Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-02T13:00:39Z No. of bitstreams: 1 2015_DiogoMartinsdeSá.pdf: 8864026 bytes, checksum: 31e06adc819c9c1f38cd303d53cd3d41 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-03-02T20:41:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_DiogoMartinsdeSá.pdf: 8864026 bytes, checksum: 31e06adc819c9c1f38cd303d53cd3d41 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-02T20:41:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_DiogoMartinsdeSá.pdf: 8864026 bytes, checksum: 31e06adc819c9c1f38cd303d53cd3d41 (MD5) / O Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram positiva pertencente ao grupo Bacillus cereus, mas se distingue de outras espécies deste grupo por produzir, durante a esporulação, inclusões cristalinas contendo predominantemente uma ou mais proteínas de ação inseticida (toxinas Cry e Cyt), também chamadas de δ-endotoxinas. Por definição, toxinas Cry exibem toxicidade experimentalmente verificável a um organismo alvo, ou possuem similaridade significativa de sequencia à uma toxina Cry já descrita. A toxicidade de Cry1Ab é amplamente relatada para larvas da mariposa Manduca sexta e estudos indicam que o domínio II é responsável pelo reconhecimento específico dessa toxina ao receptor no intestino do inseto. Cry1Aa, Cry1Ab e Cry1Ac possuem 82 a 90% de identidade de resíduos de aminoácidos e a interação dessas proteínas com receptores primários do tipo caderina é descrita como um importante passo para a correta remoção da α-hélice 1 no domínio I e subsequente desencadeamento de eventos que levam à morte do inseto. Usando-se de modelagem por homologia e docking molecular, foram selecionados dois modelos descrevendo as interações entre o receptor de M. sexta, BT-R1, e a toxina Cry1Ab. Estes modelos foram submetidos à simulações por dinâmica molecular clássica e avaliados quanto a diversos aspectos de sua estrutura. Um total de 12 blocos de interação foram identificados para cada proteína e estudados quanto às suas propriedade biofísicas, cada qual constituído por uma região da sequência de aminoácidos de suas respectivas proteínas. As medidas de RMSD ao fim da dinâmica mostraram que os sítios de ligação ao receptor apresentam deformações menores que próprio receptor, indicando que a ligação à Cry1Ab estabiliza estas regiões. Mais que isso, os termos intermoleculares de energia de curta distância mostraram um declínio contínuo e uma tendência de atração entre as duas proteínas. Todas as ligações de hidrogênio e pontes salinas foram mapeadas e caracterizadas de acordo com sua persistência e distância média durante a dinâmica. Por último, foi avaliado o potencial eletrostático de cada bloco de interação, o que permitiu inferir as regiões que direcionam a ligação específica da toxina ao receptor. Para validar os modelos, foram sintetizados peptídeos correspondendo a cada bloco de interação para uma análise qualitativa utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR). Resultados preliminares de um dos modelos mostram que o loop 3, notório por sua função no reconhecimento ao receptor, é capaz de ligar-se a uma região nunca antes relatada dos receptores tipo caderina. Essa nova região possui um perfil de hidropaticidade similar ao do epitopo de um anticorpo específico ao loop 3 e, quando comparamos medidas entre pH 7,4 e pH 9,0 em experimentos de SPR, é possível observar uma ligação de mesma intensidade entre essas duas regiões usando-se 266 vezes menos concentração de analito em pH básico. O pH fisiológico do intestino de M. sexta é aproximadamente 9,0, o que indica que um dos modelos é capaz de reproduzir aspectos da interação in vivo. O prosseguimento deste trabalho, através de técnicas in silico e experimentos in vitro, deve indicar se ambos modelos são plausíveis de ocorrer, ou se um dos modelos é preterido. No geral, esses modelos permitiram observar o comportamento da toxina enquanto ligada ao receptor e contribuem para o entendimento de muitos dos experimentos in vitro realizados envolvendo as toxinas da família Cry1A e os receptores tipo caderina. / Cry1Ab is widely described as toxic to Manduca sexta larvae and extensive substitution of loop residues in domain II suggests that this region is responsible for specific binding to receptor. Cry1Aa, Cry1Ab, and Cry1Ac share 82 to 90% amino acid residue identity to one another and their interaction with cadherin-like receptors has been described as an important step for the correct removal of alpha-helix1 in domain I and subsequent events leading to the insect's death. After homology modeling and a selective protein docking, two models describing the interactions of Cry1Ab to the M. sexta