Medicago truncatula forme une association symbiotique avec Sinorhizobium meliloti qui conduit à la formation de nodosités fixatrices d’azote. Les cellules symbiotiques végétales accueillent des centaines de bactéries qui restent viables dans la nodosité et se différencient en bactéroïdes fixateurs d’azote. Dans le but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires nécessaires à la mise en place de cette interaction, nous avons recherché de nouveaux gènes de plante requis pour une symbiose effective en utilisant des approches de génétique directe et inverse. Des méthodes de biologie cellulaire et moléculaire ont été utilisées pour caractériser le phénotype des mutants et mieux comprendre la fonction biologique de ces gènes.Le gène symbiotique DNF2 code une phosphatidylinositol phospholipase C putative. Les nodosités formées par le mutant dnf2 contiennent une zone de fixation qui est réduite et dans laquelle les rhizobia ne se différencient pas complètement en bactéroïdes. De plus ces nodosités sénescent rapidement et présentent des réactions similaires à des réponses de défense. Sous certaines conditions d’expérimentation, le phénotype sauvage peut être restauré chez ce mutant ce qui montre le caractère conditionnel du phénotype.Le gène symbiotique SYMCRK code un récepteur kinase riche en cystéine. Le phénotype du mutant symCRK est similaire à celui de dnf2, ce qui suggère que ces deux gènes sont impliqués dans des processus aboutissant à des réponses similaires, probablement la persistance des bactéries dans les cellules végétales ou l’inhibition des réactions de défense de la plante. Les phénotypes Fix- atypiques des mutants dnf2 et symCRK suggèrent que les gènes correspondants sont impliqués dans les processus de répression des défenses de la plante et de persistance des bactéroïdes. / Medicago truncatula and Sinorhizobium meliloti form a symbiotic association resulting in the formation of nitrogen-fixing nodules. In the nodules, symbiotic plant cells home and maintain hundreds of viable bacteria which are differentiated into bacteroids, the nitrogen-fixing form of rhizobia. In order to better understand the molecular mechanism sustaining this phenomenon, we used a combination of forward and reverse genetics approaches to identify genes required for nitrogen fixation. In addition we have used cell and molecular biology to characterize the phenotype of the corresponding mutants and to gain an insight into the genes functions.The symbiotic gene DNF2 encodes a putative phosphatidylinositol phospholipase C-like protein. Nodules formed by the mutant contain a zone of infected cells reduced to a few cell layers. In this zone, bacteria do not differentiate properly into bacteroids. Mutant nodules senesce rapidly and they exhibit defense-like reactions. The dnf2 symbiotic phenotype has been shown to be dependent on the experimental conditions.The symbiotic gene SYMCRK encodes a cystein-rich receptor kinase. The symCRK phenotype is similar to dnf2 suggesting that the two genes SYMCRK and DNF2 are participating in similar processes. This atypical phenotype amongst Fix- mutants unravels DNF2 and SYMCRK as new actors of bacteroid persistence inside symbiotic plant cells and repression of plant defense.

En cas de carence azotée, les légumineuses sont capables de mettre en place une symbiose avec des bactéries du sol fixatrices d’azote appelées rhizobia. Cette symbiose a lieu dans un organe appelé nodosité où les bactéries sont endocytées et appelées bactéroïdes. Certains clades de légumineuses imposent un processus de différenciation à leurs bactéroïdes qui agrandissent considérablement et deviennent polyploïdes, menant à des morphotypes bactériens allongés ou sphériques. Au cours de cette thèse, j’ai étudié la différenciation des bactéroïdes de Bradyrhizobium spp. en association avec Aeschynomene spp.. Les bactéroïdes de ces plantes présentent des degrés de différenciation distincts qui dépendent de l’espèce hôte. Mes données suggèrent que les bactéroïdes les plus différenciés sont aussi les plus efficaces. J’ai cherché à savoir quels facteurs procaryotes pourraient être impliqués dans les adaptations des bactéroïdes au processus de différenciation et à leurs divers hôtes, le tout en lien avec cette différence d’efficacité symbiotique au travers d’approches globales sans a priori de type -omiques. Les conditions considérées sont des bactéroïdes de différents morphotypes et des cultures libres de référence. Les fonctions activées en conditions symbiotiques ont été identifiées, ainsi que les gènes spécifiques d’un hôte donné. Des analyses fonctionnelles des gènes d’intérêt ont également été menées. Les mutants bactériens n’ont toutefois pas présenté de phénotype symbiotique drastique, montrant ainsi l’existence de réseaux de gènes complexes menant à la résilience des génomes de rhizobia. / In case of nitrogen starvation, legume plants establish a symbiotic interaction with nitrogen-fixing soil bacteria called rhizobia. This interaction takes place in nodules where the symbionts are internalized and become bacteroids. Some legume clades also impose a differentiation process onto the bacteroids which become enlarged and polyploid, leading to elongated or spherical morphotypes. During my PhD work, I have studied bacteroid differentiation of Bradyrhizobium species in association with Aeschynomene spp.. These bacteroids display distinct differentiation levels depending on the plant host, and my analyses suggest that the most differentiated ones are also the most efficient. I investigated the bacterial factors potentially involved in the adaptations to differentiation and host-specificity, and related to the higher efficiency of the most differentiated bacteroids using global-omics approaches without a priori. The analyzed conditions were bacteroids of distinct morphotypes and free-living reference cultures. Activated functions under symbiotic conditions were identified, as well as host-specific ones. Functional analyses were performed on genes of interest. However, the bacterial mutants did not display drastic symbiotic phenotypes, showing the existence of complex gene networks leading to high resilience of rhizobial genomes.

Les Légumineuses ont développé une interaction symbiotique avec des bactéries du sol, les rhizobia, qui fixent l’azote atmosphérique et le transfèrent à la plante sous forme assimilable.Cette interaction a lieu, au sein des nodosités, des organes racinaires où les bactéries intracellulaires se différencient en bactéroïdes. Chez Medicago truncatula, ces bactéroïdes correspondent à un stade de différentiation terminale corrélée à une endoréplication de leur génome, une augmentation de la taille des cellules, une modification des membranes et une faible capacité à se propager. Cette différentiation est induite par des facteurs de la plante appelés NCR (Nodule-specific Cysteine Rich). Les peptides NCRs ressemblent à des défensines, des peptides antimicrobiens ayant une activité antimicrobienne in vitro, tuant des bactéries. Ainsi, un élément clef dans la différenciation des bactéroïdes est la protéine bactérienne BacA, un transporteur membranaire qui confère une résistance contre l’activité antimicrobienne des peptides. Dans le cadre de ce travail de thèse, j’ai montré que l'expression des NCR est soumise à une régulation stricte et qu’ils sont activés dans trois vagues dans les cellules symbiotiques polyploïdes.Les mécanismes de contrôle par la plante sur les rhizobia intracellulaires demeurent à ce jourpeu connus et le seul modèle étudié, au début de ce travail de thèse, restait l'interaction entre M. truncatula et S. meliloti. Je me suis donc intéressée à la symbiose de certaines Légumineuses tropicales du genre Aeschynomene appartenant au clade des Dalbergoïdes où jemontre qu’ils utilisent une classe différente de peptides riches en cystéine (NCR-like) pour induire la différenciation des bactéroïdes. Ce mécanisme est analogue à celui décrit précédemment chez Medicago qui était jusqu'à présent supposé être limitée aux légumineuses appartenant au clade des IRLC. J’ai également montré que Bradyrhizobium, symbionte d’Aeschynomene possèdent un transporteur de type ABC homologues à BacA de Sinorhizobium nommé BclA. Ce gène permet l'importation d'une variété de peptides comprenant des peptides NCR. En l'absence de ce transporteur, les rhizobiums sont incapables de se différencier et de fixer l'azote.Cette étude a permis d'élargir nos connaissances sur l'évolution de la symbiose en montrant qu’au cours de l’évolution, deux clades de Légumineuses relativement éloignés (IRLC et Dalbergoïdes) aient convergé vers l’utilisation de peptides de l’immunité innée afin de contrôler leur symbionte bactérien et d’en tirer un bénéfice maximal au cours de l’interaction symbiotique. / The ability of legumes to acquire sufficient nitrogen from the symbiosis with Rhizobium relies on the intimate contact between the endosymbiotic, intracellular rhizobia, called bacteroids, and their host cells, the symbiotic nodule cells. A well-studied example is the symbiotic nitrogen fixing bacterium Sinorhizobium meliloti, which nodulates the legume Medicago truncatula. Nodules of M. truncatula produce an enormous diversity of peptides called NCRs which are similar to antimicrobial peptides (AMPs) of innate immune systems. These NCRs are involved in maintaining the homeostasis between the host cells in the nodules and the large bacterial population they contain. Although many NCRs are genuine AMPs which kill microbes in vitro, in nodule cells they do not kill the bacteria but induce them into the terminally differentiated bacteroid state involving cell elongation, genome amplification, membrane fragilization and loss of cell division capacity. Protection against the antimicrobial action of NCRs by the bacterial BacA protein is critical for bacteroid survival in the symbiotic cells and thus for symbiosis. As a part of my PhD thesis, I have shown that the differentiation of the symbiotic cells in M. truncatula is associated with a tremendous transcriptional reprogramming involving hundreds of genes, mainly NCR genes, which are only expressed in these cells. Although the extensive work on the model M. truncatula/S. meliloti, little is known how the plant controls its intracellular population and imposes its differentiation into a functional form, the bacteroids in other symbiotic systems.In my PhD work, I provide several independent pieces of evidence to show that tropical legumes of the Aeschynomene genus which belong to the Dalbergoid legume clade use a different class of cysteine rich peptides (NCR-like) to govern bacteroid differentiation. This mechanism is similar to the one previously described in Medicago which was up to now assumed to be restricted to the advanced IRLC legume clade, to which it belongs. I have also shown that the Bradyrhizobium symbionts of Aeschynomene legumes possess a multidrug transporter, named BclA, which mediates the import of a diversity of peptides including NCR peptides. In the absence of this transporter, the rhizobia do not differentiate and do not fix nitrogen. BclA has a transmembrane domain of the same family as the transmembrane domain of the BacA transporter of Rhizobium and Sinorhizobium species which is known to be required in these rhizobia to respond to the NCR peptides of IRLC legumes. Again this is a mechanism which is analogous to the one described in S. meliloti the symbiont of Medicago.This study broaden our knowledge on the evolution of symbiosis by showing that the modus operandi involving peptides derived from innate immunity used by some legumes to keep their intracellular bacterial population under control is more widespread and ancient than previously thought and has been invented by evolution several times.