A contaminação bacteriana por espécies dos gêneros Lactobacillus, Bacillus e Leuconostoc entre outras bactérias lácticas é um dos principais fatores que afetam o rendimento da fermentação alcoólica. A formação de biofilmes acaba protegendo as bactérias e é uma fonte permanente de contaminação. Objetivando caracterizar tais contaminações em (1) biofilmes de centrífuga, dorna, trocador de calor e tubulação de água e (2) melaço, mosto, levedo, levedo tratado (com H2SO4) e vinho, amostras foram coletadas em diferentes períodos de um sistema fermentativo de alto teor alcoólico (16%). As enzimas de restrição AluI, BstUI, HaeIII, HinfI, MseI e MspI utilizadas nas análises de T-RFLP foram definidas por análises in silico com sequências do gene 16S rRNA de contaminantes freqüentes. Essas enzimas geram uma maior quantidade de T-RFs únicos entre 30 e 650 pb. Os DNAs extraídos das amostras foram submetidos às análises de T-RFLP para obtenção do perfil molecular das comunidades microbianas dos pontos de coleta. Os índices de diversidade de Shannon foram calculados com base no número dos T-RFs. Foram realizadas as análises dos componentes principais (PCA) e a inferência filogenética dos contaminantes com base nos perfis dos T-RFs. A quantificação dos principais táxons contaminantes foi feita por qPCR utilizando primers específicos delineados neste estudo e considerando a média de cópias do gene 16S rRNA presentes no genoma de cada táxon bacteriano. Na primeira coleta o biofilme de água apresentou maior índice de diversidade microbiana e na segunda, melaço e mosto. PCA sugere que os biofilmes (e não as fontes externas) são os principais contaminantes desse processo fermentativo devido as suas semelhanças com a composição das outras comunidades analisadas. Espécies de Lactobacillus e Bacillus predominaram entre as amostras da primeira coleta. Halomonas, Streptococcus, Lactococcus e Pseudomonas foram detectados em amostras de biofilme e em amostras líquidas, sendo os principais contaminantes provindos de biofilme no momento da primeira coleta. Na segunda coleta Bacillus foi o principal contaminante e novamente gêneros produtores de ácido lático como Streptococcus, Lactobacillus e Staphylococcus foram os mais freqüentes. Os resultados concordam com o reportado na literatura sobre sistemas fermentativos convencionais. Apenas os primers desenhados para amplificação do gene 16S rRNA de Burkholderia, Pseudomonas e Weissella apresentaram especificidade em testes com isolados. Halomonas sp. foi encontrada em biofilme de dorna através do sequenciamento utilizando primers para esse gênero. Halomonas pode produzir levânio podendo haver o consumo da sacarose disponível para fermentação. Biofilme da centrífuga teve a maior quantidade de micro-organismos nos dois momentos de coleta (1,93E+06 UFC.mg-1 e 2,14E+07 UFC.mg-1, respectivamente) assim como as amostra de levedo entre as amostras líquidas (1,03E+08 UFC.ml-1 e 2,96E+06 UFC.ml-1, na primeira e segunda coleta, respectivamente), indicando níveis consideráveis de contaminantes. Burkholderia e Pseudomonas foram os mais abundantes entre as amostras de biofilmes da primeira e segunda coleta. Nas amostras líquidas Burkholderia apresentou-se em maior quantidade na maioria das amostras da primeira coleta; enquanto Pseudomonas e Weissella em geral predominaram equivalentemente entre as amostras da segunda coleta / Bacterial contamination by Lactobacillus, Bacillus and Leuconostoc and other lactic acid bacteria is one of the main factors that affects the yield in alcoholic fermentation process. Biofilm formation protects the bacteria community and it is a permanent source of contamination. For characterization of these contaminations in (1) biofilms from centrifuge, tank fermentation, heat exchanger and water pipe and (2) molasses, must, yeast, yeast treated (with H2SO4) and wine, samples were taken at two different periods from fermentation system characterized by high alcohol yields (16%). Restriction enzymes AluI, BstUI, HaeIII, HinfI, MseI and MspI used in T-RFLP analysis were defined by 16S rRNA gene sequences analysis in silico from common contaminants. These enzymes generate high number of unique T-RFs between 30 and 650 bp. DNA from samples were used as template in T-RFLP reactions in order to obtain molecular profiles of microbial communities present at each sample. Shannon diversity index was calculated based on T-RFs numbers. Principal component analysis (PCA) and phylogenetic inference of contaminants were performed based on T-RFs profiles. The main contaminant bacterial taxa were quantified by qPCR using specific primers designed in this study and considering the average of 16S rRNA gene copies previously counted into the genome of each bacterial taxon. Water pipe biofilm showed the highest rate