cadherin-like receptor, BT-R1, were assessed using molecular dynamics simulations. A total of 12 binding regions were identified for each protein and their biophysical properties were further evaluated. Binding sites in the receptor were shown to have lower RMSD measures than the entire receptor, indicating that the binding of Cry1Ab stabilizes these regions. Also, Van der Waals and Coulomb short-range energy terms were measured for the receptor-toxin complex and showed an attraction tendency, with decreasing energy throughout the entire simulation. All intermolecular hydrogen bonds and salt bridges were identified and characterized according to persistence of existence and mean distances, respectively, as well as their participating residues. Lastly, electrostatic potential for each binding site was assessed, permitting to infer regions that guide specific binding of toxin to receptor. To further investigate the importance of each binding region and validate our model, we synthesized peptides corresponding to each of these regions. Result for one model show that loop 3, notorious for receptor recognition, binds a region previously unidentified in Manduca sexta cadherin-like receptor. This new toxin binding region shows the same hydropathicity profile of an antibody epitope previously described to bind specifically to loop 3. Most interestingly, binding occurs with over 266-fold less peptide concentration in pH 9.0 than in pH 7.4. The physiological pH in the insect midgut is approximately 9.0, which corroborates that at least one of the models reproduces in-vivo interaction. Ongoing work will show if both models are plausible to occur, or if one of them is preferable to the other. Overall, these models allowed the observation of the toxin's behavior when binding to BT-R1 and have helped explain many in vitro experiments concerning Cry1A and cadherin-like receptors.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 1998Bitstream added on 2014-06-13T20:50:02Z : No. of bitstreams: 1 ernandes_s_me_araiq.pdf: 3011608 bytes, checksum: 7296c8f780cd8e98400ae8e9f3ecfc09 (MD5) / Not available

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva entomotóxica usada no controle de insetos-praga e vetores de doenças há mais de 60 anos. Desde a introdução das plantas cultivadas expressando genes de Bt, ficou demonstrado que cultivares-Bt constituem uma importante ferramenta no aumento da produtividade e diminuição no uso de pesticidas químicos. O sucesso do Bt advém da produção das δ-endotoxinas (Cry). Estas toxinas compartilham um mecanismo de ação semelhante, com pelo menos, alguns aspectos em comum. A atividade das Cry é baseada nas clivagens N e C-terminais, ligação a receptores (i.e. caderinas) e mudanças conformacionais. O objetivo deste trabalho foi estudar aspectos estruturais das δ-endotoxinas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry3Aa, Cry8Ea1, Cry8Ka1, Cry8Ka5 e Cry1Ia12 usando ferramentas de modelagem molecular por homologia, dinâmica molecular (DM) e docking molecular. Oito toxinas Cry e duas caderinas (CAD) foram modeladas. Quatro toxinas (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Aa e Cry8Ea1) foram usadas para construir 8 sistemas que foram submetidos a simulações de DM de 50 ns utilizando o pacote GROMACS e o campo de força GROMOS96 43a1. As Cry8Ka1, Cry8Ka5, Cry1Ia12 e suas 3 variantes foram comparadas a fim de estabelecer as relações entre as diferenças estruturais e as mudanças na toxicidade. As caderinas, Cry1Ab e Cry1Ac foram usadas nos cálculos de docking molecular. Os resíduos das Cry1A com RMSF alto são os mesmos identificados experimentalmente como sítios de reconhecimento/ligação aos receptores ou desempenham um papel na dinâmica de interação. Os dados mostraram que as flexibilidades global e local das Cry estudadas aumentaram nos sistemas sem a α-1 e isto pode estar relacionado com o mecanismo de ação. Este efeito se propaga por toda a superfície a não apenas na porção N-terminal, sugerindo o início de um processo de transição conformacional. Na Cry1Ac, a ausência da α-1 promove alterações estruturais na alça 2 (ligação a receptores GPI). Algumas mutações das Cry8Ka e Cry1Ia12 estão próximas dos sítios de ligação e podem estar contribuindo para as alterações nas toxicidades. Os mapas de interfaces resultantes dos dockings moleculares corresponderam aos dados experimentais. Neste trabalho foi possível observar novos aspectos do mecanismo de ação das toxinas Cry e suas interações com caderinas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram-positive entomotoxic bacterium widely used to control crop pests and disease vectors. Since the introduction of