. There are two preparations compared Lepinox Plus and Biobit XL. The experiment was conducted in 2014 in a production orchard set in Brno Starý Lískovec. Product Lepinox Plusreached the highest efficiency.

AN ABSTRACT OF THE THESIS OF Katherine E. Strain, for the Master's degree in Zoology, presented on October 21, 2014, at Southern Illinois University Carbondale. TITLE: FATE AND TRANSPORT OF CRY1AB FROM TRANSGENIC BACILLUS THURINGIENSIS CORN IN AN AGRICULTURAL FIELD AND AQUATIC MICROCOSMS MAJOR PROFESSOR: Dr. Michael Lydy, Ph.D. Genetically-modified crops expressing insecticidal crystalline proteins derived from a soil bacterium, Bacillus thuringiensis (Bt), were commercialized almost two decades ago as a means to combat agricultural pests. The Bt proteins are highly specific and only lethal upon ingestion, limiting the scope of toxicity to target insects. However, evidence for risk to non-target organisms and negative public perceptions on the use of Bt crops has caused controversy surrounding their use. The objective of this research was to monitor the fate and transport of a Bt protein, Cry1Ab, in a large-scale agricultural field and in aquatic microcosms. Quantitative methods were validated using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and then used to evaluate field and laboratory samples. The highest environmental concentrations of the Cry1Ab protein were found in runoff water and sediment, up to 130 ng/L and 143 ng/g dry weight, respectively, with the Cry1Ab protein detected in both Bt and non-Bt fields. As surface runoff and residual crop debris can transport Bt proteins to waterways adjacent to agricultural fields, a series of laboratory experiments were conducted to determine the potential risk to non-target aquatic organisms. The results showed that sediment type and temperature can influence the degradation of the Cry1Ab protein in an aquatic system and that the Cry1Ab protein can persist for two months. While Cry1Ab protein concentrations measured in the field soil indicate little risk to terrestrial organisms, the consistent input of Bt-contaminated runoff and crop debris into agricultural waterways impart chronic risk to non-target aquatic species.

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-18Bitstream added on 2015-03-03T12:07:12Z : No. of bitstreams: 1 000811933_20151218.pdf: 96939 bytes, checksum: 04a99a8168a4d1d45d4874efe4f2b497 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-12-18T13:57:58Z: 000811933_20151218.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-18T13:58:36Z : No. of bitstreams: 1 000811933.pdf: 896821 bytes, checksum: d95843628c2f7f0cc36797c46e5efaf7 (MD5) / Bacillus thuringiensis é uma bactéria que pode conferir patogenicidade a uma ampla variedade de insetos, e que possui fatores associados à mortalidade de insetos por B. thuringiensis, que foram identificados e são utilizados no controle de insetos-praga como, por exemplo, as toxinas Cry, Vip e Cyt. Novos genes de B. thuringiensis que possam estar envolvidos no processo de patogenicidade a insetos têm sido identificados, entre estes, as quitinases. Enzimas capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas entre as unidades de N-acetil-glicosamina da quitina, e aparecem como uma interessante opção por também mostrarem potencial para serem utilizadas no controle de pragas. No presente trabalho, realizou-se o isolamento e a caracterização de um gene de quitinase do isolado de B. thuringiensis I_555 (chi_I555) e a produção e caracterização parcial da quitinase (Chi_I555). A análise de chi_I555 indicou uma fase de leitura aberta de 2025 pares de bases que codificam uma proteína com 674 aminoácidos e peso molecular de 74,24 kDa. Análises bioinformáticas indicaram a presença de um sítio ativo de quitinase, de um domínio de fribronectina e de um domínio ligante de quitina na proteína Chi_I555. A expressão heteróloga de Chi_I555 resultou na produção de uma quitinase ativa sobre o substrato “Chitin Azure” em uma faixa ótima de pH próxima do neutro. A proteína Chi_I555 utilizada neste estudo é altamente promissora para o uso em