Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-05-25T15:38:09Z No. of bitstreams: 1 2015_ClaraWandenkolckSilvaAragao.pdf: 3436680 bytes, checksum: 3d0c8dc4a9c57be55b904c8f703085ac (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-05-25T20:56:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ClaraWandenkolckSilvaAragao.pdf: 3436680 bytes, checksum: 3d0c8dc4a9c57be55b904c8f703085ac (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-25T20:56:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ClaraWandenkolckSilvaAragao.pdf: 3436680 bytes, checksum: 3d0c8dc4a9c57be55b904c8f703085ac (MD5) / Lonomia obliqua (Lepidoptera: Saturniidae) é uma lagarta venenosa de importância médica devido a severidade de acidentes causados no Brasil pelo contato dessas lagartas com humanos. Patógenos naturais foram isolados dessa lagarta, como o baculovírus Lonomia oblique multiple nucleopolyhedrovirus – LoobMNPV. Nesse contexto, esse trabalho envolve o sequenciamento, a montagem, a análise da composição genômica e do contexto evolutivo de LoobMNPV. Esse genoma possui 120,023 pb, 134 ORFs, 12 ORFs únicas, 7 regiões homólogas (hrs) e conteúdo G+C de 35,7%. Baseado em análises que incluem os genes conservados de baculovírus (core genes) de 72 espécies únicas de baculovírus sequenciados, LoobMNPV localiza-se filogeneticamente no grupo I de Alphabaculovirus, pertencente a um clado irmão aos genomas similares a AcMNPV, apresentado também inversões e rearranjos genômicos em relação a esse clado. Uma das ORFs únicas (LoobNPVOrf-35) apresentou similaridade (E-value de 3e10-11) significativa a um Fator de Terminação de Transcrição (Transcription terminator factor -TTF2) oriundo do lepidóptero Danaus plexippus (GenBank: EHJ68439.1). Por outro lado, ao restringir essa busca aos baculovírus, essa ORF também apresentou similaridade (E-value de 1e10-6) ao Global Transactivator (GTA) de Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus (Genbank:YP_611073.1). Esses resultados indicam duas hipóteses para a possível origem dessa ORF em LoobMNPV: esse gene pode ter sido adquirido independentemente por transferência horizontal de genes, ou é uma variação divergente do gene GTA. Esse genoma também apresentou a ausência dos genes da catepsina e quitinase, que por sua vez estão envolvidos na liquefação do hospedeiro ao final da infecção, propiciando a dispersão dos corpos de oclusão do baculovírus no ambiente. Essa ausência pode estar relacionada ao hábito gregário observado em Lonomia obliqua. / Lonomia obliqua (Lepidoptera: Saturniidae) is a poisonous larvae of medical importance due to the severity of accidents caused by the contact of these larvae with humans occurred in Brazil. Natural pathogens were isolated from these larvae, such as the baculovirus Lonomia oblique multiple nucleopolyhedrovirus – LoobMNPV. In this work, we have sequenced the genome of the baculovirus LoobMNPV and analyzed its genomic composition and evolutionary history. The genome is 120.023 bp long, comprising 135 putative ORFs, 12 unique ORFs, 7 homologous regions (hrs), and 35, 7% G+C content. Furthermore, in an evolutionary context, based on analysis that include the core genes from 72 unique species of sequenced baculovirus, LoobMNPV is located among Alphabaculovirus group I, as a sister-clade of the AcMNPV-like genomes, also presenting genomic inversions and rearrangements when compared to this clade. Interestingly, one unique ORF (LoobNPVOrf-35) showed significant similarity (E-value equals to 3e10-11) to a eukaryotic Transcription Terminator Factor (TTF2) from the lepidoptera Danaus plexippus (GenBank: EHJ68439.1). On the other hand, when restricting this search only to baculoviruses, this ORF also demonstrated similarity (E-value of 1e10-6) to the Global Transactivator (GTA) gene from Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus (Genbank: YP_611073.1). These results indicated two hypothesis: this gene may have been independently acquired from the host through horizontal transfer, or it is a divergent variation of the GTA. This genome also lacks the cathepsin and chitinase genes that are involved in the host liquefaction at the end of the infection, benefiting the spread of the baculovirus occlusion bodies in the environment. This absence may be due to the gregarious habits observed in Lonomia obliqua.