transgenic plants expressing Bt genes, it has been demonstrated that Bt-crops constitute an important tool in the increase of productivity and in the decrease of the use of chemical pesticides. Its success comes from the production of the δ-endotoxins (Cry). These toxins share a molecular mechanism of similar action or, at least, some common aspects. Activity of Cry proteins is due to N- or C-terminal cleavages, binding to at least one membrane receptor (e.g. cadherins) and conformational changes. The aim of this work was to study structural aspects of Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry3Aa, Cry8Ea1, Cry8Ka1, Cry8Ka5 and Cry1Ia12 δ-endotoxins, using homology modeling, molecular dynamics (MD) and molecular docking. Eight Cry toxins and two cadherins (CAD) were modeled. Four toxins (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Aa and Cry8Ea1) were used to construct eight systems (whole Cry toxins and α-1 removed proteins (Δα1)). Cry8Ka1, Cry8Ka5, Cry1Ia12 and their three variants were compared to analyze the contributions of each mutation. The cadherins and Cry1Ab and Cry1Ac were used on docking calculations. The Cry1A residues with high flexibility are the same identified as recognition/binding sites (apex of domain II and domain-II/IIIinterface) or to play a role on its dynamic. The data show that the global and local flexibilities of Cry toxins studied was increased by helix α-1withdrawal (Δα1) and it is closely related with the mode of action. This effect propagates on the surface and not only on the N-termini suggesting a complex process of conformational transition. Regarding Cry1Ac, the absence of helix α-1 triggers structural changes on loop2, which is related to binding GPI-receptors. Some Cry8Ka5 and Cry1Ia12 mutations are in the neighborhood of receptor-binding sites and this fact may imply alterations on binding affinity. It was possible to obtain a map of Cry/CAD interface by docking studies. Therefore, this work was able to obtain molecular level insights into the Cry activation mechanism and its interaction with CAD.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-10-09T12:52:48Z No. of bitstreams: 1 2014_LuizaArleteVaz.pdf: 988616 bytes, checksum: f6befd6a494149874602850a3c353110 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-09T13:26:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_LuizaArleteVaz.pdf: 988616 bytes, checksum: f6befd6a494149874602850a3c353110 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:26:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_LuizaArleteVaz.pdf: 988616 bytes, checksum: f6befd6a494149874602850a3c353110 (MD5) / A produção agrícola pode ser influenciada por microrganismos endofíticos de diferentes maneiras, tanto pela produção de substâncias promotoras de crescimento vegetal, quanto pelo controle de pragas e doenças. Foram realizados ensaios de promoção de crescimento em casa de vegetação, utilizando as estirpes S1450, S1905, S2122 e S2124 de B. thuringiensis, tóxicas a insetos da Ordem Lepidóptera, cinco espécies vegetais (algodão, arroz, milho, repolho e soja) e dois métodos de inoculação (imersão de sementes e inoculação planta), utilizando uma concentração de 107 esporos.mL-1. Inicialmente, foram avaliados os parâmetros: Índice de Velocidade de Germinação (IVG), altura de plantas e número de folhas. Após 45 dias, as plantas foram avaliadas quanto ao comprimento da raiz, peso seco da raiz e peso seco da parte aérea e, também, a mortalidade das lagartas de S. frugiperda, P. xylostella e A. gemmatalis alimentadas com folhas das plantas utilizadas nos ensaios. Nos ensaios, foi possível observar que o método de inoculação mais eficiente na promoção de crescimento para todas as espécies testadas foi o imersão de sementes e com efeitos diferenciados em função da espécie de planta e da estirpe, com destaque para a estirpe S1905. Nos bioensaios com algodão, repolho e soja, em todos os tratamentos foi verificada uma baixa mortalidade das lagartas de S. frugiperda, P. xylostella e A. gemmatalis, possivelmente isso ocorreu em função da baixa concentração da bactéria na planta, o que não foi suficiente para causar mortalidade das lagartas. __________________________________________________________________________ ABSTRACT / Agricultural production can be influenced by endophytic microorganisms in different ways, either by the production of plant growth promoting substances, as for the control of pests and diseases. Trials to promote growth in the greenhouse were performed using the S1450, S1905, S2122 and S2124 B. thuringiensis toxic to insects of the Order Lepidoptera strains, five plant species (cotton, rice, corn, cabbage and