construções de plantas geneticamente modificadas / Bacillus thuringiensis is a bacterium that can confer pathogenicity to a wide variety of insects, and has associated with mortality of insects by B. thuringiensis factors that have been identified and are used to control insect pests such as the Cry toxins, Vip and Cyt. New genes of B. thuringiensis that may be involved in the pathogenic process of insects have been identified among these chitinases. Enzymes capable of hydrolyzing glycosidic linkages between the units of N-acetyl-glucosamine from chitin, and appear as an interesting option to also show potential for use in pest control. In this study, we carried out the isolation and characterization of a chitinase gene from B. thuringiensis isolate I_555 (chi_I555) and the production and partial characterization of a chitinase (Chi_I555). Chi_I555 analysis indicated an open reading frame of 2025 base pairs encoding a protein of 674 amino acids and a molecular weight of 74.24 kDa. Bioinformatics analysis indicated the presence of an active site of chitinase, a fribronectin domain and a chitin binding domain of the protein Chi_I555. Heterologous expression of Chi_I555 resulted in the production of an active chitinase on the substrate Chitin Azure in a great range of pH close to neutral. The Chi_I555 protein used in this study is highly promising for use in construction of genetically modified plants

Resumo: A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Biologia e Criação de Insetos (LBCI) e no Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada (LGBBA) da FCAV-UNESP,Campus de Jaboticabal, SP. O objetivo geral foi selecionar novos isolados de Bacillus thuringiensis através da caracterização molecular, identificando as diferentes subclasses do gene cry1, determinar a patogenicidade contra lagartas de Plutella xylostella e avaliar a influência no ciclo biológico da praga. Foram utilizados 95 isolados de B. thuringiensis obtidos da coleção do LGBBA. O material genético foi extraído pela matriz de troca iônica "Kit Instagene Matrix" e submetido a PCR com iniciadores gerais para o gene cry1 e específicos para as subclasses. Realizaram-se bioensaios com 58 isolados, um controle positivo com a linhagem padrão HD-1 B. thuringiensis var. kurstaki, um controle negativo com B. thuringiensis var. tenebrionis e água com espalhante adesivo, como testemunha. O conteúdo das subclasses estudadas para o gene cry1 foi determinado para 58 isolados, o que representa 60% do total. Dentre os 95 isolados estudados, 27,4% demonstraram que o conjunto gênico cry1Aa, cry1Ca, cry1Da, cry1Fa e cry1Bd é a freqüência mais comum. Dos 58 isolados testados, 11 causaram mortalidade total das lagartas e os demais influenciaram negativamente o ciclo biológico da praga. Dentre as características avaliadas, a mortalidade larval e a pupal, bem como a duração larval foram as mais relevantes para se determinar quais isolados influenciaram a biologia da praga. Portanto, os isolados que causaram 100% de mortalidade larval têm grande potencial para formulação de produtos comerciais a serem utilizados em programas de manejo integrado de P. xylostella. / Abstract: The research was developed in the Laboratório de Biologia e Criação de Insetos (LBCI) and in the Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada (LGBBA) at the FCAV-UNESP-Campus de Jaboticabal, SP. The general objective was to select new strains of Bacillus thuringiensis through the molecular characterization, identifying the different subclasses of the gene cry1, to determine the patogenicity against caterpillars of Plutella xylostella and to evaluate the influence in the pest biological parameters. It was used 95 isolated of B. thuringiensis obtained of the collection of LGBBA. The genetic material was extracted by the head office of change ionic "Kit Instagene Matrix" and submitted to PCR with general initiators for the gene cry1 and specific for the subclasses. Bioassays were made using 58 strains of B. thuringiensis, a positive control with var. tenebrionis and water was used with adhesive spreader Tween20®, as a