L'efficacité thérapeutique de la majorité des molécules développées pour traiter les pathologies du système nerveux central (SNC) n’est pas optimale en raison des caractéristiques anatomiques et physiologiques uniques de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui joue un rôle majeur dans la protection du parenchyme nerveux. Une stratégie permettant de délivrer des agents pharmacologiques dans le cerveau est de détourner un système physiologique : la transcytose régulée par des récepteurs (RMT). Cette stratégie implique la conjugaison d’agents pharmacologiques à des vecteurs développés pour cibler spécifiquement des récepteurs présents au niveau de la BHE et impliqués dans des processus de RMT. Nous avons eu pour objectif de développer de nouveaux vecteurs spécifiques de récepteurs exprimés au niveau de la BHE. Nous avons tout d’abord construit une banque de phages présentant les vecteurs afin de réaliser différentes stratégies de sélection par phage display. A l’issue d’étapes de criblage, les vecteurs sélectionnés ont été produits et caractérisés (affinités pour les récepteurs, compétitions avec les ligands naturels…). Nous avons ensuite évalué le potentiel des vecteurs les plus prometteurs à transporter une biomolécule. Pour ce faire, deux vecteurs par récepteur ont été fusionnés à la région Fc d’une IgG1 humaine et la capacité des conjugués à traverser un modèle de BHE in vitro a été évaluée. Enfin, nous avons évalué la distribution cérébrale des vecteurs, chez la souris in vivo. L’ensemble de nos résultats démontre l'intérêt du ciblage des récepteurs choisis et le potentiel des de nos vecteurs pour des applications de délivrance cérébrale. / The vast majority of the molecules developed to treat neurological diseases do not reach their targets efficiently enough because of the unique anatomical and physiological features of the blood-brain barrier (BBB) which plays a major protective role. Hijacking a physiological system named receptor-mediated transcytosis (RMT) is considered a promising route for brain delivery of pharmacological. This strategy involves the conjugation of pharmacological agents to vector molecules developed to specifically target receptors present at the BBB and involved in RMT processes. We aimed to develop new vectors specific for receptors expressed at the BBB. First, we constructed a phage library presenting vectors in order to perform various phage display selection strategies. Following screening steps, the selected vectors were produced and characterized (affinities for the receptors, competitions with natural ligands…). Then, we assessed the potential of the most promising vectors to carry a biomolecule. Two vectors per receptor were fused to a human IgG1 Fc region and the fusion proteins were tested for their ability to cross an in vitro model of the BBB. Finally, we evaluated the brain distribution of the vectors, in mice in vivo. Our results demonstrate the potential of our receptor-targeting vectors for brain drug delivery.

La mélanotransferrine (MTf) a tout d'abord été identifiée comme étant un antigène majeur des mélanomes. Son expression a par la suite été rapportée dans plusieurs cellules néoplasiques et quelques tissus sains. Bien que la majorité de la MTf soit associée à la membrane plasmique, une faible portion est sécrétèe dans le milieu extracellulaire sous forme soluble. Notre équipe a récemment démontré que la MTf régulait l'activation du plasminogène et la motilité cellulaire in vitro. Les activateurs du plasminogène sécrétés par les cellules cancéreuses catalysent la conversion du plasminogène en protéase active. La plasmine joue un rôle central dans la progression tumorale en dégradant les protéines de la membrane basale et de la matrice extracellulaire (MEC). Ce remodelage tissulaire facilite grandement l'angiogenèse et l'invasion des cellules cancéreuses vers les tissus adjacents. Le premier objectif de cette thèse fut de démontrer que la MTf favorise l'activation du plasminogène par son activateur de type tissulaire (tPA). À cet effet, une forme recombinante tronquée de la MTf (sMTf) a été utilisée. En présence de plasminogène et de tPA, la sMTf stimule la formation de plasmine dans le milieu extracellulaire de cellules endothéliales (CE) et accroît la dégradation de la fibronectine, une des composantes de la MEC. La dégradation de la MEC conduit au détachement des CE et à leur mort par anoïkis. Ces données suggèrent que la sMTf possède des propriétés anti-angiogéniques en induisant l'anoïkis des