soybeans) and two inoculation methods (immersing seeds and plant inoculation) using a concentration of 107 esporos.mL-1. Initially, the parameters were evaluated: Germination Speed Index (GSI), plant height and number of leaves. After 45 days, the plants were evaluated for root length, root dry weight and dry weight of shoots and also the mortality of S. frugiperda, P. xylostella and A. gemmatalis fed leaves of the plants used the tests. In trials, it was observed that the most efficient method of inoculation in promoting growth for all species tested was the soaking of seeds and adjusted according to the plant species and strain, especially the S1905 strain effects. In bioassays with cotton, cabbage and soybeans in all treatments was observed a low mortality of S. frugiperda, P. xylostella and A. gemmatalis, possibly this was due to the low concentration of bacteria in the plant, which was not enough to cause mortality of caterpillars.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-12-01T17:24:45Z No. of bitstreams: 1 2007_AnaFlaviaAlvesParente.pdf: 2148290 bytes, checksum: 127fe8fbcd02590fb2f21a2a1e84641d (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2009-12-01T23:35:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_AnaFlaviaAlvesParente.pdf: 2148290 bytes, checksum: 127fe8fbcd02590fb2f21a2a1e84641d (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-01T23:35:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_AnaFlaviaAlvesParente.pdf: 2148290 bytes, checksum: 127fe8fbcd02590fb2f21a2a1e84641d (MD5) Previous issue date: 2007-11 / B. thuringiensis é um importante entomopatógeno amplamente estudado e empregado como agente de controle biológico, ainda assim, a ecologia desse microrganismo é pouco explorada. Apesar da crescente utilização na agricultura desse agente, as interações com plantas são pouco conhecidas. Com o intuito de construir uma ferramenta eficaz para o rastreamento dessa bactéria, foi desenvolvida a estirpe S76GFP+ a partir de uma estirpe brasileira selvagem de B. thuringiensis. O vetor de expressão pAD43-25 contendo o gene gfpmut3a funcional, além do vetor parental, pAD123, contendo o mesmo gene, porém sem promotor foram transferidos para a estirpe S76, permitindo no primeiro caso a expressão constitutiva do gene durante o crescimento vegetativo. Adicionalmente, como controle, ambos vetores foram transferidos para uma estirpe acristalífera (Cry-). Células verdes brilhantes foram detectadas por microscopia de fluorescência, em ambas hospedeiras transformadas com o vetor pAD43-25, a partir de duas horas após a inoculação em meio líquido e que puderam ser observadas pelo restante do tempo de cultivo até o fim da esporulação. A estirpe S76GFP+ apresentou um discreto acréscimo no tempo de geração, embora não tenham sido observadas alterações morfológicas das colônias e células. Análises dos perfis protéico e plasmidial indicaram, respectivamente, a manutenção da expressão das proteínas Cry e do elenco dos plasmídeos residentes. Do nosso conhecimento, não apenas é o primeiro relato de visualização da emissão de fluorescência pela expressão de GFP em B. thuringiensis. Igualmente, é o primeiro relato de expressão de GFP em uma estirpe de B. thuringiensis selvagem. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Although extensively studied by its recognized potential as bioinseticide, B. thuringiensis ecology is poorly understood, and despite its increasing use, little is known regarding interactions between this microorganism and plants. Thus, a tractable marker for detection of this bacterium under specific environment and physiological conditions is a valuable tool. A plasmid (pAD43-25) bearing a functional gfp gene and the parental vector, bearing the promotorless gfp gene, were introduced in the Brazilian wild-type strain B. thuringiensis kurstaki S76, allowing, in the first case, the constitutive synthesis of GFP during vegetative growth. Additionally, both vectors were transferred to a Cry- B. thuringiensis host. Green bright cells could be detected, by fluorescence microscopy and in both hosts, since 2h after inoculation in liquid medium and could be seen throughout remaining cultivation time, until complete sporulation was accomplished. Strain S76GFP+ seems to grow slower than the remaining recombinants and parental cells, whereas no perceptible change in cell or colony morphologies was observed. Protein profile and plasmidial DNA analyses indicate, respectively, that this recombinant maintained Cry proteins expression and resident plasmid outline. To our knowledge, it is the first time fluorescence is detected in a B. thuringiensis strain, as well as, that GFP is expressed in a wild-type B. thuringiensis.