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-26T20:04:04Z No. of bitstreams: 1 2016_SaluanaRochaCraveiro.pdf: 3241510 bytes, checksum: 02323233a9f77526e278dded20e15f95 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-10T17:19:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_SaluanaRochaCraveiro.pdf: 3241510 bytes, checksum: 02323233a9f77526e278dded20e15f95 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-10T17:19:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_SaluanaRochaCraveiro.pdf: 3241510 bytes, checksum: 02323233a9f77526e278dded20e15f95 (MD5) / Chrysodeixis includens nucleopolyhedrovirus (ChinNPV) é um vírus patogênico à lagarta falsa-medideira, Chrysodeixis includens (Walker, 1858), uma praga polífaga que ataca 174 plantas hospedeiras, incluindo soja e algodão. Os baculovírus formam um grande grupo de vírus de DNA fita dupla circular, que infectam insetos da ordem Lepidoptera, Hymenoptera e Diptera. Para uma melhor compreensão da virulência, evolução e biologia molecular de ChinNPV, este trabalho teve como objetivo determinar a sequência completa do genoma e a diversidade genética de sete isolados de ChinNPV (IA a IG). A diversidade genética foi inicialmente investigada por meio de análise das variações presentes nos core genes pif-2, lef- 9 e helicase de isolados de ChinNPV e de outros Alphabaculovirus. O gene pif-2 de ChinNPV recebeu destaque por, em contraste com o esperado, apresentar um grande número de polimorfismos não-sinônimos com a identificação de dois sítios sob pressão diversificadora. Os genomas dos isolados de ChinNPV (IA a IG) possuem tamanho variando de 138.869 a 140.859 bp e conteúdo de CG ~ 39%. Um total de 142 ORFs foram identificadas incluindo 37 core genes, 102 genes encontrados em outros baculovírus, 3 genes bro e duas ORFs únicas (Psin5 e Psin8). Homologous repeats (hrs), típicas de baculovírus, estão ausentes no genoma de ChinNPV. Os genomas dos isolados de ChinNPV têm alta similaridade com identidade mínima de 96,4% e, polimorfismos, indels e pequenos fragmentos foram observados ao longo dos genomas. Dois homólogos ao gene p26 (p26a e p26b) foram encontrados em ChinNPV. O padrão de agrupamento observado no cladograma da proteína P26 de NPVs indica que a aquisição do gene ocorreu em três eventos independentes de captura dentro da família Baculoviridae. ChinNPV tem uma sequência genômica distinta comparada a outros baculovírus sequenciados. As sete novas sequências do genoma completo de ChinNPV determinadas aqui constituem uma importante ferramenta para o melhor entendimento dos fatores de virulência, interação inseto-hospedeiro e da variação fenotípica observada em populações de baculovírus. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chrysodeixis includens nucleopolyhedrovirus (ChinNPV) is a virus pathogenic to the soybean looper, Chrysodeixis includens (Walker, 1858), a polyphagous pest that attacks 174 host plants including soybean and cotton. Baculoviruses are a large group of circular doublestranded DNA viruses that infect insects of the orders Lepidoptera, Hymenoptera and Diptera. In order to better understanding the virulence, evolution and molecular biology of ChinNPV, this study aimed to determine the complete genome sequence and genetic diversity of seven ChinNPV (IA to IG) isolates. Genetic diversity was initially investigated by analyzing variation present in the pif-2, lef-9 and helicase core genes in ChinNPV and other Alphabaculovirus isolates. The pif-2 gene unexpectedly showed a large number of non-synonymous polymorphisms with two sites identified to be under diversifying selection. The ChinNPV (IA to IG) genomes range in length between 138,869 and 140,859 bp and GC content of ~39% A total of 142 ORFs were identified including 37 baculovirus core genes, 102 genes found in other baculoviruses, three bro genes and two ORFs unique to ChinNPV (Psin5 and Psin8). The typical baculoviral homologous repeats (hrs) are absent in the ChinNPV genome. The ChinNPV genomes have high similarity with minimal identity of 96.4% and polymorphisms, indels and small fragment insertions throughout the genome were observed. Two p26 gene homologs (p26a and p26b) were found in the ChinNPV genome. The clustering pattern seen in the cladogram of NPV P26 protein indicates that the acquisition of these genes occurred in three independent capture events within the family Baculoviridae. ChinNPV has a distinct genomic sequence compared to other baculoviruses sequenced so far. The seven new ChinNPV whole genome sequences determined herein constitute an important tool for a better understanding of virulence factors, insect-host interaction and phenotypic variation observed in baculovirus populations.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-07T15:37:54Z No. of bitstreams: 1 2016_LeonardoAssisdaSilva.pdf: 45220811 bytes, checksum: 82b91a980d6f3f5f5fc0367dde4e22b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-03-27T14:15:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LeonardoAssisdaSilva.pdf: 45220811 bytes, checksum: 82b91a980d6f3f5f5fc0367dde4e22b2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-27T14:15:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LeonardoAssisdaSilva.pdf: 45220811 bytes, checksum: 82b91a980d6f3f5f5fc0367dde4e22b2 (MD5) / Baculovírus são vírus de DNA de dupla fita circular que infectam insetos, inicialmente utilizados apenas como controle biológico por serem capazes de eliminar insetos-praga associados à agricultura. Nas décadas de 70 e 80, seu potencial como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas começou a ser explorado. Hoje, os baculovírus têm sido utilizados amplamente para expressar antígenos de uso vacinal ou diagnóstico e até mesmo utilizados como potenciais vetores de terapia gênica e vacinas de DNA. Sua biossegurança é garantida pelo fato de não serem capazes de se replicar em células de mamífero. Entretanto, são capazes de penetrar nessas células, além de apresentarem propriedades imunoestimulatórias. Deste modo, inúmeras proteínas de importância médica e econômica foram expressas em níveis elevados aplicando desse sistema. Atualmente, não existem indústrias ou empresas nacionais disponíveis para a produção escalonável do antígeno de superfície HBsAg. Perante disso, os insumos são importados tanto para fins vacinais como para o diagnóstico. A vacina anti-rábica altualmente é constituída por suspensões de vírus purificados e inativados com β- propiolactona, representando um risco de manipulação. Portanto, a produção de proteínas virais recombinantes permitiu o desenvolvimento e métodos de diagnóstico e vacinas mais seguras. Neste trabalho foram construídos baculovírus recombinantes contendo os genes do antígeno HBsAg de HBV e de um peptídeo imunogênico derivado da glicoproteína do vírus da Raiva (Pept/G), fusionados à proteína poliederina (POLH) do baculovírus Autrographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). As proteínas recombinantes foram expressas em inseto e culturas de células na forma de agregrados protéicos cristalinos. A proteína recombinante contendo o antígeno HBSAg foi reconhecida por anticorpos anti-HBsAg em testes de imunoensaio (EIA) comerciais. A protéina recombinante contendo o Pept/G foi capaz de estimular o sistema immune de camundongos com sucesso, verificado por meio da proliferação celular in vitro. Desta forma, é possível concluir que proteínas recombinantes derivadas de vírus humanos fusionadas à protéina POLH de baculovírus são uma alternativa para a produção destes antígenos. / Baculovirus are circular double-stranded DNA viruses that infect insects and initially used only as biological control agents for being able to eliminate insect pests associated with agriculture. In the 1970s and 1980s, its potential as a tool for the expression of heterologous proteins began to be explored. Today, baculoviruses have been used extensively to express antigens for vaccine production, diagnostics and even as potential vectors for gene therapy and DNA vaccines. Their biosafety isguaranteed by the fact that baculoviruses are not able to replicate in mammalian cells. However, they can enter these cells and present immunostimulatory abilities. In this way, numerous proteins of medical and economic importance have been expressed at high levels applying this system. Currently, there are no Brazilian-based companies available to produce HBsAg surface antigen in a large scale, and the supplies to produce both vaccines and diagnostic kits are imported from other countries. The rabies vaccine currently consists of purified and inactivated virus suspensions with β-propiolactone, representing a health risk from its manipulation. Therefore, the use of recombinant proteins from viruses allowed the development of safer diagnostic methods and vaccines. In addition, this strategy may reduce the cost of vaccine manufacturing and eventually, contribute towards disease control. In this work, we constructed two recombinant baculoviruses; one containing of sHBsAg antigen gene of HBV and second recombinant containing an immunogenic peptide derived from the rabies virus glycoprotein (Pept/G). Both were fused to the polyhedrin protein (POLH) of the baculovirus Autrographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Recombinant proteins were expressed in insect cells and in insects in the form of crystalline protein aggregates. The recombinant protein containing the HBSAg antigen was used in commercial immunoassay (EIA) tests and was recognized by the anti-HBsAg antibodies. A recombinant protein containing Pept/G could successfully stimulate the immune system of mice which was verified by cell proliferation in vitro. Thus, it is possible to conclude that recombinant proteins derived from human viruses fused to the baculovírus POLH protein are an alternative to produce diagnostic tests and possible subunit vaccines.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Orientador estrangeiro: Dr. Rollie J. Clem / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2015-12-01T15:33:38Z No. of bitstreams: 1 2015_DanielMendesPereiraArdissondeAraujo.pdf: 8216805 bytes, checksum: 109b644e5fc85d2df24444e26967bb22 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-01-23T12:13:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_DanielMendesPereiraArdissondeAraujo.pdf: 8216805 bytes, checksum: 109b644e5fc85d2df24444e26967bb22 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-23T12:15:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_DanielMendesPereiraArdissondeAraujo.pdf: 8216805 bytes, checksum: 109b644e5fc85d2df24444e26967bb22 (MD5) / Baculovirus são vírus de DNA dupla-fita circular capazes de infectar oralmente o estágio larval de insetos. Atualmente, são usados para o controle biológico de insetos praga e como vetores de expressão de proteínas heterólogas. Pouco é sabido das bases moleculares da interação do vírus com o hospedeiro e de sua evolução. Os fatores limitantes estão associados ao número de genomas sequenciados bem como a restrição do cultivo in vitro de várias espécies virais. De fato, a base para o início de quaisquer estudos moleculares mais detalhados de novas espécies de baculovírus ou de isolados certamente se inicia com o sequenciamento do genoma completo e com o estudo de genes encontrados. Dessa forma, neste trabalho, vários genomas de baculovírus isolados no Brasil foram sequenciados e descritos. Sequenciamos e descrevemos baculovírus isolados do mandarová-da-mandicoca, da broca da cana-de-açúcar, do bicho da seda, da lagarta polífaga Helicoverpa armigera, do mandarová-do-mate entre outros. Concomitante à descrição do genoma, caracterizamos estruturalmente algumas espécies, avaliamos a taxa de mortalidade em situações controladas de infecção, bem como caracterizamos alguns genes que permitiram um entendimento evolutivo mais amplo das espécies descritas e de sua interação com o hospedeiro. Descrevemos o primeiro inibidor de serino protease de baculovírus capaz de bloquear a imunidade inata do inseto hospedeiro e causar proteção ao patógeno. Encontramos o primeiro betabaculovírus com uma proteína de fusão de envelope de alphabaculovírus, a gp64 e caracterizamos sua funcionalidade. Além disso, mostramos pela primeira vez o papel de genes envolvidos no metabolismo de nucleotídeo e sua capacidade de alterar o desempenho viral. Em conclusão, baculovírus apresentam plasticidade genômica com aquisições proeminentes de genes de vários organismos como outros vírus de insetos, bactérias e plantas. Além disso, perdas de genes ancestrais e duplicação são eventos recorrentes. Tanto a genômica quanto o estudo molecular básico de baculovírus tem contribuído para a compreensão de doenças associadas a humanos como câncer e doenças virais cujo agente etiológico apresenta genoma com DNA dupla-fita ou que infectam primariamente o intestino médio de insetos, como herpesvírus e arboviroses, respectivamente. / Baculoviruses are circular double-stranded DNA viruses that are orally infectious to larval stages of insects. Nowadays, they are used as biological control agents of agricultural and forest pests and as vector for heterologous protein expression. The understanding of both the molecular basis and the evolution of the virus/host interaction is scarce due to the few numbers of sequenced genomes and the restriction in cultivating several virus species in vitro. In fact, the beginning of any molecular study of new baculovirus species or isolates certainly pervades the whole genome sequencing. Therefore, in this work, several genomes of baculoviruses isolated in Brazil were sequenced and described. We sequenced and described baculoviruses isolated from subject cadavers of the cassava hornworm (Erinnyis ello), the sugar cane borer (Diatraea saccharalis), the silkworm (Bombyx mori), the bollworm (Helicoverpa armigera), and the mate hornworm (Perigonia lusca). Together with the genome description, we characterized structurally some species, evaluated the mortality in controlled infections, and characterized as well some genes to better understand the novel species and their interaction with the host. We described the first baculoviral serine protease inhibitor capable of blocking the insect immunity response and causing pathogen protection. We found the first betabaculovirus harboring an alphabaculovirus envelope fusion protein, a gp64 and we characterized its functionality. Furthermore, we have shown for the first time a role of genes related to nucleotide metabolism and it ability of altering the virus fitness. In conclusion, baculoviruses present genomic plasticity with great and recurrent acquisition of genes from several organisms including other insect viruses, bacteria, and plant. Moreover, ancestral gene losses and duplication are common events in baculovirus evolution. Both genomics and molecular biology of baculovirus have contributed to the comprehension of human-associated diseases such as cancer and viral whereas the etiologic agent presents dsDNA genome or infects primarily the insect midgut like herpexviruses and arboviruses, respectively.