CE. Nous avons ensuite évalué ses effets sur le développement angiogénique et sur la croissance tumorale in vivo. Les résultats montrent que la sMTf inhibe significativement la croissance de tumeurs sous-cutanées dérivées de glioblastome et de carcinome pulmonaire humains chez la souris immunosupprimée. Nous démontrons également que le traitement à la sMTf entraîne une réduction de l'expression du marqueur vasculaire d'endogline, de même qu'une diminution de la quantité d'hémoglobine au sein des tumeurs sous-cutanées de glioblastomes. L'ensemble de ces résultats démontre clairement que la sMTf réduit l'angiogenèse et la croissance tumorale in vivo. Tout comme la forme recombinante tronquée, la MTf membranaire (mMTf) interagit avec le système d'activation du plasminogène. La formation de plasmine à proximité de la membrane plasmique favorise l'invasion des cellules tumorales et le développement métastatique. La participation de la mMTf dans la formation de métastases cérébrales a donc été évaluée pour une lignée cellulaire de mélanome humain. Les résultats indiquent la présence de cellules exprimant la MTf humaine dans les cerveaux de souris ayant reçu une injection intraveineuse de cellules de mélanome humain. De même, l'administration d'un anticorps monoclonal dirigé contre la MTf humaine (L235) a réduit de moitié le développement de métastases cérébrales de mélanomes chez la souris. Ces résultats démontrent que l'implication de la mMTf dans l'activation du plasminogène faciliterait la migration des cellules cancéreuses à travers la barière hémato-encéphalique (BHE) et l'invasion du système nerveux central. Les principales contributions de ce travail sont d'avoir démontré d'une part que la sMTf induit le détachement des cellules endothéliales par stimulation de la cascade d'activation du plasminogène. D'autre part, la sMTf entraîne l'inhibition du développement angiogénique et de la croissance tumorale chez la souris. Puis, l'expression de la MTf à la surface des cellules cancéreuses facilite leur migration à travers la BHE dans le but de produire des métastases cérébrales. Cette étude identifie la MTf clairement comme une cible intéressante dans la progression tumorale, tout en suggérant des outils thérapeutiques comme la sMTf recombinante ou une forme humanisée du L235. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Croissance tumorale, Angiogenèse, Métastases cérébrales, Barrière hémato-encéphalique, Mélanotransferrine, Mélanome, Plasminogène.

La barrière hémato-encéphalique protège le cerveau de par son imperméabilité. Cela empêche toutefois le passage de potentielles molécules thérapeutiques contre les maladies du système nerveux central. En effet, à cause de leurs poids moléculaire et de leurs propriétés physicochimiques, nombreuses sont les molécules thérapeutiques développées par l’industrie pharmaceutique qui ne parviennent pas à atteindre leur cible au cerveau car elles sont bloquées par cette barrière. Les objectifs de mes travaux sont donc de valider puis de modifier des formulations d’immunoliposomes PEGylés pour améliorer leur devenir intracellulaire dans les cellules endothéliales des capillaires cérébraux qui forment la barrière hématoencéphalique. Après injection chez la souris, les liposomes atteignent les capillaires mais nous ne sommes pas parvenus à démontrer qu’ils y livrent leur contenu. Pour se faire, différentes formulations ont été testées in vitro et in vivo chez des modèles murins. Cela a permis de confirmer que les anticorps et les lipides formant les immunoliposomes atteignent bien les cellules endothéliales des capillaires du cerveau. Toutefois, le devenir du contenu des immunoliposomes reste incertain. Par la suite, l’idée était d’utiliser des fragments Fab’ à la surface des liposomes plutôt que des anticorps complets. Toutefois, la digestion des anticorps n’est pas complète et l’obtention de fragments Fab’ pures très complexe. Cela reste donc à améliorer avant de conjuguer les fragments aux liposomes.