standard the strains HD1 from B. thuringiensis var. kurstaki, a negative control with B. thuringiensis check. The content of the subclasses studied for the gene cry1 was determined for 58 isolated, what represents 60% of the total. Among the 95 isolated studied, 27,4% demonstrated that the genic group cry1Aa, cry1Ca, cry1Da, cry1Fa and cry1Bd is the most common frequency. Total mortality of caterpillars was observed in 11 of studied strains and the remainders affected negatively pest biological lifecycle. Larvae and pupae mortality, and larvae period were more relevants parameters to determine which isolates affect P. xylostella biology. In this way, the isolates caused 100 % larval mortality have higher potential for development a commercial bioinseticide to use in Plutella xylostella integrated pest management programs. / Orientador: Sérgio Antonio de Bortoli / Coorientador: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Luis Garrigós Leite / Banca: Nilza Maria Martinelli / Mestre

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Eduardo Cleto Pires / Banca: Celso Omoto / Resumo: A bactéria Bacillus thuringiensis é conhecida como uma das melhores opções no controle biológico de pragas devido à ação entomopatogênica e especificidade de suas proteínas. As proteínas Vip3, que são secretadas durante o crescimento vegetativo de B. thuringiensis e Cry1, que são produzidas durante a fase de esporulação, atuam no controle de importantes pragas de lepidópteros. Um dos principais riscos ambientais associados à utilização de inseticidas é o potencial para o desenvolvimento de graus crescentes de resistência pelas pragas alvo. O uso de diferentes proteínas entomopatogênica produzidos por B. thuringiensis, bem como os estudos que envolvem suas interações podem ajudar a superar o desenvolvimento de pragas resistentes. As proteínas utilizadas neste estudo foram preparadas a partir de estirpes recombinantes de Escherichia coli que expressam uma única toxina. Para a expressão das proteínas Cry1 células recombinantes foram inoculadas em meio TB com ampicilina e incubadas por 60 h a 28 oC. Enquanto que para a expressão de Vip3Aa o inóculo foi feito em meio LB (2x) e ampicilina, e induzidas com IPTG durante a incubação por 12 h sob agitação de 190 rpm, mantidas a 37 oC. As proteínas foram ativadas utilizando 10% de tripsina comercial, e visualizadas em gel SDS-PAGE 12%. Os bioensaios foram realizados com dieta artificial semissólidas artificial adicionadas em bandejas de poliestireno de 128 poços de 1 cm de diâmetro. Cinquenta microlitros das toxinas ativadas foram espalhados sobre a superfície da dieta artificial e para cada concentração de proteína foram reproduzidos 4 repetições. Dezesseis lagartas no primeiro instar de Spodoptera frugiperda foram utilizadas para a adição de um total de 64 larvas para cada concentração de proteína... / Abstract: Bacillus thuringiensis is kwon as one of the best options for biological control of pests due to the entomophotogenic and specific action of some of its proteins. The Vip3 proteins, that are secreted during the vegetative growth of B. thuringiensis and Cry1, which are produced during the sporulation phase, act controlling important lepidopteran pests. One of the most important environmental risks associated to the use of insecticides is the potential for the development of increasing degrees of resistance by the target pests. The use of different entomopathogenic proteins produced by B. thuringiensis, as well as the studies involving their interactions might help overcoming the development of resistant pests. The proteins used in this study were prepared from recombinant Escherichia coli strains expressing a sole toxin. For the expression of the Cry1 proteins, the recombinant cells were inoculated in TB broth containing ampicillin and incubated at 28ºC during 60 h. While for the expression of the Vip3Aa protein the culture was made using LB 2X broth also containing ampicillin and induced with IPTG during incubation for 12 h at 190 rpm kept at 37ºC. The proteins were activated using 10% commercial trypsin, and observed on 12% SDS-PAGE gels. The bioassays were carried out using artificial semi-solid diet added to polystyrene trays with 128 wells measuring 1 cm of diameter. Fifty microliters of activated toxins were spread over the surface of the artificial diet contained wells and for each protein concentration, four repetitions were reproduced. Sixteen Spodoptera frugiperda first instar larvae were used adding to a total of 64 larvae for each protein concentration... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-29Bitstream added on 2014-06-13T20:11:55Z : No. of bitstreams: 1 000737270.pdf: 1006873 bytes, checksum: ca3c40d5b7f6e5b3f636fbe27cab0376 (MD5) / A bactéria Bacillus thuringiensis é conhecida como uma das melhores opções no controle biológico de pragas devido à ação entomopatogênica e especificidade de suas proteínas. As proteínas Vip3, que são secretadas durante o crescimento vegetativo de B. thuringiensis e Cry1, que são produzidas durante a fase de esporulação, atuam no controle de importantes pragas de lepidópteros. Um dos principais riscos ambientais associados à utilização de inseticidas é o potencial para o desenvolvimento de graus crescentes de resistência pelas pragas alvo. O uso de diferentes proteínas entomopatogênica produzidos por B. thuringiensis, bem como os estudos que envolvem suas interações podem ajudar a superar o desenvolvimento de pragas resistentes. As proteínas utilizadas neste estudo foram preparadas a partir de estirpes recombinantes de Escherichia coli que expressam uma única toxina. Para a expressão das proteínas Cry1 células recombinantes foram inoculadas em meio TB com ampicilina e incubadas por 60 h a 28 oC. Enquanto que para a expressão de Vip3Aa o inóculo foi feito em meio LB (2x) e ampicilina, e induzidas com IPTG durante a incubação por 12 h sob agitação de 190 rpm, mantidas a 37 oC. As proteínas foram ativadas utilizando 10% de tripsina comercial, e visualizadas em gel SDS-PAGE 12%. Os bioensaios foram realizados com dieta artificial semissólidas artificial adicionadas em bandejas de poliestireno de 128 poços de 1 cm de diâmetro. Cinquenta microlitros das toxinas ativadas foram espalhados sobre a superfície da dieta artificial e para cada concentração de proteína foram reproduzidos 4 repetições. Dezesseis lagartas no primeiro instar de Spodoptera frugiperda foram utilizadas para a adição de um total de 64 larvas para cada concentração de proteína... / Bacillus thuringiensis is kwon as one of the best options for biological control of pests due to the entomophotogenic and specific action of some of its proteins. The Vip3 proteins, that are secreted during the vegetative growth of B. thuringiensis and Cry1, which are produced during the sporulation phase, act controlling important lepidopteran pests. One of the most important environmental risks associated to the use of insecticides is the potential for the development of increasing degrees of resistance by the target pests. The use of different entomopathogenic proteins produced by B. thuringiensis, as well as the studies involving their interactions might help overcoming the development of resistant pests. The proteins used in this study were prepared from recombinant Escherichia coli strains expressing a sole toxin. For the expression of the Cry1 proteins, the recombinant cells were inoculated in TB broth containing ampicillin and incubated at 28ºC during 60 h. While for the expression of the Vip3Aa protein the culture was made using LB 2X broth also containing ampicillin and induced with IPTG during incubation for 12 h at 190 rpm kept at 37ºC. The proteins were activated using 10% commercial trypsin, and observed on 12% SDS-PAGE gels. The bioassays were carried out using artificial semi-solid diet added to polystyrene trays with 128 wells measuring 1 cm of diameter. Fifty microliters of activated toxins were spread over the surface of the artificial diet contained wells and for each protein concentration, four repetitions were reproduced. Sixteen Spodoptera frugiperda first instar larvae were used adding to a total of 64 larvae for each protein concentration...