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva entomotóxica usada no controle de insetos-praga e vetores de doenças há mais de 60 anos. Desde a introdução das plantas cultivadas expressando genes de Bt, ficou demonstrado que cultivares-Bt constituem uma importante ferramenta no aumento da produtividade e diminuição no uso de pesticidas químicos. O sucesso do Bt advém da produção das δ-endotoxinas (Cry). Estas toxinas compartilham um mecanismo de ação semelhante, com pelo menos, alguns aspectos em comum. A atividade das Cry é baseada nas clivagens N e C-terminais, ligação a receptores (i.e. caderinas) e mudanças conformacionais. O objetivo deste trabalho foi estudar aspectos estruturais das δ-endotoxinas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry3Aa, Cry8Ea1, Cry8Ka1, Cry8Ka5 e Cry1Ia12 usando ferramentas de modelagem molecular por homologia, dinâmica molecular (DM) e docking molecular. Oito toxinas Cry e duas caderinas (CAD) foram modeladas. Quatro toxinas (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Aa e Cry8Ea1) foram usadas para construir 8 sistemas que foram submetidos a simulações de DM de 50 ns utilizando o pacote GROMACS e o campo de força GROMOS96 43a1. As Cry8Ka1, Cry8Ka5, Cry1Ia12 e suas 3 variantes foram comparadas a fim de estabelecer as relações entre as diferenças estruturais e as mudanças na toxicidade. As caderinas, Cry1Ab e Cry1Ac foram usadas nos cálculos de docking molecular. Os resíduos das Cry1A com RMSF alto são os mesmos identificados experimentalmente como sítios de reconhecimento/ligação aos receptores ou desempenham um papel na dinâmica de interação. Os dados mostraram que as flexibilidades global e local das Cry estudadas aumentaram nos sistemas sem a α-1 e isto pode estar relacionado com o mecanismo de ação. Este efeito se propaga por toda a superfície a não apenas na porção N-terminal, sugerindo o início de um processo de transição conformacional. Na Cry1Ac, a ausência da α-1 promove alterações estruturais na alça 2 (ligação a receptores GPI). Algumas mutações das Cry8Ka e Cry1Ia12 estão próximas dos sítios de ligação e podem estar contribuindo para as alterações nas toxicidades. Os mapas de interfaces resultantes dos dockings moleculares corresponderam aos dados experimentais. Neste trabalho foi possível observar novos aspectos do mecanismo de ação das toxinas Cry e suas interações com caderinas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram-positive entomotoxic bacterium widely used to control crop pests and disease vectors. Since the introduction of transgenic plants expressing Bt genes, it has been demonstrated that Bt-crops constitute an important tool in the increase of productivity and in the decrease of the use of chemical pesticides. Its success comes from the production of the δ-endotoxins (Cry). These toxins share a molecular mechanism of similar action or, at least, some common aspects. Activity of Cry proteins is due to N- or C-terminal cleavages, binding to at least one membrane receptor (e.g. cadherins) and conformational changes. The aim of this work was to study structural aspects of Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry3Aa, Cry8Ea1, Cry8Ka1, Cry8Ka5 and Cry1Ia12 δ-endotoxins, using homology modeling, molecular dynamics (MD) and molecular docking. Eight Cry toxins and two cadherins (CAD) were modeled. Four toxins (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Aa and Cry8Ea1) were used to construct eight systems (whole Cry toxins and α-1 removed proteins (Δα1)). Cry8Ka1, Cry8Ka5, Cry1Ia12 and their three variants were compared to analyze the contributions of each mutation. The cadherins and Cry1Ab and Cry1Ac were used on docking calculations. The Cry1A residues with high flexibility are the same identified as recognition/binding sites (apex of domain II and domain-II/IIIinterface) or to play a role on its dynamic. The data show that the global and local flexibilities of Cry toxins studied was increased by helix α-1withdrawal (Δα1) and it is closely related with the mode of action. This effect propagates on the surface and not only on the N-termini suggesting a complex process of conformational transition. Regarding Cry1Ac, the absence of helix α-1 triggers structural changes on loop2, which is related to binding GPI-receptors. Some Cry8Ka5 and Cry1Ia12 mutations are in the neighborhood of receptor-binding sites and this fact may imply alterations on binding affinity. It was possible to obtain a map of Cry/CAD interface by docking studies. Therefore, this work was able to obtain molecular level insights into the Cry activation mechanism and its interaction with CAD.