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Les maladies neurodégénératives se caractérisent par des accumulations anormales de protéines spécifiques dans le cerveau qui sont associées à la perte de fonctions cognitives comme la mémoire. Au cours des dernières décennies, des chercheurs ont remarqué des anomalies vasculaires et métaboliques chez une forte proportion de patients atteints de démence. L'une des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer (MA) en lien avec le déficit cognitif est que les patients présentent une diminution de la captation cérébrale du glucose, source d'énergie essentielle pour le cerveau. De plus, des études récentes suggèrent que le cerveau Alzheimer répond moins bien à l'insuline, une hormone essentielle à la vie impliquée non seulement dans le métabolisme mais aussi dans les processus d'apprentissage et de mémoire. Ainsi, cette forme de résistance cérébrale à l'insuline (RCI) observée dans la MA a motivé l'élaboration d'essais cliniques portant sur l'effet de l'insuline sur la MA. Néanmoins, nous ignorons toujours quels types de cellules et quels mécanismes sont impliqués dans l'action - et la perte d'action - de l'insuline au niveau du système nerveux central (SNC). La grande majorité de l'insuline est produite par le pancréas et sécrétée dans la circulation sanguine. Par conséquent, pour affecter le cerveau, l'insuline circulante doit d'abord interagir avec la barrière hémato-encéphalique (BHE) et ses cellules endothéliales, au niveau des capillaires cérébraux (CECCs), qui la captent grâce aux récepteurs de l'insuline (INSR), des protéines spécifiques à la surface de ces cellules. L'objectif général de cette thèse était de révéler comment la BHE s'intègre dans des processus pathologiques menant au développement des déficits métaboliques centraux observés dans la MA. Plus spécifiquement, il s'agissait de déterminer quelles dysfonctions au niveau cérébrovasculaire pouvaient mener au développement d'une insulinorésistance cérébrale et à un déficit énergétique au cerveau. Nous avons ainsi étudié les interactions avec leurs récepteurs respectifs de l'insuline, du glucose, et d'autres composés importants pour l'énergie et le métabolisme cérébrale comme les corps cétoniques et de l'hormone FGF21 afin de découvrir le rôle de chacun dans la MA ainsi que leur potentiel thérapeutique. Malgré l'absence de preuves in vivo, l'effet de l'insuline sur le cerveau est souvent attribué à une action directe sur les neurones. Cependant, nos travaux montrent dans un premier temps que l'insuline circulante interagit avec l'INSR situé préférentiellement sur les microvaisseaux cérébraux. Nous avons utilisé des protocoles complémentaires: la mesure postmortem des récepteurs cérébraux chez l'humain à partir d'échantillons de cerveaux provenant d'une étude longitudinale bien caractérisée, la Religious Order Study (ROS), ainsi que des expériences chez la souris, comme la perfusion cérébrale in situ (PCIS) dans un modèle de la neuropathologie Alzheimer, la 3xTg-AD. Une hypothèse traditionnellement répandue était que l'INSR médie le passage de l'insuline du sang à travers la BHE jusqu'au cerveau, mais nos travaux montrent que ce transport est non seulement très faible mais aussi indépendant de l'INSR. Nous démontrons également que la réponse de l'INSR à l'insuline se situe sur la BHE, et non dans le parenchyme, et que cette réponse est altérée dans la MA. La BHE est donc le site clé impliqué dans la RCI dans la MA. Nous avons également identifié l'INSRα-B comme l'isoforme principalement impliquée dans cette dysfonction. Enfin, nous proposons un mécanisme moléculaire impliquant la β-sécrétase (BACE1) dans le clivage anormal de l'INSR. Dans un second temps, nous avons étudié chez l'humain les niveaux cérébrovasculaires des protéines impliquées dans le transport vers le cerveau du glucose et des corps cétoniques, à savoir le transporteur du glucose 1 (GLUT1) le transporteur de monocarboxylates 1 (MCT1), respectivement. Nos données confirment tout d'abord que ces deux transporteurs sont enrichis dans les microvaisseaux de la BHE comparativement aux cellules du parenchyme cérébral. De plus, les niveaux vasculaires de GLUT1 sont réduits chez les individus atteints de la MA et sont fortement liés au déclin cognitif et au score cognitif global. Au contraire, les niveaux cérébrovasculaires de MCT1 ne sont pas modifiés chez les sujets atteints de la MA et ne sont pas liés à la performance cognitive, faisant des corps cétoniques une alternative énergétique attrayante pour le cerveau des personnes âgées. En troisième temps, nous avons caractérisé le transport du FGF21 impliqué dans la régulation du métabolisme énergétique au niveau du SNC dans plusieurs modèles de souris non-transgéniques. Nos résultats montrent que cette hormone hépatique est capable d'atteindre les CECCs, d'interagir avec elles et d'être transportée au niveau de la BHE grâce à un mécanisme saturable et indépendant de la phosphorylation de son récepteur FGFR1. Des mécanismes d'efflux régissent également le