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-07T14:18:13Z No. of bitstreams: 1 2014_FlaviaSantanaSouzadaCosta.pdf: 5304298 bytes, checksum: 0aa869b4cb44917de0cfb5dfa7dc8eb7 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-11-11T09:54:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_FlaviaSantanaSouzadaCosta.pdf: 5304298 bytes, checksum: 0aa869b4cb44917de0cfb5dfa7dc8eb7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-11T09:54:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_FlaviaSantanaSouzadaCosta.pdf: 5304298 bytes, checksum: 0aa869b4cb44917de0cfb5dfa7dc8eb7 (MD5) / Bioinseticidas à base de B. thuringiensis (Bt) são os mais comercializados e conhecidos emtodo o mundo por seu potencial no controle de insetos-praga. Porém seu efeito comoorganismo endofítico e promotor de crescimento são pouco estudados. Para avaliação dessesefeitos, foram realizados testes iniciais para verificar a ação de Bt sobre o crescimentovegetativo de plantas de algodão a partir da seleção de quatro estirpes de Bt (S1450, S1905,S2122 e S2124) por sua atividade tóxica sobre insetos da ordem Lepidoptera, três genótiposde algodão (BRS 8H, BRS Aroeira e BRS 286) e dois métodos de inoculação (via semente evia planta) em casa de vegetação. Os parâmetros analisados foram: germinação, altura,número de folhas, massa seca da parte aérea e radicular e comprimento de raiz. Ao final doexperimento as plantas foram oferecidas a larvas de S. frugiperda para avaliar a mortalidade.Com base nas análises dos resultados de eficiência em altura, massa seca e número de folhas,foi possível selecionar a estirpe S2122, a cultivar BRS 8H e o método de inoculação emsementes. Um segundo ensaio foi, então, planejado para dar continuidade dos estudos comdiferentes concentrações da estirpe S2122 de Bt e observação dos mesmos parâmetros. A cadasemana foi realizado um bioensaio oferecendo folhas destes tratamentos para larvas de S.frugiperda. Os resultados dos testes iniciais permitiram a conclusão de que o método deinoculação mais eficiente na promoção de crescimento de plantas de algodão foi via sementese que diferentes estirpes possuem padrões de interações diferenciados para determinadacultivar. Na segunda parte do trabalho, os resultados dos experimentos apresentaramdiferenças estatísticas na concentração 108 UFC/mL, mostrando incremento no crescimentovegetal das plantas de algodão e na produção de fitomassa. Embora tenha sido verificadabaixa mortalidade das lagartas nos bioensaios realizados semanalmente, as lagartas que sealimentaram de folhas dos tratamentos com Bt exibiram sintomas de intoxicação comaparência debilitada. Provavelmente as larvas destes insetos se alimentaram da proteínatóxica, porém em concentrações sub-letais. Estes sintomas de intoxicação foram observadosaté dezoito dias após a emergência das plantas. __________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bioinsecticides based on B. thuringiensis (Bt) are the most commercialized and well-knownones worldwide due to their potential for controlling insect pests. However, their effects as anendophytic organism and growth promoter have scarcely been studied. To evaluate theseeffects, initial tests were carried out to verify the action of Bt on the vegetative growth ofcotton plants, from the selection of four strains of Bt (S1450, S1905, S2122 and S2124), fortheir toxic activity on insects of the order Lepidoptera, using three cotton genotypes (BRS 8H,BRS Aroeira and BRS 286) and two methods of inoculation (via seed and via plant) in agreenhouse. The parameters analyzed were: germination, height, number of leaves, dry massof the aerial and root parts and length of the root. At the end of the experiment the plants wereoffered to larvae of S. frugiperda to evaluate the mortality rate. Based on the analyses of theresults for efficiency in terms of height, dry mass and number of leaves, it was possible toselect strain S2122, cultivar BRS 8H and the method of seed inoculation. A second assay wasthen planned, to continue the studies with different concentrations of strain S2122 of Bt andobservation of the same parameters. A bioassay was carried out each week, offering leavesfrom these treatments to larvae of S. frugiperda. The results of the initial tests led to theconclusion that the most efficient inoculation method in promoting cotton plant growth wasvia seeds, and that different strains have different patterns of interaction for each cultivar. Inthe second part of the work, the experimental results presented statistical differences at aconcentration of 108 UFC/mL, showing an increase in vegetative growth of cotton plants andin the production of plant mass. Although low mortality was seen for larvae in the weeklybioassays, those that fed on the leaves of treatments with Bt exhibited symptoms ofintoxication and a debilitated appearance. The larvae of these insects probably fed on the toxicprotein, but in sub-lethal concentrations. These symptoms of intoxication were observed until18 days after the plants emerged.