Orientador: Mohamed E. M. Habib / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T04:05:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fagundes_GiovannaGarcia_D.pdf: 1806445 bytes, checksum: fb0da906f4acb0f7f8c2b4c1cc0bd41e (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Ephestia kuhniella é uma expressiva praga de moinhos de trigo. Seu controle é feito basicamente através de produtos químicos sintéticos. Porém, devido aos inúmeros problemas causados ao ambiente e à saúde humana por estas substâncias, novas alternativas para o manejo deste lepidóptero vêm sendo buscadas. Neste sentido, pesquisas em controle biológico, físico e mecânico, entre outros, são fundamentais para embasar novos programas de manejo integrado (MIP) desta praga. Dentre os agentes de controle biológico, produtos à base do entomopatógeno Bacillus thuringiensis var. kurstaki (Btk) e o ectoparasitóide Bracon hebetor são considerados altamente eficientes no controle de E. kuehniella.Todavia, a inserção destes dois em programas de MIP depende de estudos sobre suas interações na regulação da densidade do piralídeo. Sendo assim, este trabalho propõe avaliar o impacto e as interações dos dois agentes de mortalidade sobre este piralídeo. Para tal buscou-se avaliar a susceptibilidade de larvas de E. kuehniella ao Btk; analisar os efeitos crônicos de Btk no desenvolvimento dos piralídeos sobreviventes; avaliar o impacto da patogenia causada pelo Btk nas larvas de E. kuehniella sobre o desenvolvimento do parasitóide; analisar possíveis interações de compatibilidade, antagonismo ou sinergismo entre o parasitóide e o entomopatógeno e avaliar a capacidade de B. hebetor de distinguir entre larvas sadias e infectadas por Btk. Os estudos foram realizados no Laboratório de Entomologia Aplicada, do Departamento de Zoologia da UNICAMP, sob condições controladas (25 ± 20 C; 70 ± 10 % de umidade relativa e 12 horas de fotofase). Com os critérios adotados, observou-se que a susceptibilidade de E. kuehniella variou inversamente em função do estádio de desenvolvimento larval. Desta forma, larvas de primeiro estádio apresentaram maior susceptibilidade ao produto à base do patógeno (CL50 = 0,05%; IC = 0,04 % ¿ 0,06 %), seguidas pelas larvas de terceiro, que apresentaram um nível intermediário (CL50 = 0,16%; IC = 0,12 % ¿ 0,20 %). Já as larvas de quinto estádio foram as menos susceptíveis ao Btk (CL50 = 1,77%; IC = 1,42 % ¿ 2,23 %). Os estudos de efeitos agudos e crônicos do patógeno sobre o desenvolvimento, reprodução e longevidade de E. kuehniella elucidaram o caráter variável da resposta biológica ao tratamento em função da idade larval, da concentração do Btk e do tempo de exposição. Larvas de primeiro (L1) e de quinto estádios apresentaram reduções na viabilidade dos estágios imaturos. Adultos xix oriundos de larvas de primeiro e terceiro estádios sobreviventes a tratamento com Btk não apresentaram efeitos crônicos em termos de capacidade reprodutiva e longevidade. Porém, os adultos que se originaram de indivíduos tratados no quinto estádio larval apresentaram menor capacidade reprodutiva. Já a viabilidade dos seus ovos não diferiu do grupo testemunha. A longevidade do piralídeo foi diminuída quando estes adultos foram expostos ao contato direto com o produto microbiano. Este efeito indireto provavelmente foi decorrente do estresse provocado pelo odor do produto. O Btk também foi indiretamente responsável pela redução na capacidade de B. hebetor paralisar e parasitar larvas de E. kuehniella. Adultos do braconídeo rejeitaram larvas hospedeiras que manifestavam sintomas da bacteriose. A redução da viabilidade dos imaturos do braconídeo variou em função da concentração e do tempo de exposição ao tratamento. Todavia, a longevidade dos adultos obtidos desta F1 não foi alterada. O inseticida microbiano também provocou efeitos indiretos sobre a longevidade dos adultos do braconídeo decorrentes do odor/ contato, com este. A ingestão de mel contendo Btk também diminuiu significativamente a longevidade do ectoparasitóide. Através dos estudos de escolha e olfatometria, pode-se constatar que a localização do hospedeiro por B. hebetor não é alterada em função da infecção por Btk. Mas, a aceitação das larvas para o parasitismo variou inversamente à concentração do patógeno e ao tempo de tratamento do hospedeiro. Desta forma, a maior rejeição ocorreu nos lotes onde havia a maior proporção de larvas doentes e manifestando sintomas evidentes da patogenia. Em condições laboratoriais, a ação do patógeno, nas concentrações aqui avaliadas, associada ao parasitóide, para o controle de E. kuehniella, apresentou a mesma eficiência que o parasitóide isoladamente. Sendo assim, pode-se concluir que Btk e B. hebetor atuam de maneira complementar no controle de populações dessa traça, dependendo de quem a atinge primeiro. Se o programa de MIP visa trabalhar com introduções alternadas desses dois agentes biológicos visando controle de larvas em diferentes estádios, haveria uma vantajosa compatibilidade entre estes, que permite a não utilização de produtos químicos, evita a seleção de resistência pelo Btk na população alvo e contorna o problema gerado pelo número de partículas de insetos presentes em produtos para consumo humano, como as farinhas, decorrente da