Ralstonia solanacearum, une béta-proteobactérie d'origine tellurique, est l'une des phytobactérioses les plus nuisibles au niveau mondial. Cette bactérie est capable d'infecter plus de 250 espèces différentes dont certaines présentent un intérêt économique majeur (tomate, pomme de terre, tabac). R. solanacearum est divisée en 4 phylotypes distincts présentant des origines géographiques différentes : I (asiatique), IIA et IIB (américain), III (africain), IV (indonésien). Parmi ces phylotypes, le phylotype I est en expansion démographique, hautement recombinogène, réparti mondialement et possède une large gamme d'hôtes. Il possède donc un fort potentiel évolutif (sensu McDonald et Linde, 2002). Afin de contrôler cette bactérie, la lutte génétique reste la méthode la plus prometteuse : elle consiste à déployer des cultivars possédant différents sources de résistance (i.e., des gènes de résistance). La variété d'aubergine AG91-25 (E6) possède un gène majeur de résistance (ERs1) lui permettant de contrôler certaines souches de R. solanacearum de phylotype I. Cependant, la gestion de cette résistance requiert d'étudier au préalable sa durabilité afin d'en éviter le contournement. Cette durabilité peut être estimée en étudiant le potentiel évolutif d'un agent pathogène face à cette source de résistance, ainsi qu'en décryptant les mécanismes moléculaires de l'interaction entre l'hôte (gène R) et le pathogène (effecteur de types trois). Afin d'étudier la dynamique évolutive de R. solanacearum sous une pression de sélection exercée par la variété résistante E6, nous avons mis en place un essai d'évolution expérimentale au champ. Cet essai est composé de trois couples de microparcelles d'aubergines résistantes E6 et d'aubergines sensibles E8, implantées deux fois par an, pendant trois ans (soit 5 cycles). Un schéma MLVA (« Multi-Locus VNTR Analysis ») composé de 8 loci minisatellites a été développé afin de caractériser les souches extraites de ces cycles de cultures. Ces VNTR sont spécifiques aux souches de R. solanacearum de phylotype I, hautement polymorphes et discriminants à toutes les échelles : mondiale, régionale et locale. Nos résultats démontrent une absence de contournement de la résistance d'E6 par les populations parcellaires de R. solanacearum, confirmant le caractère durable de cette résistance. Cette variété aurait fortement réduit les populations bactériennes du sol, ne leur permettant plus d'infecter l'hôte résistant. Parallèlement, 100% des plants d'E8 sont morts à partir du cycle 2. La maladie au sein des microparcelles semble progresser selon une dynamique de « plante-à-plante ». Une baisse de la diversité génétique a aussi été observée au cours des cycles de culture répétés d'E8, associée à l'augmentation en fréquence de deux haplotypes. Cependant, aucune structuration génétique claire n'a été observée à l'échelle de la parcelle entière ou de la microparcelle. En revanche, les données d'isolement par la distance semblent indiquer qu'une structure spatiale semble être en cours d'établissement. L'ensemble de nos résultats suggère une structure épidémique clonale de nos populations parcellaires. Nous nous sommes aussi intéressés à l'implication de 10 ET3 dans l'interaction R. solanacearum vs aubergine résistante (E6). La distribution des 10 ET3 candidats est variable au sein d'une collection de souches phylogénétiquement diverses (91 souches) : ripAJ et ripE1 sont les ET3 les plus partagés alors que ripP1 et ripP2 sont les moins fréquemment. Certains ET3 présentent peu (ripAJ) voire pas (ripE1 et ripP2) de polymorphisme de taille, alors que d'autres (ripAU) sont extrêmement polymorphes. Cependant la composition en effecteurs d'une souche ne semble pas être corrélée à un phénotype sur aubergine E6. Nous avons identifié le gène d'effecteur ripAX2 comme ayant une fonction d'avirulence sur aubergine résistante E6. Sa reconnaissance par E6 semble s'opérer au niveau de la zone hypocotylaire. / Ralstonia Solanacearum is a soilborn beta-proteobacterium responsible of bacterial wilt on Solanaceaous crops. This bacterium is considered as one of the most harmful plant disease worldwide. This bacterium possesses the ability to infect more than 250 different species, including crops with major economic importance (tomato, potato, tobacco, eucalyptus…). R. solanacearum is divided into four phylotypes originated from different areas: I (Asian), IIA and IIB (American), III (African), IV (Indonesian). Among these phylotype, phylotype I is currently in demographic expansion, is highly recombinogenic and has a wide hosts range. Thus, altogether, these characteristics demonstrated that this phylotype has a high evolutionary potential (sensu McDonald and Linde, 2002). In order to control this bacterium, genetic plant resistance seems to be the most promising method. This method consists in using cultivars with different source of resistance such as resistance genes and/or resistant QTLs. The AG91-25 (E6), an eggplant cultivar possessing a major resistance gene (ERs1), is capable to control some of phylotype I strains of R. solanacearum. However, in order to optimize the management of this resistance and to avoid its fast breakdown, we need to deeply investigate the durability of this resistant gene. Durability can be estimated by studying the evolutionary potential of our pathogen faced to E6 source of resistance and by understanding the molecular mechanisms underlying the interaction between the host (R gene) and its pathogene (Type III Effector – T3E). In order to study R. solanacearum evolutionary dynamics under selective pressure from E6 resistant cultivar, we set up an experimental evolution trial in the field. This trial consisted of three couples of resistant (E6) and susceptible eggplants (E8) microplots, implanted twice a year during three years, hence consisting of 5 cycles. A Multi-Locus VNTR Analysis (MLVA) scheme, consisting of 8 minisatellite loci, was developed in order to characterize the strains extracted from these crop cycles. These VNTRs were specific to R. solanacearum phylotype I strains, they were highly polymorphic and discriminatory at different scale: globally, regionally and locally.Our results showed no breakdown of E6 resistance by R. solanacearum populations, which confirms that this resistance is durable. It seemed that this cultivar reduced the soil bacterial population, preventing bacterial population to infest the resistant host. At the same time, 100% of the E8 plants have died, starting at cycle 2. Bacterial wilt seemed to spread with a “plant-to-plant” dynamics within each microplot. Genetic diversity reduction was also observed during the successive cycle of susceptible eggplant, associated with the increase of frequency of two main haplotypes. However, we failed to identify a clear genetic structuration, neither at the plot scale nor at the microplot scale. Nevertheless, isolation-by-distance data seemed to show that a spatial structure is currently establishing. Altogether, our results suggested that our plot populations appeared to have a clonal epidemic structure.We also looked into 10 T3Es' involvement in the interaction between R. solanacearum and the resistant eggplant (E6). Their distribution was completely different within a collection of phylogenetically diverse strains (91 strains): ripAJ and ripE1 are the most shared T3Es whereas ripP1 and ripP2 were the less common T3E whithin our collection of strains. Some T3Es showed few (ripAJ) or no length polymorphism at all (ripE1 and ripP2) whereas some other (ripAU) are extremely polymorphic. Nevertheless, the T3E effector repertoire did not seemed to be correlated to a specific phenotype on E6 eggplant. Its recognition by E6 seemed to occur in the hypocotyle region rather than in the mesophyll, highlighting a possible organ-specificity of the interaction between ERs1 and ripAX2.

[ES] El complejo de especies de Ralstonia solanacearum es el responsable de la marchitez bacteriana, una enfermedad que afecta en todo el mundo a cultivos y plantas ornamentales de gran importancia económica. El filotipo (ft) II raza 3 biovar (bv) 2 produce la podredumbre parda de la patata y la marchitez bacteriana de las solanáceas en climas templados, y se ha introducido recientemente en algunas áreas de la Unión Europea y de Estados Unidos, donde este patógeno se considera un organismo de cuarentena. La presencia de R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 en estas zonas ha hecho surgir ciertos interrogantes sobre la biología y la patogenicidad de esta bacteria, algunos de los cuales se han abordado en este trabajo. De esta manera, se han evaluado aspectos del comportamiento, la capacidad de supervivencia y la capacidad para la inducción de la enfermedad, de cepas de R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 de origen europeo en diferentes especies vegetales y diversas muestras de agua medioambiental. El comportamiento en cuanto a la colonización de R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 in planta ha permitido realizar una clasificación en huéspedes susceptibles o tolerantes y en no huéspedes, en base a la localización histológica del patógeno y su aislamiento. Se ha observado que los huéspedes susceptibles y tolerantes eran intensamente invadidos a nivel del xilema de las raíces, pero densamente o bien débilmente colonizados, respectivamente, a nivel del xilema del tallo. Ninguno de ellos debe ser considerado como candidato para la rotación de cultivos en suelos contaminados. Por otra parte, se ha observado que en los no huéspedes no se producía la invasión a nivel del xilema de la planta, aunque podría haber presencia esporádica del patógeno en el córtex de las raíces o en la superficie y, por lo tanto, algunos podrían actuar como reservorios. Los no huéspedes podrían seleccionarse para los sistemas de rotación tras su evaluación en condiciones de campo. La capacidad de supervivencia de R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 en microcosmos de agua medioambiental se ha visto influida por factores tanto abióticos como bióticos. El patógeno ha mostrado una resistencia considerable frente a la exposición a la oligotrofía como único factor de stress. Así, desarrolló varias estrategias que le permitieron sobrevivir en microcosmos de agua medioambiental durante cuatro años bajo condiciones de limitación de nutrientes, manteniendo la capacidad de inducir la enfermedad en el huésped incluso a través de riego. Las estrategias adaptativas para superar la oligotrofía observadas durante este largo periodo han sido la respuesta de supervivencia frente a la privación de nutrientes, la entrada en el estado viable no cultivable, una transformación progresiva de las formas bacilares típicas en cocoides de reducido tamaño, los fenómenos de filamentación y gemación, y la agregación. El patógeno también ha mostrado estrategias eficientes cuando ha sido expuesto a diferentes temperaturas simultaneamente a las condiciones de escasez de nutrientes. De esta manera, a 4°C el frío indujo la entrada en un estado viable no cultivable que fue dependiente del contenido en nutrientes del agua, mientras que a 14°C y 24°C las respuestas de supervivencia frente a la privación de nutrientes, aunque aparentemente similares, revelaron un efecto de la temperatura en la formación de los cocoides. Por otra parte, la persistencia del patógeno se redujo de manera significativa en microcosmos de agua medioambiental por la actividad predadora, competitiva o lítica de los protozoos, las bacterias y/o los bacteriófagos presentes en el agua. Entre todos ellos, se demostró que los fagos líticos fueron los responsables principales del descenso en las poblaciones de R. solanacearum, si bien los protozoos y las otras bacterias contribuyeron en cierta medida. El efecto fue más apreciable a 24°C que a 14°C debido a que las interacciones bióticas fueron más lentas a la temperatura más baja. Esta bacteria ha mostrado una gran capacidad de adaptación, consiguiendo sobrevivir y mantener su poder patógeno en prácticamente todas las condiciones ensayadas. La finalidad de este trabajo ha sido contribuir al progreso del conocimiento de las interacciones entre R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 y sus ambientes naturales, para mejorar las estrategias preventivas tanto de la diseminación del patógeno como de la propagación de la marchitez bacteriana en dichos hábitats. / [EN] The Ralstonia solanacearum species complex causes bacterial wilt, a plant disease affecting economically important crops and ornamentals worldwide. The phylotype (ph) II race 3 biovar (bv) 2 produces potato brown rot and bacterial wilt in solanaceous plants in temperate climates and has recently been introduced to several areas of the European Union and the USA, where the pathogen has a quarantine status. Presence of R. solanacearum ph II race 3 bv 2 in these zones raised questions on biological and phytopathological aspects of this bacterium, some of them being addressed in this work. Thus behaviour, ability for survival and disease inducing capacity of European R. solanacearum ph II race 3 bv 2 have been assessed in a range of different plant species and diverse surface run-off water samples. Behaviour of R. solanacearum ph II race 3 bv 2 in planta has led to a classification in susceptible or tolerant hosts and non-hosts, based on the pathogen histological localization and isolation. Susceptible and tolerant hosts were highly invaded in root xylem but, heavily or weakly colonized respectively in stem xylem. They are to be avoided as candidates for crop rotation. Non-hosts were not invaded in plant xylem but, occasional presence of the pathogen in root cortex or on surface might occur and so, some of them might act as reservoirs. They could be selected for crop rotation systems after being carefully tested in open field conditions. Ability for survival of R. solanacearum ph II race 3 bv 2 in environmental water microcosms has been influenced by abiotic and biotic factors. When faced to oligotrophy as the only stressing factor the pathogen displayed a considerable endurance. It resorted to a number of survival strategies which enabled it to survive in environmental water microcosms over four years under starvation, retaining disease inducing capacity in the host even by watering. Adaptations to overcome nutrient limitation during the long period were starvation-survival responses, the entrance into a viable but non-culturable state, progressive transformation from the typical bacillar shape into coccoid forms reduced in size, filamentation and budding phenomena and aggregation. Survival strategies were also successfully exhibited by the pathogen when exposed to environmental temperatures simultaneously to nutrient scarcity conditions. Thus, at 4°C a viable but non-culturable state dependent on water nutrient contents was cold-induced, whilst at 14°C and 24°C apparently similar starvation-survival responses revealed a distinct effect of temperature on coccoid formation. On the other hand, indigenous freshwater protozoa, bacteria and/or phages with predatory, competitive or lytic activity reduced significantly pathogen persistence. Among them, lytic bacteriophages were the main responsible for the decrease in R. solanacearum populations, although protozoa and other bacteria also contributed. The effect was more appreciable at 24°C than at 14°C because of slower biotic interactions at the lower temperature. The pathogen was able to adapt itself, succeeding in surviving and keeping pathogenic in almost all condition. This work intends to contribute to the progress in the knowledge of the interactions between R. solanacearum ph II race 3 bv 2 and natural environments, which may allow to improve the strategies to prevent pathogen dissemination and bacterial wilt spread in natural settings. / [FR] Le complexe d'espèces de Ralstonia solanacearum est l'agent causal du flétrissement bactérien, une maladie qui affecte des cultures et des plantes ornementales de grande importance économique dans le monde entier. Le phylotype (phyl) II race 3 biovar (bv) 2 produit la pourriture brune de la pomme de terre et d’une manière générale le flétrissement bactérien des Solanacées dans les climats tempérés. Ce phylotype II a récemment été introduit dans des certaines régions de l'Union Européenne et des États-Unis, où cette bactérie est considérée comme un pathogène de quarantaine. La présence de R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 dans ces régions a soulevé quelques questions au sujet de sa biologie et de son pouvoir pathogène, questions qui ont été abordées dans ce travail. Nous avons notamment évalué, chez R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 d'origine européenne, l'aptitude à survivre dans divers échantillons de l'eau environnementale de surface et la capacité à induire la maladie dans des différentes espèces de plantes cultivées. Notre étude de la capacité de colonisation de R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 in planta a permis une classification en hôtes sensibles ou tolérants et non hôtes sur la base de la localisation histologique de l'agent pathogène et de son isolement in planta. Il a été noté que les hôtes sensibles et tolérants sont intensément envahis à niveau du xylème des racines, mais fortement ou faiblement colonisés à niveau du xylème de la tige chez les plantes sensibles ou tolérantes respectivement. Aucune de ces plantes ne doit être recommandée comme candidat dans une rotation culturale. En outre, nous avons noté que le xylème des plantes non hôtes n’est pas envahi, bien que l’on puisse noter la présence sporadique de l'agent pathogène dans le cortex des racines ou sur la surface racinaire. Cela signifie que certaines plantes non hôtes pourraient potentiellement être des réservoirs d’inoculum latent. En conséquence les plantes non hôtes qui pourraient être recommandées dans des systèmes de rotation culturale doivent être évaluées non seulement au laboratoire mais aussi au champ dans des conditions naturelles. Nous avons montré que la capacité de survie de R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 dans des microcosmes de l'eau environnementale, préalablement filtrée ou autoclavée, est influencée par des facteurs abiotiques et biotiques. L'agent pathogène fait preuve d'une résistance considérable quand il est exposé à l'oligotrophie comme seul facteur de stress. Nous avons mis en évidence différentes stratégies utilisées par cette bactérie pour survivre plus de quatre ans dans des conditions de limitation des éléments nutritifs dans des microcosmes de l'eau environnementale tout en maintenant sa capacité d'induction de la maladie chez un hôte sensible à la suite de sa dissémination par irrigation. Les adaptations utilisées par cette bactérie pour surmonter l'oligotrophie au cours de cette longue période ont été l'entrée dans l'état viable non cultivable, une transformation progressive des typiques formes bacillaires vers des formes coccoïdes de petite taille, des phénomènes de filamentation et de bourgeonnement et d'agrégation. L'agent pathogène a également utilisé des stratégies efficaces quand il a été exposé à des différentes températures de l'environnement en même temps qu'à des conditions de limitation des éléments nutritifs. Ainsi à 4°C le froid a entraîné un état viable non cultivable qui a été dépendant de la teneur en éléments nutritifs de l'eau. Par contre à 14°C et 24°C les réponses de survie face à la privation des éléments nutritifs ont induit la formation de formes coccoïdes. En outre, la persistance de l'agent pathogène a été considérablement réduite dans des microcosmes de l'eau environnementale par l'activité prédatrice, compétitive ou lytique des protozoaires, des bactéries et/ou des bactériophages qui étaient contenus dans de l'eau. Notamment, il a été constaté que les phages lytiques sont les principaux responsables de la baisse des populations de R. solanacearum, bien que les protozoaires et d'autres bactéries aient également contribués dans une certaine mesure. L'effet a été plus sensible à 24°C qu'à 14°C en raison d'interactions biotiques plus lentes aux températures plus basses. En conclusion cette bactérie a démontré une grande capacité pour s'adapter, survivre et de maintenir son pouvoir pathogène dans pratiquement toutes les conditions couramment rencontrées dans les conditions naturelles. Le but de ce travail a été de contribuer à l'avancement de la connaissance des interactions entre R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 et les milieux aquatiques naturels ou les plantes hôtes potentielles, dans l’espoir de développer les meilleures stratégies pour empêcher la propagation de l'agent pathogène et donc du flétrissement bactérien dans ces environnements. / [CA] El complex d'espècies de Ralstonia solanacearum és l'agent causal del pansiment bacterià, una malaltia vegetal que afecta a tot el món a cultius i plantes ornamentals de gran importància econòmica. El filotipo (fil) II raça 3 biovar (bv) 2 produeix la podridura marró de la patata i el pansiment bacterià en plantes solanàcies de climes temperats, i s'ha introduït recentment en algunes àrees de la Unió Europea i dels Estats Units, on aquest patogen es considera de quarantena. La presència de R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 en aquestes zones ha fet sorgir certs interrogants sobre qüestions biològiques i fitopatològiques d'aquest bacteri, algunes de les quals s'han abordat en aquest treball. D'aquesta manera s'han valorat aspectes del comportament, la capacitat de supervivència i la capacitat per a la inducció de la malaltia, de R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 de procedència europea en diferents espècies vegetals i diverses mostres d'aigua d'escorrentia superficial. El comportament pel que fa a la colonització de R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 in planta ha proporcionat una classificació en hostes susceptibles o tolerants i en no hostes, en base a la localització histològica del patogen i el seu aïllament. S'observà que els hostes susceptibles i tolerants eren intensament envaïts a nivell del xilema de les arrels, però densament o bé feblement colonitzats respectivament a nivell del xilema de la tija. Cap d'ells ha de ser considerat com a candidat per a la rotació cultural. D'altra banda, es va observar que els no hostes no eren envaïts en el xilema de la planta, encara que podria haver presència esporàdica del patogen en el còrtex de les arrels o a la surperfície i, per tant, alguns podrien actuar com a reservoris. Els no hostes podrien ser seleccionats per als sistemes de rotació cultural després d'haver estat avaluats en condicions de camp. La capacitat de supervivència de R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 en microcosmos d'aigua mediambiental s'ha vist influïda per factors abiòtics i biòtics. El patogen ha mostrat una resistència considerable quan ha estat exposat a l'oligotrofia com a únic factor d'estrès. Així, va recórrer a diverses estratègies que li van permetre sobreviure en microcosmos d'aigua mediambiental durant quatre anys sota condicions de limitació de nutrients, mantenint la capacitat per a la inducció de la malaltia en l'hoste fins i tot a través de reg. Les adaptacions per superar l'oligotrofia que s'han observat durant aquest llarg període han estat respostes de supervivència front a la privació de nutrients, l'entrada en l'estat viable no cultivable, una transformació progressiva de les típiques formes bacilars a cocoids de reduït tamany, els fenòmens de filamentació i gemmació, i l'agregació. El patogen també ha mostrat estratègies eficients quan ha estat exposat a diferents temperatures mediambientals simultàneament a les condicions d'escassetat de nutrients. D'aquesta manera, a 4°C el fred va induir un estat viable no cultivable que va ser dependent del contingut en nutrients de l'aigua, mentre que a 14°C i 24°C les respostes de supervivència front a la privació de nutrients, encara que aparentment similars, van revelar un efecte de la temperatura a la formació dels cocoids. D'altra banda, la persistència del patogen s'ha vist significativament reduïda en microcosmos d'aigua mediambiental per l'activitat predadora, competitiva o lítica dels protozous, els bacteris i/o els bacteriòfags que contenia l'aigua. Entre tots ells, es va determinar que els fags lítics eren els responsables principals del descens en les poblacions de R. solanacearum, si bé els protozous i els altres bacteris van contribuir en certa mesura. L'efecte va ser més apreciable a 24°C que a 14°C degut a que les interaccions biòtiques van ser més lentes a la temperatura més baixa. Aquest bacteri ha mostrat una gran capacitat d'adaptació, aconseguint sobreviure i mantenir el seu poder patogènic en pràcticament totes les condicions. La finalitat d'aquest treball és contribuir al progrés del coneixement de les interaccions entre R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 i els seus ambients naturals, el que pot desenvolupar una millora de les estratègies per a la prevenció tant de la disseminació del patogen com de la propagació del pansiment bacterià en aquests ambients. / B. Álvarez specially thanks the Marie Curie Foundation for a Marie Curie Fellowship at the IFR40 in Toulouse (France) and the Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias for a predoctoral grant. This work has been funded by the European contract QLK3-CT-2000-01598 acronym “Potatocontrol” and FAIR 5-CT97-3632 of the European Union, FD 1997-2279 of the Ministerio de Educación y Ciencia of Spain and GV05/214 of the Generalitat Valenciana. / Álvarez Ortega, MB. (2009). Biology of Ralstonia Solanacearum Phylotype II in Host and Non-Host Environments [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191532

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In both cases, identification at species level is an important step to manage this root pathogen complex, whose detection can be improved by molecular biology tools. Therefore, this study aimed to: 1) to develop and validate a multiplex PCR (m-PCR) method for simultaneous identification of three common bean pathogens, F. oxysporum f. sp. phaseoli, F. solani and C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens; and 2) develop an isothermal amplification of DNA (LAMP) method to detect of F. oxysporum f. sp. phaseoli on seeds. M-PCR method was developed for identification of isolated colonies, as well as infected seeds. In seeds, total DNA was obtained by alkaline lysis method, which inactivates nucleases during the extraction process. M-PCR allowed the identification of all pathogens, with detection of C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, F. oxysporum f. sp. phaseoli and F. solani amplicons in agarose gel with respectively 306, 609 and 143 base pairs. Furthermore, m-PCR also reduced costs and time to detect Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli from 10 days to three hours. It was not possible to develop an optimized protocol for detection of F. oxysporum f. sp. phaseoli by the LAMP method, using only the tf1 gene for design of primers, since such primers were functional only for amplifying large amounts of target DNA. Based on the negative results with LAMP, it is suggested that further studies should be performed using other DNA sequences available in GenBank database. / O feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris L.) é cultivado durante todo o ano no território brasileiro, em três épocas distintas e em vários agroecosistemas. Nestes ambientes distintos, a cultura está exposta a diversos fatores que causam perdas de rendimento, como o ataque de patógenos. Dentre as doenças do feijoeiro-comum encontram-se a murcha-de-fusarium (Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli), a podridão-radicular-seca (Fusarium solani) e a murcha-de-curtobacterium (Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens) que apresentam sintomas semelhantes, dificultando seu diagnóstico no campo, e cuja identificação em testes de sanidade de sementes também é limitada. Em ambos os casos, a identificação em nível de espécie é uma importante etapa do manejo deste complexo de patógenos, cuja detecção pode ser aperfeiçoada com a adoção de ferramentas de biologia molecular. Portanto, este estudo teve como objetivos: 1) Desenvolver e validar um método de multiplex PCR (m-PCR) para identificação simultânea de três espécies de patógenos do feijoeiro-comum, F. oxysporum f. sp. phaseoli, F. solani e C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens; e 2) desenvolver a técnica de amplificação isotérmica de DNA (LAMP) para detecção de F. oxysporum f. sp. phaseoli em sementes. O método de m-PCR foi desenvolvido para identificação de colônias isoladas bem como sementes infectadas. Nas sementes, o DNA total foi obtido pela lise alcalina, método que inativa nucleases durante o processo de extração. A m-PCR possibilitou a identificação de todos os patógenos, com detecção de C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, F. oxysporum f. sp. phaseoli e F. solani em bandas formadas em gel de agarose respectivamente com 306, 609 e 143 pares de base. Além disso, a extração do DNA total das sementes pela lise alcalina em combinação com a m-PCR também possibilitou redução de custos e tempo de realização do diagnóstico de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, de 10 dias para três horas. Não foi possível estabelecer um protocolo otimizado para detecção de F. oxysporum f. sp. phaseoli pelo método LAMP, utilizando somente o gene tf1 para desenho dos iniciadores, uma vez que, os iniciadores revelaram-se funcionais apenas para a amplificação com grandes quantidades de DNA alvo. Diante dos resultados obtidos com LAMP, sugere-se que estudos posteriores sejam realizados empregando outras sequências de DNA disponíveis no banco de dados GenBank.

<p dir="ltr">Bacterial Wilt, caused by <i>Ralstonia solanacearum</i>, is among the most devastating plant diseases in the world. This pathogen causes significant loss in crops such as tobacco, potato, and tomato. <i>R. solanacearum</i> root infection and xylem colonization determine disease outcome. To date, little is known about the defense mechanism mediated by roots to prevent <i>R. solanacearum</i> vascular colonization during the initial infection stages. Plant early responses are important since they may impact disease outcomes<i>.</i><i> </i>Here, we report the formation of root hairs and primary root growth inhibition in tomato seedlings as <i>Ralstonia</i>-induced phenotypes that depend on tomato genotype and <i>Ralstonia</i> species. The <i>Ralstonia</i>-induced root phenotypes are independent of a functional type III secretion system and exopolysaccharide production (EPS). We also found that <i>R. solanacearum</i><i> </i>K60 infection increased auxin levels throughout the root meristem in wilt-susceptible tomato roots. Our data suggest proper auxin signaling and transport are important for susceptibility to <i>R. solanacearum</i> K60. Blocking auxin transport pharmacologically or genetically led to fewer wilting symptoms, suggesting that auxin is important during early infection stages and disease outcomes in tomato. We previously found that a tomato mutant defective in auxin transport and signaling, known as <i>diageotropica</i> (<i>dgt</i>), has enhanced resistance to <i>R. solanacearum</i> K60. We characterized the resistant response in the <i>dgt</i> mutant, and we found that the resistant response in the <i>dgt</i> mutant may be due to increased lignin content preventing pathogen vasculature colonization. <i>DGT</i> encodes a cyclophilin protein that regulates auxin transport and signaling. Mutations in the cyclophilin DGT promote resistance to <i>R. solanacearum</i> K60. DGT has been reported to regulate auxin transport and signaling. However, the molecular mechanism regarding how DGT mediates these processes is still unknown. We used Yeast Two-Hybrid to identify candidate protein interactors, and we found that SlbZIP1/SlbZIP29, Sl14-3-3, and SlMYB110 may interact with DGT to regulate both development and defense responses. Understanding the role of DGT, auxin, and lignin in defense responses to <i>R. solanacearum</i> K60 in tomato is necessary for Solanaceae crop improvement.</p>

Methyl bromide (MBr) was widely used as a soil fumigant to manage soilborne pests in plasticulture vegetable production; however, it has been banned by the United Nations Environment Programme. Alternatives to MBr must be implemented to sustain fresh market tomato productivity. Possible MBr alternatives include new fumigant compounds, improved plastic mulch, and grafting. Methyl iodide (MeI) and dimethyl disulfide (DMDS) were tested as fumigant alternatives to MBr for the control of yellow nutsedge and soilborne pathogens of tomato. Virtually impermeable film (VIF) and totally impermeable film (TIF) were tested for fumigant retention and yellow nutsedge control in tomato. Grafting onto resistant rootstocks was tested for bacterial wilt and nematode management in tomato. In the absence of a soil fumigant, TIF suppressed yellow nutsedge better than VIF. TIF increased fumigant retention compared to VIF at similar application rates. Reduced fumigant application rates could be used in combination with TIF while maintaining fumigant concentrations, weed control, and crop yields comparable to greater use rates with VIF. Shank applied DMDS rates could be lowered to 281 L/ha under TIF from 468 L/ha under VIF; shank applied MeI application rates could be reduced to 56 L/ha under TIF compared to 93 L/ha under VIF and drip applied DMDS could be reduced from 561 L/ha under VIF film to 374 L/ha under TIF. Grafting susceptible commercial tomato cultivars onto resistant tomato hybrid rootstocks increased yields and plant survival in bacterial wilt infested fields. "Cheong Gang", "BHN 998", and "BHN 1054" were the best performing rootstocks for bacterial wilt resistance and tomato fruit yield in severely infested fields. Grafting increased tomato yield and decreased root galling from root-knot nematodes in an infested field. Hybrid rootstock "RST 106" resulted in the lowest root-knot nematode galling. In conclusion, TIF with reduced rates of DMDS or MeI is a viable MBr alternative for fresh market tomato production to retain effective doses of fumigant, manage yellow nutsedge and maintain yields. Grafting is an effective MBr alternative to manage bacterial wilt and root-knot nematode and maintain tomato yields. / Ph. D.