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-22T12:36:21Z No. of bitstreams: 1 2012_IngriddeSouzaFreire.pdf: 4672884 bytes, checksum: eb0ae147522c3726ce9dce8103ff2c88 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-25T10:46:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_IngriddeSouzaFreire.pdf: 4672884 bytes, checksum: eb0ae147522c3726ce9dce8103ff2c88 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-25T10:46:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_IngriddeSouzaFreire.pdf: 4672884 bytes, checksum: eb0ae147522c3726ce9dce8103ff2c88 (MD5) / Os esporos-cristais de Bacillus thuringiensis (Bt) têm sido usados no controle biológico de insetos como uma alternativa para o uso de agrotóxicos na agricultura. As δ-endotoxinas, ou proteínas Cry do B. thuringiensis, possuem atividade inseticida para diferentes ordens de insetos. Mesmo como esporos-cristais, já apresentaram toxicidade e têm sido usadas para proteger diferentes culturas. Objetivou-se avaliar o potencial genotóxico, citotóxico e hematotóxico do complexo esporo-cristal das estirpes recombinantes contendo os genes BtCry1Ia, BtCry10Aa e BtCry1Ba6 de Bacillus thuringiensis, em dois organismos não-alvo. Com esporos-cristais dessas estirpes recombinantes foram realizados três concentrações/doses nos tratamentos com peixe e com camundongo, incluindo um grupo de controle negativo para ambos organismos. Grupos de 10 Oreochromis niloticus, foram expostos às concentrações de 25, 50 e 100 mg/L, que variaram de 107 a 9 x 107 esporos viáveis por mL por 96 horas. Grupos de 6 camundongos foram expostos via gavagem as concentrações de 27, 136 e 270 por 72 horas com variações de 4 x 108 a 1010 esporos viáveis. A genotoxicidade em peixes foi realizada por meio de três diferentes testes, o teste do cometa, micronúcleo e anomalias nucleares em eritrócitos periféricos corados com giemsa. A genotoxicidade em camundongos foi avaliada pelo teste do micronúcleo, a citotoxicidade através da proporção entre eritrócitos policromáticos e normocromáticos, obtidos de sangue periférico e corados com laranja de acridina. A hematotoxicidade foi estudada por meio de hemograma completo. Nossos resultados mostraram que os esporos-cristais Cry1Ba6 e Cry10Aa não foram genotóxicos para peixes da espécie O. niloticus. Entretanto, o esporo-cristal Cry1Ia induziu dano no DNA por meio do teste do cometa elevando o índice de danos moderados. Em camundongos, esses esporos-cristais não apresentaram genotoxicidade e citotoxicidade. No entanto, alguns dos parâmetros hematológicos foram significativamente alterados, o que parece estar relacionado com os níveis de exposição. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Spore-crystal of Bacillus thrungiensis have been widely used in the biological control of insects to replace chemical pesticides in the agriculture. The δ-endotoxins or cry proteins from B. thuringiensis have insecticide activity against several different ordens of insects. Even as spore-crystal, they already show toxicity being used to protect many different crops. This study was carried out to evaluate the genotoxic, cytotoxic and haematotoxic potential of different recombinant strains of the complex spore-crystal BtCry1Ia, BtCry10Aa and BtCry1Ba6 from B. thuringiensis on two in vivo biological models. Groups of ten Orechromis niloticus were exposed at concentrations of 25, 50 and 100 mg/L, which means a range from 107 up to 9 x 107 viable spores per ml of water for 96 h. Groups of six mice were exposed by gavage at concentrations of 27, 136 and 270 mg/kg for 72h, which means a range from 4 x 108 up to 1010 viable spores per ml of water. Genotoxic evaluations in fish were done using three different endpoints comet assay, micronucleus test and nuclear abnormalities in peripheric erythrocytes stained by giemsa. Otherwise, the genotoxicity to mice was evaluated by micronucleus test and cytotoxicity through the relationship between polychromatic and normochromatic erythrocytes from peripheric blood stained by acridine orange. Haematotoxicity was studied through automated counter, considering erythrogram, leukogram and platelets from peripheral blood samples. Our results showed that spore-crystals Cry1Ba6 and Cry10Aa did not have genotoxicity to fish species O. niloticus. On the other hand, Cry1Ia induced DNA damage by the comet assay in some exposure levels. In mice, the three tested spore-crystals did not show genotoxicity nor cytotoxicity. However, some haematological parameters were significantly changed, which could be related to exposure levels.