introdução contínua de parasitóides / Abstract: Ephestia kuehniella is a very important pest, attacking wheat flour in mills and stored places. Due to the negative impact of the chemical control methods, alternative agents are being studied to reach more safety and more satisfactory results. Some biological, physical and mechanical components should be adequate to be includes in integrated pest management programs (IPM) to reduce the injury of this lepidopterous pest. Within the biological agents, Bacillus thuringiensis var. kurstaki (Btk) and the braconid wasp Bracon hebetor are considered very efficient in controlling, separately, E. kuehniella populations. However, the insertion of these two agents in IPM programs needs some studies concerning the interaction between them and their natural pyralid host. The present study aimed to investigate the interaction between Btk and B. hebetor, in addition to evaluate their efficiency in controlling E. kuehniella. Within such a purpose some approaches were studied, such as: susceptibility of E. kuehniella larvae to Btk; chronic effects of Btk on the survived individuals; effect of diseased and survived E. kuehniella larvae on B. hebetor development; compatibility between the two biological agents and B. hebetor capacity to distinguish between healthy and diseased hosts. All experiments were conducted under controlled laboratory conditions of 25 ± 20C, 70 ± 10% R. H. and 12 hours of photophase (Department of Zoology, IB, UNICAMP). The pyralid larval susceptibility varied according to the age. The young larvae (L1) showed to be more susceptible than the old ones (L3 and L5). The CL50s were calculated as 0,05%; 0,16% and 1,77% for the first, third and fifth instars respectively. The acute as well as the chronic effects of Btk on E. kuehniella development varied according to the exposure time, age and pathogen concentration. Adults originated from survived E. kuehniella larvae did not show any biological or structural alterations, when the pathogen was applied against the first and thirdinstar larvae. On the other hand, adults originated from survived 5th instar larvae suffered reduction in their reproductive capacity. The egg viability in all these cases did not reveal any significant differences when compared with testimony block. The direct contact of Btk commercial product resulted in reduced longevity among E. kuehniella adults. Reduction in longevity was also detected when B. hebetor females were kept in contact with the same product. The braconid female parasite was able to distinguish between healthy and diseased host larvae, avoiding to attack the later. Parasitization capacity was reduced when the wasp female was able to deposit its eggs in pyralid larvae during the initial phase of the bacterial disease. B. hebetor adult longevity was reduced when parasitoid wasps were fed on honey containing Btk. Combinations between the two biological agents did not result in any synergistic effect under the conditions of the present study, and both of then could be recommended to be applied in wheat mills / Doutorado / Parasitologia / Doutor em Ciências Biológicas

Transgenic corn and cotton expressing crystalline (Cry) insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis (Bt) were commercially introduced in 1996. This technology has greatly improved the control of several key lepidopteran insect pests tobacco budworm, Heliothis virescens (Farbricius), pink bollworm, Pectinophora gossypiella (Saunders), southwestern corn borer, Diatraea grandiosella (Dyar), and European corn borer, Ostrinia nubilalis (Hübner). The corn earworm, Helicoverpa zea, has been more difficult to control using Bt crops and supplemental insecticide applications are often needed to prevent economic losses. A major threat to the longevity of transgenic technology is the evolution of resistance, especially when an insect pest infests both Bt corn and cotton in the same growing season. Similar Cry proteins are currently expressed in both corn and cotton commercial production systems. At least one generation per year develops on Bt corn before infesting cotton. Given that H. zea infests both crop hosts at some point every year, the objectives of this study were to evaluate the contribution and influence of Genuity VT3 PRO corn (expressing Cry1A.105 and Cry2Ab) on H. zea density, fitness, and selection on BollGard II cotton (expressing Cry1Ac and Cry2Ab). Non-Bt and VT3 PRO corn fields were sampled for larval density and any observed larvae were collected. Non-Bt field corn supported 61% more larvae compared to VT3 PRO fields. Larvae infesting non-Bt corn developed faster than those infesting VT3 PRO corn. Larvae collected from VT3 PRO corn had significantly higher pupal weight two out of the three years of this study. Pupae from VT3 PRO corn also had longer pupal duration two out of three years compared to pupae of larvae collected from non-Bt corn. Offspring from larvae reared on VT3 PRO corn had a higher LC50 compared to offspring from larvae reared on non-Bt corn. H. zea susceptibility to Bt is highly variable but the results presented here indicate that dual-gene corn hybrids such as VT3 PRO can select for H. zea populations with a higher propensity for causing damage in Bt cotton.