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-06-19T16:20:52Z No. of bitstreams: 1 2017_FabríciodaSilvaMorgado.pdf: 7664868 bytes, checksum: 4767942a70994bbd3c3882749c32c0a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-18T16:45:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_FabríciodaSilvaMorgado.pdf: 7664868 bytes, checksum: 4767942a70994bbd3c3882749c32c0a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-18T16:45:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_FabríciodaSilvaMorgado.pdf: 7664868 bytes, checksum: 4767942a70994bbd3c3882749c32c0a1 (MD5) Previous issue date: 2017-08-18 / Os baculovírus são vírus que infectam larvas de mariposas e borboletas. São vírus capazes de formar dois fenótipos virais ao longo da infecção celular separados temporalmente. O primeiro fenótipo, os budded vírus, são vírus que brotam da célula e retêm um envelope a partir da membrana celular. Estes servem como agentes da proliferação sistêmica dentro do corpo do hospedeiro. O segundo fenótipo, os occlusion derived virus, são partículas virais envelopadas no núcleo e oclusas dentro da matriz cristalina formada pela proteína poliedrina, abundantemente expressa em momentos muito tardios da infecção. O progresso da infecção e os padrões de expressão gênica são controlados principalmente a nível transcricional, com base na sequência de DNA contida nos promotores dos genes. Para avaliar o programa transcricional e os elementos controladores das infecções baculovirais, desenvolvemos uma nova metodologia de detecção de luminescência em tempo real, derivada da infecção de células de inseto por baculovírus recombinantes contendo promotores de genes expressos em diferentes fases da infecção que controlam a expressão da proteína quimioluminescente Luciferase de vaga-lume. Isto permitiu, de forma inédita, a caracterização detalhada da expressão gênica a partir de promotores dos baculovírus Anticarsia gemmatalis MNPV e Autographa californica MNPV. O que revelou perfis de expressão diferenciais em linhagens permissivas, semipermissivas e não-permissivas à infecção por estes baculovírus. Também foram avaliados promotores do Bracovírus endosimbiótico encontrado em Microplitis demolitor, uma vespa parasita de larvas de Lepidoptera, através da metodologia de medição de luminescência em tempo real. Estes promotores derivados do Bracovírus apresentaram perfis de expressão similares aos de promotores tardios dos baculovírus. A capacidade de transdução e entrega gênica na linhagem celular derivada da vespa M. demolitor por baculovírus recombinantes também foi avaliada / The baculoviruses are infectious to the larvae of moths and butterflies. These are viruses capable of forming two distinct phenotypes throughout the cellular infection that are temporally separated. The first phenotype, the budded virus, are virions the budded thru the cell membrane, carrying an envelope. These are the agents of the systemic infection within the host’s body. The second phenotype, the occlusion derived virus, are enveloped viral particles that are occluded within the crystalline matrix that forms the occlusion bodies, that protect the virus in the environment in the absence of the host. The progress of the cell infection and the patterns of gene expression are controlled at the transcriptional level, mainly based on the DNA sequence of the gene promoters. To evaluate the transcriptional program and the controlling elements of the baculovírus, we developed a new methodology of real time detection of luminescence derived from the infection of insect cells by recombinante baculovírus containing gene promoters of different phases of the infection controlling the chemilluminescent firefly Luciferase protein. This allowed for the detailed characterization of the gene expression from selected Anticarsia gemmatalis and Autographa californica MNPV genes promoters. This revelaed differential patterns of expression in permissive, semipermissive and non-permissive cell lines. We also evaluated gene promoters of the endosymbiont Bracovirus found in Microplitis demolitor, a parasitic wasp of Lepidopteran larvae, using the real-time luminescence detection technique. These promoters revealed patterns similar to late gene promoters from the baculoviruses. The ability of recombinant baculovirus to transduce and deliver genes to a M. demolitor wasp derived cell line was also assessed.