of bacterial diversity in the samples collected in the first sampling period. For the samples collected in the second sampling, the highest rate of bacterial diversity was revealed for molasses and must. PCA suggested that biofilms (but not external sources) are the main contaminants in the studied fermentation process. It is probably due their similarities with the composition of other analyzed communities. Lactobacillus and Bacillus species predominated in first sampling period. Halomonas, Streptococcus, Lactococcus and Pseudomonas were detected in biofilm and liquid samples. They were the main contaminants from biofilm at this time of sampling. In the second sampling period, Bacillus was the most common genera and other lactic acid bacteria such Streptococcus, Staphylococcus and Lactobacillus were also the most frequent contaminants. These results agree with other reported in the literature about conventional fermentation systems. Only the primers designed in this study to amplify the 16S rRNA gene of Burkholderia, Pseudomonas and Weissella showed specificity in tests with bacterial strains. Halomonas sp. was revealed in biofilms from tank fermentation by DNA sequencing using designed primers for genera. Halomonas can produce levan and may consume sucrose available for generation of alcohol. Centrifugal biofilm had the highest amount of bacteria in both sampling periods (1.93E+06 CFU.mg-1 and 2.14E+07 CFU.mg-1, respectively). In liquid samples, yeast had the highest amount of bacteria in both sampling periods (1.03E+08 CFU.ml-1 and 2.96E+06 CFU.ml-1, respectively); it shows significant levels of contaminants. Burkholderia and Pseudomonas were more abundant among biofilm samples of all samplings. Burkholderia was present in high quantities in the majority of liquid samples taken during the first sampling period; Pseudomonas and Weissella equivalently predominated among samples taken during the second sampling period

A contaminação bacteriana por espécies dos gêneros Lactobacillus, Bacillus e Leuconostoc entre outras bactérias lácticas é um dos principais fatores que afetam o rendimento da fermentação alcoólica. A formação de biofilmes acaba protegendo as bactérias e é uma fonte permanente de contaminação. Objetivando caracterizar tais contaminações em (1) biofilmes de centrífuga, dorna, trocador de calor e tubulação de água e (2) melaço, mosto, levedo, levedo tratado (com H2SO4) e vinho, amostras foram coletadas em diferentes períodos de um sistema fermentativo de alto teor alcoólico (16%). As enzimas de restrição AluI, BstUI, HaeIII, HinfI, MseI e MspI utilizadas nas análises de T-RFLP foram definidas por análises in silico com sequências do gene 16S rRNA de contaminantes freqüentes. Essas enzimas geram uma maior quantidade de T-RFs únicos entre 30 e 650 pb. Os DNAs extraídos das amostras foram submetidos às análises de T-RFLP para obtenção do perfil molecular das comunidades microbianas dos pontos de coleta. Os índices de diversidade de Shannon foram calculados com base no número dos T-RFs. Foram realizadas as análises dos componentes principais (PCA) e a inferência filogenética dos contaminantes com base nos perfis dos T-RFs. A quantificação dos principais táxons contaminantes foi feita por qPCR utilizando primers específicos delineados neste estudo e considerando a média de cópias do gene 16S rRNA presentes no genoma de cada táxon bacteriano. Na primeira coleta o biofilme de água apresentou maior índice de diversidade microbiana e na segunda, melaço e mosto. PCA sugere que os biofilmes (e não as fontes externas) são os principais contaminantes desse processo fermentativo devido as suas semelhanças com a composição das outras comunidades analisadas. Espécies de Lactobacillus e Bacillus predominaram entre as amostras da primeira coleta. Halomonas, Streptococcus, Lactococcus e Pseudomonas foram detectados em amostras de biofilme e em amostras líquidas, sendo os principais contaminantes provindos de biofilme no momento da primeira coleta. Na segunda coleta Bacillus foi o principal contaminante e novamente gêneros produtores de ácido lático como Streptococcus, Lactobacillus e Staphylococcus foram os mais freqüentes. Os resultados concordam com o reportado na literatura sobre sistemas fermentativos convencionais. Apenas os primers desenhados para amplificação do gene 16S rRNA de Burkholderia, Pseudomonas e Weissella apresentaram especificidade em testes com isolados. Halomonas sp. foi encontrada em biofilme de dorna através do sequenciamento utilizando primers para esse gênero. Halomonas pode produzir levânio podendo haver o consumo da sacarose disponível para fermentação. Biofilme da centrífuga teve a maior quantidade de micro-organismos nos dois momentos de coleta (1,93E+06 UFC.mg-1 e 2,14E+07 UFC.mg-1, respectivamente) assim como as amostra de levedo entre as amostras líquidas (1,03E+08 UFC.ml-1 e 2,96E+06 UFC.ml-1, na primeira e segunda coleta, respectivamente), indicando níveis consideráveis de contaminantes. Burkholderia e Pseudomonas foram os mais abundantes entre as amostras de biofilmes da primeira e segunda coleta. Nas amostras líquidas Burkholderia apresentou-se em maior quantidade na maioria das amostras da primeira coleta; enquanto Pseudomonas e Weissella em geral predominaram equivalentemente entre as amostras da segunda coleta / Bacterial contamination by Lactobacillus, Bacillus and Leuconostoc and other lactic acid bacteria is one of the main factors that affects the yield in alcoholic fermentation process. Biofilm formation protects the bacteria community and it is a permanent source of contamination. For characterization of these contaminations in (1) biofilms from centrifuge, tank fermentation, heat exchanger and water pipe and (2) molasses, must, yeast, yeast treated (with H2SO4) and wine, samples were taken at two different periods from fermentation system characterized by high alcohol yields (16%). Restriction enzymes AluI, BstUI, HaeIII, HinfI, MseI and MspI used in T-RFLP analysis were defined by 16S rRNA gene sequences analysis in silico from common contaminants. These enzymes generate high number of unique T-RFs between 30 and 650 bp. DNA from samples were used as template in T-RFLP reactions in order to obtain molecular profiles of microbial communities present at each sample. Shannon diversity index was calculated based on T-RFs numbers. Principal component analysis (PCA) and phylogenetic inference of contaminants were performed based on T-RFs profiles. The main contaminant bacterial taxa were quantified by qPCR using specific primers designed in this study and considering the average of 16S rRNA gene copies previously counted into the genome of each bacterial taxon. Water pipe biofilm showed the highest rate of bacterial diversity in the samples collected in the first sampling period. For the samples collected in the second sampling, the highest rate of bacterial diversity was revealed for molasses and must. PCA suggested that biofilms (but not external sources) are the main contaminants in the studied fermentation process. It is probably due their similarities with the composition of other analyzed communities. Lactobacillus and Bacillus species predominated in first sampling period. Halomonas, Streptococcus, Lactococcus and Pseudomonas were detected in biofilm and liquid samples. They were the main contaminants from biofilm at this time of sampling. In the second sampling period, Bacillus was the most common genera and other lactic acid bacteria such Streptococcus, Staphylococcus and Lactobacillus were also the most frequent contaminants. These results agree with other reported in the literature about conventional fermentation systems. Only the primers designed in this study to amplify the 16S rRNA gene of Burkholderia, Pseudomonas and Weissella showed specificity in tests with bacterial strains. Halomonas sp. was revealed in biofilms from tank fermentation by DNA sequencing using designed primers for genera. Halomonas can produce levan and may consume sucrose available for generation of alcohol. Centrifugal biofilm had the highest amount of bacteria in both sampling periods (1.93E+06 CFU.mg-1 and 2.14E+07 CFU.mg-1, respectively). In liquid samples, yeast had the highest amount of bacteria in both sampling periods (1.03E+08 CFU.ml-1 and 2.96E+06 CFU.ml-1, respectively); it shows significant levels of contaminants. Burkholderia and Pseudomonas were more abundant among biofilm samples of all samplings. Burkholderia was present in high quantities in the majority of liquid samples taken during the first sampling period; Pseudomonas and Weissella equivalently predominated among samples taken during the second sampling period

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No. of bitstreams: 1 Tese - Arlena Maria Guimarães Gato.pdf: 2067444 bytes, checksum: a858fc3c2c47508ee175666940ad0251 (MD5) Previous issue date: 2009-12-10 / SUFRAMA - Superintendência da Zona Franca de Manaus / The flowers and ornamental plants cultivation stands out as an important agronomical activity. But despite the economical and market potential of these regional native species: helicônia, bastão, sorvetão and other plants, is necessary more basic studies about the use of advanced techniques in getting propagated material with quality assurance and good phytosanitary aspect. The objective of this study was to obtain plantlets from floral apices of Heliconia rauliniana and embryos rescue of H. marginata, identifies, inoculation of bacterial isolates and evaluate the effect of these microorganisms in the development of micropropagated plants. Established the plants micropropagation process, it was isolated from matrices root, bacterial isolates and, according to the classification criteria of activity levels of nitrogen biological fixation, phosphate solubilisation and auxin production, it was selected six Heliconia rauliniana isolates and eight of Heliconia marginata. The first experiment were inoculated in in vitro plants of H. rauliniana, the B4, B5, B8, B13, B16 and B18 bacterial isolates and on H. marginata micropropagated plants, the B1, B2, B4, B6, B7, B10, B12, B14 and B16 isolates and, then transferred to plastic boxes containing sterilized substrate Plantmax (Horticulture) and maintained under greenhouse. After 60 days of inoculation, it was realized the evaluation of root growth promotion, selecting the three isolates that showed the best results: B18, B5 and B13 (H. rauliniana) and B7, B6 and B10 (H. marginata). In the second experiment we used the B18, B5, B13 and B6, B7, B10 selected in the first experiment and inoculated in 60 plants, distributed on five treatments: control, B18, B5 and B13, cocktail x plant and control, B6, B7, B10, cocktail x plant with 12 plants per treatment. The results presented after 60 days, don’t were significant on the level of 0.05% and one good faith coefficient of 95% (ANOVA) for root growth promotion, number of leaves, plant height, fresh weight and dry weight. The plants survive was 83.3%. For microorganisms identify, it was used the analysis of the fragment about 800 bp of the 16S rDNA (Primer 27f). The sequencial analysis via Blast showed three bacterial groups: Burkholderia, Ralstonia e Enterobacteriaceae (Pantoea/Erwinia). / O cultivo de flores e plantas ornamentais tropicais destaca-se como importante atividade agrícola. Mas, apesar das potencialidades econômicas e de mercado dessas espécies nativas da região: helicônia, bastão, sorvetão e outras, são necessários mais estudos básicos sobre a utilização de técnicas avançadas na obtenção de material de propagação com garantia de qualidade e bom aspecto fitossanitário. O objetivo deste trabalho foi obter mudas micropropagadas a partir de ápice floral de Heliconia rauliniana e de resgates de embriões de H. marginata, identificação, inoculação dos isolados de bactérias e avaliar o efeito desses microrganismos no desenvolvimento das plantas micropropagadas. Estabelecido o processo de micropropagação das plantas foram isolados das raízes das matrizes, isolados bacterianos e, de acordo com os critérios de classificação dos níveis de atividades em fixação biológica de nitrogênio, solubilização de fosfato e produção de auxina, foram selecionados seis isolados da Heliconia rauliniana e oito da Heliconia marginata. No primeiro experimento, foram inoculados nas plantas micropropagadas de H. rauliniana, os isolados bacterianos B4; B5 (Enterobacter); B8; B13 (Ralstonia); B16; B18 (Enterobacter) e nas plantas micropropagadas de H. marginata, os isolados B1; B2; B4; B6 (Enterobacter); B7 (Enterobacter); B10 (Burkholderia); B12; B14 e; B16 e, posteriormente transferidas para caixas plásticas contendo substrato esterilizado PlantMax (Horticultura) e mantidas em casa de vegetação. Após 60 dias de inoculação foi realizada a avaliação de promoção de crescimento de raiz, selecionando-se os três isolados que apresentaram os melhores resultados por espécie: Heliconia rauliniana, Enterobacteriaceae (Pantoea/Erwinia), B18 e B5 Enterobacteriaceae (Pantoea/Erwinia e B13 (Ralstonia) e Heliconia marginata B7 Entereobacteriaceae (Pantoea/Erwinia), B6 Entereobacteriaceae (Pantoea/Erwinia) e B10 Burkholderia. No segundo experimento foram utilizados os isolados bacterianos B18 Enterobacteriaceae (Pantoea/Erwinia): B5 Enterobacteriaceae (Pantoea/Erwinia, B13 Ralstonia e B6, Entereobacteriaceae (Pantoea/Erwinia), B7, Entereobacteriaceae (Pantoea/Erwinia), B10, Burkholdeia selecionados no primeiro experimento e inoculados em 60 plantas, distribuídas em cinco tratamentos: controle, B18 Entereobacteriaceae (Pantoea/Erwinia: B5 Entereobacteriaceae (Pantoea/Erwinia e B13 Ralstonia, coquetel x planta e controle, B6 Entereobacteriaceae (Pantoea/Erwinia), B7 Entereobacteriaceae (Pantoea/Erwinia), B10 (Burkholderia), coquetel x planta com 12 plantas por tratamento. Os resultados apresentados após 60 dias, não foram significativos a nível de 0,05 % e um coeficiente de confiança de 95 % (A NOVA) para promoção de crescimento de raiz, número de folhas, altura de planta, peso fresco e peso seco. A sobrevivência das plantas foi de 83,3 %. Para identificação dos microrganismos foi usado o seqüenciamento de fragmento de aproximadamente 800 pb do gene 16S rDNA (“primer 27f). A análise das sequencias via Blast mostrou três grupos de bactéria: Burkholderia, Ralstonia e Enterobacteriaceae (Pantoea/Erwinia).