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Orientador: Regiane Cristina Oliveira de Freitas Bueno / Coorientador: William Wyatt Hoback / Banca: Carlos Gilberto Raetano / Banca: Giuseppina Pace Pereira Lima / Banca: Pedro Takao Yamamoto / Banca: Cristiane Müller / Resumo: As plantas, por estarem constantemente expostas a diversos tipos de estresses, podem ser influenciadas pelo meio onde são cultivadas, resultando em alterações no desenvolvimento e metabolismo, e que, consequentemente, poderão influenciar em mudanças nas interações insetos-praga. Neste sentido, objetivou-se com esse estudo, avaliar as relações entre plantas de soja submetidas a estresses causados por arranjos de semeadura e aumento de temperatura, e as consequência desses fatores na interação insetos-praga que ocorrem na cultura. Para isso foram realizados dois experimentos. No primeiro experimento foram estudados, durante dois anos agrícolas consecutivos, os arranjos de semeadura: convencional 40 cm, reduzido 20 cm, fileira dupla 20 × 40 cm, e fileira dupla 20 × 60 cm; e diferentes populações de plantas: 320.000, 427.000 e 537.000 plantas ha-1. Foram avaliados nesse experimento a ocorrência de percevejos-praga durante todo o ciclo da cultura, os danos causados por percevejos/grão, três enzimas oxidativas e a produtividade. No segundo ensaio foi avaliado, em plantas de soja Bt e não Bt, o efeito de diferentes temperaturas nos parâmetros fisiológicos, na expressão do gene da proteína catalase e nos danos causados por Chrysodeixis includens (Walker, [1858]) (Lepidoptera: Noctuidae: Plusiinae). Em ambos experimentos foi verificado a influência do estresse nas plantas de soja por fatores bióticos e abióticos, com alteração nos parâmetros fisiológicos e na atividade das enzimas. No... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Plants, because they are constantly exposed to different types of stresses, can be influenced by the environment where they grow, resulting in changes in development and metabolism, and, consequently, may influence changes in insect-pest interactions. Thus, the purpose of this study was to evaluate the relationships between soybean plants submitted to stresses caused by planting arrangements and temperature increase, and the consequences of these factors on the insect-pest interaction that occur in the crop. For that two experiments were performed. In the first experiment, during two consecutive agricultural years were studied planting arrangements: conventional 40 cm, reduced 20 cm, double row 20 × 40 cm, and double row 20 × 60 cm; And different plant populations: 320,000, 427,000 and 537,000 ha-1 plants. In this experiment was evaluated the occurrence stink bugs during the whole crop cycle, the damage caused by stink bugs/ grain, three oxidative enzymes and productivity. In the second experiment was evaluated, on Bt and non-Bt soybean plants, the effect of different temperatures on physiological parameters, protein catalase gene expression and damage caused by Chrysodeixis includens (Walker, [1858]) (Lepidoptera: Noctuidae: Plusiinae). In both experiments, the influence of stress on soybean plants was verified by biotic and abiotic factors, with changes in physiological parameters and enzyme activity. In the first experiment during the first agricultural year the plants in ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor