Le travail de ma thèse porte sur l’étude des protéines chaperonnes des acides nucléiques chez le virus de l’immunodéficience humaine VIH-1.Ces protéines sont au nombre de trois : Tat, Vif et la Nucléocapside. Je me suis concentrée sur les deux dernières citées : Vif, dont j’ai réalisé une étude structurale et fonctionnelle en partant du gène, j’ai réussi à produire et purifier la protéine, que je l’ai caractérisée par des méthodes structurales comme la diffusion de lumière et le dichroïsme circulaire. J’ai étudié les interactions de cette protéine avec les acides nucléiques par spectroscopie de fluorescence et Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Et finalement j’ai participé aux tests d’activités chaperonnes. Pour la nucléocapside, qui est une protéine déjà connue au sein du laboratoire, j’ai examiné son rôle de protéine chaperonne lors de l’initiation de la transcription inverse. J’ai mis en évidence par RMN une interaction très controversée entre l’ARN génomique virale et l’ARNtLys3 qui joue le rôle d’amorce pour l’initiation de la transcription inverse. / Pas de résumé en anglais

Die Möglichkeit, durch Beeinflussung der Interaktion der Gegenspieler Apobec3G und Vif, ein neuartiges Medikament gegen HIV zu entwickeln, ist in der Literatur bereits vielfach beschrieben (Argyris und Pomerantz 2004, Cullen 2006, Sheehy et al. 2003). Als Teil des angeborenen Immunsystems bietet die Aufrechterhaltung der antiviralen Eigenschaften von Apobec3G einen viel versprechenden Ansatzpunkt, die Infektiosität des HI-Virus einzudämmen. RN18 ist als ein Vif-Antagonist in der Literatur beschrieben (Nathans et al. 2008). Um Substanzen ausfindig zu machen, die den Abbau von Apobec3G durch Vif verhindern können, wurden in dieser Arbeit niedermolekulare Substanzen auf deren Tauglichkeit diesbezüglich getestet. In einem ersten Schritt (Screening) wurde die Wirksamkeit der Testsubstanzen bei einer Konzentration von 30 μM ermittelt. Bei Substanzen, die eine ähnliche Hemmung des Abbaus des Reporterproteins EYFP-A3G im Vergleich zu RN18 bewirkten, wurde eine quantitative Analyse zur genaueren Bestimmung der halbmaximalen Hemm-konzentration durchgeführt (Titration). Einerseits wurden Derivate des bekannten Vif-Antagonisten RN18 getestet. Durch schrittweise Verbesserung der Wirksamkeit der RN18-Derivate gelang es schließlich Substanzen zu finden, für die ein besserer Effekt als für RN18 ermittelt werden konnte, den Abbau von Apobec3G durch Vif zu verhindern. Zur Beurteilung der Ergebnisse wurde der EC50-Wert berechnet, um die Wirksamkeit der Substanzen miteinander vergleichen zu können. Es wurde nach Substanzen gesucht, die bei möglichst geringen Konzentrationen wirken. Das RN18-Derivat mit dem besten Ergebnis war FM86 (EC50-Wert: 4.5 μM). Andererseits wurden niedermolekulare Substanzen aus verschiedenen Arbeitsgruppen untersucht, um weitere Substanzen zu finden, die ebenso wie RN18 in der Lage sind, die Vif/Apobec3G-Interaktion zu hemmen. Auch hier wurden mehrere Substanzen ermittelt, die eine bessere Wirksamkeit als RN18 erkennen ließen. Derivate der Substanz CBA77a konnten am effektivsten den Abbau von Apobec3G durch Vif verhindern. Das beste Ergebnis wurde für die Testsubstanz CBA82 ermittelt (EC50-Wert: 2.8 μM). Ob die Ergebnisse der Testsubstanzen ausschließlich auf die Hemmung der Vif/A3G Interaktion zurückzuführen sind, kann letztendlich nicht abschließend beurteilt werden. Eine Erweiterung des Testsystems durch unsere Arbeitsgruppe sieht daher vor, falsch positive Ergebnisse zu erkennen. / As a part of the innate immune system the maintenance of the antiviral qualities of Apobec3G offers a promising starting point to curtail the infectivity of HIV. RN18 is described as a Vif antagonist in the literature (Nathans et al. 2008). To find out substances, they are able to inhibit the reduction of Apobec3G by Vif, following tests were made in this dissertation: In a first step the effectiveness of the test substances in a concentration of 30 μM was determined (Screening). Substances, which caused a similar inhibition of the reduction of Apobec3G in comparison to RN18, a quantitative analysis was made to get the half-maximum inhibition concentration (Titration). On the one hand derivatives of the known Vif antagonist RN18 were tested. The RN18 derivative with the best result was FM86 (EC50 value: 4.5 μM). On the other hand low-molecular substances were tested, if they are able to inhibit the interaction of Apobec3G and Vif as RN18 do. Derivatives of the substance CBA77a inhibit most actually the reduction of Apobec3G by Vif. The best result was determined for the test substance CBA82 (EC50 value: 2.8 μM). It is not able to judge, if the results of the test substances are reduce exclusively to the inhibition of the Vif/Apobec3G interaction. Therefore our working group plans to extend the test system to prevent false positive results.

Die Möglichkeit, durch Beeinflussung der Interaktion der Gegenspieler Apobec3G und Vif, ein neuartiges Medikament gegen HIV zu entwickeln, ist in der Literatur bereits vielfach beschrieben (Argyris und Pomerantz 2004, Cullen 2006, Sheehy et al. 2003). Als Teil des angeborenen Immunsystems bietet die Aufrechterhaltung der antiviralen Eigenschaften von Apobec3G einen viel versprechenden Ansatzpunkt, die Infektiosität des HI-Virus einzudämmen. RN18 ist als ein Vif-Antagonist in der Literatur beschrieben (Nathans et al. 2008). Um Substanzen ausfindig zu machen, die den Abbau von Apobec3G durch Vif verhindern können, wurden in dieser Arbeit niedermolekulare Substanzen auf deren Tauglichkeit diesbezüglich getestet. In einem ersten Schritt (Screening) wurde die Wirksamkeit der Testsubstanzen bei einer Konzentration von 30 μM ermittelt. Bei Substanzen, die eine ähnliche Hemmung des Abbaus des Reporterproteins EYFP-A3G im Vergleich zu RN18 bewirkten, wurde eine quantitative Analyse zur genaueren Bestimmung der halbmaximalen Hemm-konzentration durchgeführt (Titration). Einerseits wurden Derivate des bekannten Vif-Antagonisten RN18 getestet. Durch schrittweise Verbesserung der Wirksamkeit der RN18-Derivate gelang es schließlich Substanzen zu finden, für die ein besserer Effekt als für RN18 ermittelt werden konnte, den Abbau von Apobec3G durch Vif zu verhindern. Zur Beurteilung der Ergebnisse wurde der EC50-Wert berechnet, um die Wirksamkeit der Substanzen miteinander vergleichen zu können. Es wurde nach Substanzen gesucht, die bei möglichst geringen Konzentrationen wirken. Das RN18-Derivat mit dem besten Ergebnis war FM86 (EC50-Wert: 4.5 μM). Andererseits wurden niedermolekulare Substanzen aus verschiedenen Arbeitsgruppen untersucht, um weitere Substanzen zu finden, die ebenso wie RN18 in der Lage sind, die Vif/Apobec3G-Interaktion zu hemmen. Auch hier wurden mehrere Substanzen ermittelt, die eine bessere Wirksamkeit als RN18 erkennen ließen. Derivate der Substanz CBA77a konnten am effektivsten den Abbau von Apobec3G durch Vif verhindern. Das beste Ergebnis wurde für die Testsubstanz CBA82 ermittelt (EC50-Wert: 2.8 μM). Ob die Ergebnisse der Testsubstanzen ausschließlich auf die Hemmung der Vif/A3G Interaktion zurückzuführen sind, kann letztendlich nicht abschließend beurteilt werden. Eine Erweiterung des Testsystems durch unsere Arbeitsgruppe sieht daher vor, falsch positive Ergebnisse zu erkennen. / As a part of the innate immune system the maintenance of the antiviral qualities of Apobec3G offers a promising starting point to curtail the infectivity of HIV. RN18 is described as a Vif antagonist in the literature (Nathans et al. 2008). To find out substances, they are able to inhibit the reduction of Apobec3G by Vif, following tests were made in this dissertation: In a first step the effectiveness of the test substances in a concentration of 30 μM was determined (Screening). Substances, which caused a similar inhibition of the reduction of Apobec3G in comparison to RN18, a quantitative analysis was made to get the half-maximum inhibition concentration (Titration). On the one hand derivatives of the known Vif antagonist RN18 were tested. The RN18 derivative with the best result was FM86 (EC50 value: 4.5 μM). On the other hand low-molecular substances were tested, if they are able to inhibit the interaction of Apobec3G and Vif as RN18 do. Derivatives of the substance CBA77a inhibit most actually the reduction of Apobec3G by Vif. The best result was determined for the test substance CBA82 (EC50 value: 2.8 μM). It is not able to judge, if the results of the test substances are reduce exclusively to the inhibition of the Vif/Apobec3G interaction. Therefore our working group plans to extend the test system to prevent false positive results.

L'autophagie est un mécanisme de dégradation lysosomale qui joue un rôle important dans l'immunité innée et adaptative. La relation entre le Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1) et l'autophagie est complexe. En effet, l'équipe a montré que l'enveloppe virale du VIH-1 (Env), exprimée à la surface des cellules infectées, induit une autophagie massive dans les cellules T CD4 bystanders non infectées. Au contraire, lorsque ces cellules s'infectent de façon productive, l'autophagie est inhibée, suggérant qu'une ou plusieurs protéines virales soient capables de bloquer ce processus. L'objectif de ce travail de thèse a été de rechercher ces protéines virales et leur mécanisme d'action. Un crible double hybride en levure a permis de mettre en évidence que plusieurs protéines du VIH-1 sont capables d'interagir avec des protéines autophagiques (Atg), et plus spécifiquement que la protéine virale Vif (Virion infectivity factor) interagit directement avec la protéine LC3, protéine essentielle au processus autophagique. Cette interaction a été confirmée en système in vitro et in vivo (GST pull-down et immunoprécipitation). Plusieurs mutants des protéines Vif et LC3 ont été réalisés pour déterminer les domaines de liaison. La partie C-terminale de Vif ainsi que la glycine C-terminale de LC3, responsable de la conjugaison au phosphatidylethanolamine (PE), semblent être les domaines impliqués dans cette interaction. Une des principales fonctions de Vif connues est de dégrader, via le protéasome, les facteurs cellulaires APOBEC (Apolipoprotein B mRNA-editing, enzyme-catalytic, polypeptide-like) et en particulier la protéine APOBEC3G (A3G). Les résultats montrent que Vif est impliquée dans le blocage de l'autophagie induite par l'enveloppe indépendamment de son action sur A3G. / Autophagy is a lysosomal degradation pathway involved in the innate and adaptative immunity. The relationship between the Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) and autophagy is complex. The team has demonstrated that autophagy is induced in uninfected CD4 T cells after contact with infected cells expressing HIV-1 envelope glycoproteins (Env), leading to apoptosis. In contrast, when these cells are productively infected, autophagy is repressed, suggesting that one or several viral proteins are able to block this process. The aim of the thesis was to search these viral proteins and to determine their mechanism of action. A two-hybrid screen has revealed that several HIV-1 viral proteins are able to interact with autophagic proteins (Atg). In particular, Vif (Virion infectivity factor) interacts directly with LC3, a protein involved in the formation of autophagosomes. This interaction has been confirmed in vitro and in vivo (GST pull-down and immunoprecipitation). Several mutants of Vif and LC3 have been done to analyze the binding domains. The C-terminal part of Vif and the C-terminal glycine of LC3, responsible for the conjugation to PE, seem to be involved in the interaction between Vif and LC3.Vif plays an important role during HIV-1 infection. One of its main functions is to degrade, by the ubiquitin-proteasome system, the antiviral factors called APOBECs (Apolipoprotein B mRNA-editing, enzyme-catalytic, polypeptide-like) and in particular APOBEC3G (A3G). Our results demonstrate that Vif is involved in the blockade of Env-mediated autophagy independently of its role on A3G.

Vif (Viral Infectivity Factor) est une protéine auxiliaire qui augmente le «fitness» viral dans l’hôte infecté. Vif est essentielle à la formation de particules virales infectieuses dans les cellules dites «non-permissives», alors que des virus ΔVif se répliquent efficacement dans des lignées cellulaires T dites « permissives ». Les cellules non-permissives expriment les facteurs de restriction APOBEC3G (APOlipoprotein B mRNA-Editing enzyme Catalytic polypeptide 3G ou A3G) et A3F, deux cytidine désaminases dont l’action hypermutatrice est létale pour le virus. Vif réduit de façon considérable le taux d’expression des protéines A3G/3F par deux mécanismes principaux : (1) en recrutant une E3 ubiquitine ligase, Vif induit la dégradation d’A3G par le protéasome et (2) en se fixant sur l’ARNm, Vif régulant négativement la traduction d’A3G par un mécanisme dépendent de la région 5'-UTR. L'objectif de mon projet a été de déterminer le rôle et le mécanisme de la régulation traductionnelle du facteur de restriction A3G par la protéine Vif du VIH-1 ex vivo. En parallèle, nous nous sommes intéressés à déterminer les domaines de la protéine Vif impliqués dans l’activité chaperonne d'ARN. Par l’analyse des « westerns blots » issus de co-transfections de différents vecteurs d’expression d’A3G en présence ou absence de Vif et d’un dominant négative de la Cullin 5, nous avons démontré ex vivo que Vif requiert les tiges boucles 2 et 3 de la région 5’UTR (de façon simultanée) pour inhiber la traduction d’A3G. La régulation traductionnelle d’A3G par Vif cause 50% de la réduction total d’A3G en présence de Vif. Ensuite, nous avons observé qu’une une petite uORF (Upstream Open Reading Frame), contenue entre ces deux tiges-boucles est nécessaire pour l’inhibition d’A3G par Vif. Les uORFs, présents dans 50 % des gènes eucaryotes, interviennent principalement dans des mécanismes de régulation traductionnelle. Ainsi, nous avons observé in vitro et ex vivo que l’uORF régule négativement la traduction de l’ORF majeure d’A3G. Par l’analyse de l’expression de différents mutants de l’uORF, nous avons démontré ex vivo que 60% des complexes d’initiation de la traduction synthétisent A3G par « leaky scanning » et 40 % sont recrutés dans la traduction de l’uORF, en inhibant ainsi l’expression d’A3G. A partir de ces résultats nous proposons un modèle de l’inhibition d’A3G par Vif. Dans ce modèle, Vif pourrais inhiber l’étape de terminaison de la traduction de l’uORF en causant un « stalling » des ribosomes en empêchant ainsi à des nouveaux complexes d’initiation d’attendre l’ORF majeur. Nous avons aussi déterminé l’impact de la régulation traductionnelle d’A3G par Vif sur l’incorporation d’A3G dans les particules virales et sur l’infectivité virale. Nous avons alors observé que l’inhibition traductionnel d’A3G par Vif réduit l’incorporation d’A3G dans les particules virales avec un profil de diminution d’A3G similaire à celui observé dans les cellules. En utilisant des cellules indicatrices TZM-bl, nous avons ensuite observé que l’inhibition traductionnelle d’A3G par Vif augmente l’infectivité virale de 50%. Finalement, nous avons déterminé les domaines de la protéine Vif impliqués dans l’activité chaperonnes d'ARN. En utilisant des essaies de dimérisation des fragments d’ARN du VIH-1, nous avons pu mettre en évidence que le domaine C-terminal de la protéine Vif était impliqué dans cette activité. Ces résultats nous ont permis de mieux comprendre ce phénomène de restriction cellulaire et pourraient être importants dans le développement de nouvelles stratégies d’inhibition de la réplication virale qui ciblerait spécifiquement l’interaction de Vif avec l’ARNm d’A3G. / The HIV-1 viral infectivity factor (Vif) is a small basic protein essential for viral fitness and pathogenicity. Vif allows productive infection of non-permissive cells (including most natural HIV-1 targets) by counteracting cellular cytosine deaminases APOBEC3G (A3G) and A3F by different mechanisms and thus preventing its incorporation into viral particles. The Vif-induced degradation of A3G through the proteasome pathway has been extensively studied, but little is known about the translational repression of A3G mRNA by Vif. After cellular co-transfection of A3G mRNA constructs mutated in their untranslated regions (UTRs) in presence or absence of Vif, and in conditions where the proteasome-induced degradation of A3G was inhibited, we show that the 5’-UTR of A3G mRNA is crucial for the translational inhibition by Vif. The core binding factor, CBF-, required to stabilize the Vif/A3G complex is dispensable for this specific repression. According to our previous secondary structural model of the 5’-UTR, the two distal stem-loop structures are sufficient for a complete translational inhibition of A3G. We show that residue K26 of Vif is critical for A3G neutralization, both for its proteasome-induced degradation and translation inhibition of itsmRNA. Interestingly, we observe a strict correlation between the cellular reduction of A3G through translation inhibition and the quantity of A3G incorporated into viral particles. Both mechanisms account for about 50% decrease of A3G in cell. Thus, we showed for the first time that A3G mRNA translational inhibition by Vif is a 5’-UTR mRNA-dependent mechanism, and that any of these two mechanisms, degradation or translation, is sufficient to restore viral infectivity. Regulating the translation of A3G could thus be considered as a new target to restore a functional expression of A3G and viral restriction.

Le VIH-1, via sa protéine Vif, contrecarre l’activité des facteurs de restriction A3G et A3F de plusieurs manières dont l’inhibition traductionnelle. Nous avons démontré que cette répression traductionnelle d’A3G par Vif est spécifique de la région 5’UTR. De plus, une séquence uORF contenue dans cette région est essentielle pour la régulation de la traduction ainsi que pour la répression par Vif. Nous avons montré qu’A3G et A3F sont traduits par leaky-scanning et ré-initiation et que la distance entre l’uORF et l’ORF principal est importante pour l’inhibition traductionnelle d’A3G et d’A3F. Ensuite, nous avons montré que ce mécanisme est très conservé à travers différents sous-types de Vif et que les acides aminés de Vif en position 39, 48 et 127 sont impliqués dans cette répression. Enfin, nous avons observé que l’interaction entre Vif et A3G est nécessaire pour la régulation traductionnelle. Des expériences de transfections des différents mutants d’A3G et d’A3F dans un système infectieux tel que le clone pNL4.3 sont envisagées. Celles-ci permettront de voir l’effet de l’uORF sur l’infectivité virale mais aussi sur l’assemblage, la maturation et la libération des nouvelles particules virales. / The HIV-1, through its Vif protein, counteracts the restriction factors A3G and A3F activity in several ways including translational inhibition. We demonstrated that this translational repression of A3G by Vif is specific of the 5’UTR. Moreover, an uORF sequence contained in this region is essential for both the translational regulation and the repression by Vif. We showed that A3G and A3F are translated by leaky-scanning and re-initiation mechanisms and that the distance between the two ORFs is important for the translational inhibition. Then, we showed that this mechanism is conserved among several Vif subtypes and that the Vif amino acids 39, 48 and 127 are implicated in this repression. Finally, we observed that the Vif-A3G interaction is necessary for the translational inhibition. A3G and A3F mutants transfections experiments into an infectious system like the pNL4.3 clone are considered. It will permit to observe the uORF effect on the viral infectivity but also on the assembly, the maturation and the release of the viral particles.

L’autophagie est un mécanisme de l’immunité innée contre le VIH-1 déclenché très rapidement dans les cellules T CD4 par les protéines d’enveloppe du virus (Env). Dans les cellules T CD4 appelées « bystander », c’est-à-dire où l’infection est abortive, l’autophagie entraine l’apoptose. Dans les cellules T CD4 infectées de façon productive, l’autophagie est inhibée, empêchant ainsi à la fois la dégradation du virus et/ou des protéines virales et l’apoptose médiée par Env. Le but de cette étude de doctorat est de comprendre comment l’autophagie est bloquée dans les cellules T CD4 infectées par le VIH-1. Durant la première année de ma thèse, j’ai contribué au travail montrant que Vif nouvellement synthétisé bloque l’autophagie dans les lymphocytes T CD4 infectés. Les données ont été publiées en Janvier 2015 dans AIDS sous le titre «HIV-1 viral infectivity factor interacts with microtubule-associated protein light chain 3 and inhibits autophagy». Ensuite, j’ai montré que Vpr contribue aussi à l’inhibition de l’autophagie. En effet, Vpr ectopique diminue grandement le nombre des autophagosomes présents dans les cellules T CD4 quand l’autophagie est induite par un inhibiteur de mTOR. De même, Vpr incorporé dans les virions diminue le nombre des autophagosomes présents dans les cellules T CD4 très rapidement après leur infection productive (4h et 8h). Dans le but de définir le mécanisme par lequel la protéine Vpr entraine ce blocage, j’ai fait des expériences de GST pull-down et j’ai identifié que Vpr interagit avec BNIP3, une protéine pro-autophagique. De plus, le niveau d’expression de BNIP3 est augmenté dans les cellules T CD4 après le contact avec Env, suggérant que BNIP3 pourrait être impliqué dans l’induction de l’autophagie médiée par l’Env. Vpr co-localise avec BNIP3 et Vpr incorporé dans les virions induit une diminution drastique du niveau d’expression de BNIP3 après 8 heures d’infection. En conclusion, j’ai montré qu’au moins deux protéines du VIH-1 sont séquentiellement impliquées dans l’inhibition de l’autophagie dans les cellules T CD4 infectées par le VIH-1, Vpr qui contrôle l’autophagie durant la phase précoce de l’infection, et Vif néo-synthétisé qui inhibe l’autophagie après la transcription du génome viral. La compréhension complète des mécanismes par lesquels le VIH-1 inhibe l’autophagie devrait à terme permettre l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce virus. / Autophagy is a potent anti-HIV-1 mechanism. It is triggered in CD4 T cells by the viral envelope (Env) upon HIV-1 entry. In bystander CD4 T cells, autophagy leads to apoptosis. In productively infected CD4 T cells, autophagy is inhibited, preventing thus HIV-1 virophagy and Env-mediated apoptosis. The aim of my PhD study was to understand how autophagy is blocked in the HIV-1-infected CD4 T cells. During the first year of my thesis, I contributed to the work demonstrating that Vif neosynthesized blocks autophagy in the infected CD4 T lymphocytes. The data were published in January 2015 in AIDS under the title “HIV-1 viral infectivity factor interacts with microtubule-associated protein light chain 3 and inhibits autophagy”. Then, I demonstrated that Vpr contributes also to the inhibition of autophagy. Indeed, both ectopic expression of Vpr and Vpr incorporated into the virions decrease the number of autophagosomes in CD4 T cells when autophagy is induced by an inhibitor of mTOR and Env, respectively. To define the mechanism by which HIV-1 Vpr inhibits autophagy, I performed GST pull-down experiments and identified that Vpr interacts with BNIP3, a pro-autophagic protein. Importantly, BNIP3 expression level is increased in CD4 T cells upon Env contact, suggesting that BNIP3 could be responsible for the Env-mediated induction of autophagy. Furthermore, Vpr co-localizes with BNIP3 and viral incorporated Vpr decreases BNIP3 levels after 8 hours of infection. In conclusion, I demonstrated that at least two HIV-1 proteins are sequentially involved in the inhibition of autophagy in HIV-1-infected CD4 T cells, Vpr that controls autophagy during the early phase of infection, and then neo-synthesized Vif that inhibits autophagy after HIV-1 genome transcription. The complete understanding of the mechanisms by which HIV-1 inhibits autophagy should lead to the rising of new molecular strategies to fight against this virus.

A dissertation submitted to Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, in fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science in Medicine Johannesburg, June 2016 / Human Leukocyte Antigen (HLA) class I (HLA-I)-restricted CD8+ cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses are major drivers of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) evolution, resulting in the selection of CTL escape mutants. This is particularly well described for HIV-1 proteins such as Gag, Pol and Nef. For the accessory proteins Vif, Vpr and Vpu though, it is still not clear to what extent HLA-I-mediated responses influence their evolution. Moreover, preliminary data from our laboratory showed that Vpu was the most targeted of the accessory proteins with regards to CD8+ CTL and natural killer (NK) cell responses in a long term non progressor/elite controller cohort. Thus, the overall aims of the study were to describe immune escape in Vif, Vpr and Vpu epitopes from HIV-1 infected patients in South Africa, and to clone, express and purify recombinant Vpu for the ultimate detection of anti-Vpu antibodies in South African patient sera. Longitudinal plasma samples were available for 25 patients from two cohorts (18 from Lung and seven from M002). Viral RNA was extracted and the vif, vpr and vpu regions were RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) amplified and sequenced. HLA-A, B and C data for Lung cohort individuals were available, thus the HLA-A, B and C alleles were typed and assigned for the M002 cohort individuals. The Vif, Vpr and Vpu amino acid sequences were subsequently extensively analysed for HLA-driven CTL escape mutations. Lastly, three vpu sequences, Cons. C, 05ZAFV05 and 05ZAFV15 were selected for codon-optimization (humanized), each cloned into the pcDNA3.1/V5-His mammalian expression vector, and used to optimize expression of recombinant Vpu proteins in HEK 293T cells. The HEK 293T cells were harvested and the Vpu was purified using standard nickel affinity chromatography procedures. Protein expression and purification was monitored by SDS-PAGE, Western blot and dot blot analyses. Overall, longitudinal sequences were obtained from Vif, Vpr and Vpu from eight of the 18 patients in the Lung cohort and all seven patients in the M002 cohort. Of these, HLA-driven immune escape mutations were detected in four patients from the Lung cohort and six from the M002 cohort. Interestingly, for the M002 cohort, some reversions to the baseline sequences were noted over time. None of the identified escape mutations are amongst the best described and most optimal HIV-1 CD8+ CTL epitopes of HIV-1 accessory proteins in the HIV-1 databases. Eight and eleven HLA alleles contributed to immune escape in the Lung and M002 cohort Vif, Vpr and/or Vpu sequences, respectively. Overall, HLA-driven immune pressure in the Vif, Vpr and/or Vpu motifs described here may have contributed to the changes in viral loads seen in these patients over time, and likely impacted iii on disease progression, albeit in combination with escape mutations in the more highly targeted HIV-1 proteins, such as Gag, Pol and Nef. Future work looking at longitudinal sequence analysis of the entire HIV-1 proteome in these patients will likely reveal the contributing factors leading to immune escape and ultimately impact disease progression to AIDS. Expression of all three recombinant Vpu proteins in HEK 293T cells was successfully optimized however, as evidenced by SDS-PAGE, Western blot and dot blot analyses, the expression and purification protocol used in this study did not provide sufficient protein yields, nor an optimally purified protein for use in the downstream assays required. Future work will focus on optimization of Vpu expression and purification protocols to aid in the detailed elucidation of the role of Vpu and anti-Vpu immune responses in control of HIV-1 infection. / MT2016

Productive HIV-1 transcription yields a single ∼­9.2kb RNA. From this ∼9.2kb genomic RNA, greater than 40 different subgenomic mRNAs can be produced through alternative splicing using four 5' splice sites (ss) and seven 3'ss. Splice site utilization is governed by the inherent strength of the splice sites and by several identified cis acting elements. The HIV-1 Vif protein, required to overcome the cellular antiviral factor APOBEC3G, is encoded by a singly-spliced mRNA coupling 5'ss D1 to 3'ss A1. Alternatively, mRNAs spliced at A1 can utilize a downstream 5'ss, D2, resulting in inclusion of non-coding exon 2 in a small percentage of mRNAs. Expression of vif mRNA within infected cells is required but maintained at low levels. The purpose of studies described in this thesis was to identify and characterize elements within the HIV-1 genome regulating vif mRNA splicing. We identified an exonic splicing enhancer (ESE) within the 18nt downstream of HIV-1 3'ss A1, ESEVif. Mutation of ESEVif within the HIV-1 proviral clone pNL4-3 resulted in a dramatic decrease in vif mRNA, Vif protein, and undetectable levels of non-coding exon 2 inclusion. The cellular splicing factor SRp75 was found to selectively bind ESEVif in vitro. ESEVif mutant virus replicated in APOBEC3G-deficient T-cell lines as efficiently as wild-type virus. In APOBEC3G-producing T-cell lines, ESEVif mutant virus replicated to lower levels than wild-type virus. Other studies have identified additional mRNA splicing elements regulating splicing at A1: the downstream 5'ss D2 can promote or repress splicing, a G4 motif downstream of D2 represses splicing, and two ASF/SF2 dependent splicing enhancers, ESEM1 and ESEM2, promote splicing. Mutational analysis described in this thesis determined that loss of both ESEVif and the G4 motif resulted in wild-type levels of splicing at A1. Mutations of each identified ESE influenced vif mRNA splicing in the order ESEVif>ESEM2>ESEM1. The data presented in this thesis support a model of vif mRNA splicing regulation in which exon 2 ESE act to overcome the negative G4 motif insuring sufficient levels of Vif production for efficient replication in the presence of APOBEC3G.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2007. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 85-91).