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, 2011. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-06-28T17:22:11Z No. of bitstreams: 1 2011_ElenydaSilvaPereiraParcial.pdf: 2516567 bytes, checksum: 6cf3030518b1d439700429c77bd12058 (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-06-30T16:21:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_ElenydaSilvaPereiraParcial.pdf: 2516567 bytes, checksum: 6cf3030518b1d439700429c77bd12058 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-30T16:21:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_ElenydaSilvaPereiraParcial.pdf: 2516567 bytes, checksum: 6cf3030518b1d439700429c77bd12058 (MD5) / Os simulídeos pertencem a uma família de dipteros, Simuliidae, com ampla diversidade. Por ser um grupo recente na escala dos tempos geológicos, muitas espécies podem ser crípticas e/ ou espécies irmãs. Dentre as muitas espécies já conhecidas algumas possuem interesse econômico abrangendo as áreas médica, agrícola, veterinária e da indústria turística. Algumas espécies podem ser vetoras de agentes etiológicos causadores de doenças como o Simulium damnosum, vetor da oncocercose na África. Outras importunam o homem e animais de criação como Simulium pertinax no Brasil. Muitas dessas espécies de interesse econômico pertencem a complexos de espécies, que possuem algumas similaridades entre si. Mapear a fauna de Simullidae de um determinado lugar é importante para se tentar conhecer espécies semelhantes as espécies de interesse econômico ou ainda pra tentar incrementar as informações existentes das espécies já identificadas e nomeadas. Alguns estudos taxonômicos e de sistemática tem sido realizados para relacionar espécies próximas principalmente às de interesse para o controle. Dependendo dos resultados dos diferentes estudos essas espécies “próximas” podem ser elevadas à categoria de mesma espécie ou separadas em espécies distintas. Para essa separação é necessário o uso de chaves taxonômicas onde os caracteres morfológicos de larvas, pupas e do adulto são comparados. Algumas vezes, entretanto, somente por esses caracteres não é possível a separação dessas espécies. Com isso se faz necessário o uso de marcadores moleculares, dentre os quais, os dos genes do DNA mitocondrial. O gene COX I tem sido usado para se mapear essas espécies. No Brasil, uma das formas de controle de S. pertinax tem sido realizada com a bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis subs. israelensis. Neste trabalho, de 96 estirpes isoladas a partir de amostras de solos oriundos da Amazônia duas estirpes S2271 e S2272 foram tóxicas a larvas de Simulium sp. A caracterização bioquímica e molecular das duas estirpes mostrou que ambas apresentavam amplicons correspondentes aos genes cry4A, cry4B, cry10, cry11, cyt1 e cyt2, e proteínas de 130kDa, 72kDa e 30kDa sendo compatível com as proteínas Cry4A e Cry4B (130kDa), Cry10 e Cry11 (72kDa) e Cyt1 e Cyt2 (30kDa) semelhante ao Bacillus thuringiensis israelensis, S1806, utilizado como padrão. A toxicidade das proteínas produzidas pelo B. thuringiensis israelensis foram testadas individualmente e em conjunto. Foi verificado que a proteína Cry4B apresentou maior toxicidade, no entanto, todas as toxinas juntas apresentam sinergismo, sendo, portanto a melhor forma para o controle do inseto. Exemplares de borrachudos foram coletados em 71 córregos do Distrito Federal e Goiás e foram identificados perfazendo um total de 22 espécies: Simulium dekeyseri, S. pertinax, S. serranum, S. spinibranchium, S. subpallidum, S. dinellii, S. brachycladum, S. lobatoi, S. rubrithorax, S. botulibranchium, S. inaequale, S. rappae, S. subnigrum, S. exiguum, S. anamariae, S. jujuyense, S. ochraceum, S. lutzianum, S. perflavum, S. rorotaense, S. hirtipupa, S. nigrimanum, dessas 10 espécies foram registradas pela primeira vez, na área de estudo (S. serranus, S. dinellii, S. brachycladum, S. botulibranchium, S. anamariae, S. ochraceum, S. lutzianum, S. perflavum, S. rorotaense e S. hirtipupa). Uma chave de identificação com estas espécies foi confeccionada para auxiliar estudos nestas áreas de estudo. Além disso, diferentes populações de S. pertinax identificadas nas coletas e outras, coletadas previamente em outros estados brasileiros (Pará, Mato Grosso, Rio Grande do Sul, São Paulo, Distrito Federal, Goiás e Rondônia) foram caracterizadas molecularmente através do gene Citocromo Oxidase I do DNA mitocondrial. Destas populações, três indivíduos de cada estado foram separados para o estudo intra e interpopulacional. Entre as populações e entre os indivíduos de uma mesma população de S. pertinax, não houve diferenças gênicas significativas entre estas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Black flies are dipteran insects, from Simuliidae family and possess a wide diversity. Being a group in recent geologic time scale, many species are cryptic and/or sister species. Among many known species, some have economic interest, like in the medical, agricultural, veterinary and tourism industry. Some species are vectors of etiologic agents of diseases such as Simulium damnosum, vector of onchocerciasis in Africa. Others disturb the man and livestock as Simulium pertinax in Brazil. Many of these species of economic interest belong to species complexes that have some similarities. Map Simullidae fauna of a place is important to try to know the rate of similarity between species of economic interest or to try and improve the existing information of species already identified and named. Some taxonomic and systematic studies have been conducted to relate closely related species of mainly interest for the control. Depending on the results of different studies these species are "close" can be elevated to the category of the same species or separated into distinct species. For such separation is necessary to use taxonomic keys where the morphological characters of larvae, pupae and adults are compared. Sometimes, however, only through these characters is not possible to separate these species. Thus it is necessary the use of molecular markers, among which the genes of mitochondrial DNA. The COX I gene has been used to map these species. In Brazil, one of the ways to control S. pertinax has been conducted with the entomopathogenic bacterium Bacillus thuringiensis subs. israelensis. In this work, of 96 strains isolated from soil samples from the Amazon two new strains S2271 e S2272 of these bacteria were toxic to larvae of Simulium spp. The biochemical and molecular characterization of two strains showed that both had amplicons corresponding to genes cry4A, cry4B, cry10, cry11, cyt1 and cyt2, and proteins 130kDa, 72kDa e 30kDa is compatible with protein Cry4A e Cry4B (130kDa), Cry10 e Cry11 (72kDa) and Cyt1 e Cyt2 (30kDa) similar to Bacillus thuringiensis israelensis, S1806, used as standard. The toxicity of the proteins produced by B. thuringiensis israelensis was tested individually and together. It was found that protein Cry4B showed higher toxicity, however, all toxins together have synergistic toxins, making it the best way to control this insect. Samples of blackflies were collected in 71 rivers in Goiás and Distrito Federal and they were identified a total of 22 species: Simulium dekeyseri, S. pertinax, S. serranum, S. spinibranchium, S. subpallidum, S. dinellii, S. brachycladum, S. lobatoi, S. rubrithorax, S. botulibranchium, S. inaequale, S. rappae, S. subnigrum, S. exiguum, S. anamariae, S. jujuyense, S. ochraceum, S. lutzianum, S. perflavum, S. rorotaense, S. hirtipupa, S. nigrimanum, these 10 species were recorded for the first time in the study area (S. serranus, S. dinellii, S. brachycladum, S. botulibranchium, S. anamariae, S. ochraceum, S. lutzianum, S. perflavum, S. rorotaense e S. hirtipupa). An identification key to these species was made to aid research in these areas. Furthermore, different populations of S. pertinax identified in the collections and other previously collected in other Brazilian states (Pará, Mato Grosso, Rio Grande do Sul, São Paulo, Distrito Federal, Goiás e Rondônia) were characterized molecularly through mitochondrial DNA COX I gene. These populations, three individuals from each state were separated for studying intra-and inter. Among populations and among individuals within populations of S. pertinax, no genetic differences between them.