transport du FGF21 du cerveau vers le sang. Le transport cérébral du FGF21 demeure constant, que ce soit chez la souris 3xTg-AD âgée reproduisant les pathologies amyloïde et tau, ou à la suite d'une consommation de diète enrichie en gras pour induire des déficits métaboliques. En somme, ces résultats montrent que la BHE est impliquée dans plusieurs processus physiologiques de transport et de métabolisme cérébral, mais peut également participer à des processus pathologiques comme la RCI. Nos résultats supportent le ciblage de la BHE dans la recherche et le développement de thérapeutiques visant à maintenir un apport énergétique suffisant pour maintenir les fonctions cognitives dans la MA. / Neurodegenerative diseases are characterized by abnormal accumulations of specific proteins in the brain that are associated with the loss of cognitive functions such as memory. In recent decades, researchers have noted vascular and metabolic abnormalities in a high proportion of patients with dementia. One of the hallmarks of Alzheimer's disease (AD) in relation to cognitive impairment is that patients have decreased brain uptake of glucose, an essential energy source for the brain. In addition, recent studies suggest that the Alzheimer brain responds less well to insulin, an essential life-sustaining hormone involved not only in metabolism but also in learning and memory processes. Thus, brain insulin resistance (BIR) observed in AD has motivated the development of clinical trials investigating the effect of insulin on AD. However, we still do not know what cell types and mechanisms are involved in the action - and loss of action - of insulin in the central nervous system (CNS). The vast majority of insulin is produced by the pancreas and secreted into the bloodstream. Therefore, to affect the brain, circulating insulin must first interact with the blood-brain barrier (BBB) and its endothelial cells, in the brain capillaries (BCECs), which capture it through insulin receptors (INSR), specific proteins on the surface of these cells. The overall objective of this thesis was to reveal how the BBB is integrated into pathological processes leading to the development of central metabolic deficits observed in AD. More specifically, we wanted to determine which dysfunctions at the cerebrovascular level could lead to the development of the central resistance and energy deficit in the brain. We studied the interactions with their respective receptors for insulin, glucose, ketone bodies and the hormone FGF21 to discover the role of each in AD and their therapeutic potential. Despite the lack of in vivo evidence, the effect of insulin on the brain is often attributed to a direct action on neurons. However, our work shows that circulating insulin interacts with INSR located preferentially on cerebral microvessels. We used complementary protocols: postmortem measurement of brain receptors in humans from brain samples from a well-characterized longitudinal study, the Religious Order Study (ROS), as well as experiments in mice, such as in situ brain perfusion in a model of Alzheimer's neuropathology, the 3xTg-AD. A traditional assumption was that INSR mediates the passage of insulin from the blood across the BBB to the brain, but our work shows that this insulin transport is not only very weak but also independent of INSR. We also show that the INSR response to insulin is located at the BBB, not in the parenchyma, and that this response is impaired in AD. The BBB is therefore the key site involved in BIR in AD. We also identified INSRα-B as the isoform primarily involved in this dysfunction. Finally, we propose a molecular mechanism involving the β-secretase BACE1 in the abnormal cleavage of INSR. In a second step, we studied in humans the cerebrovascular levels of proteins involved in the transport to the brain of glucose and ketone bodies, namely GLUT1 and MCT1, respectively. Our data first confirm that these two transporters are enriched in BBB microvessels compared with brain parenchyma cells. Furthermore, vascular levels of GLUT1 are reduced in individuals with AD and are strongly related to cognitive decline and global cognitive score. In contrast, cerebrovascular levels of MCT1 are not altered in AD subjects and are not related to cognitive performance, making ketone bodies an attractive energy alternative for the elderly brain. Thirdly, we characterized in mice the transport of FGF21 involved in the regulation of energy metabolism in the CNS. Our results show that this hepatic hormone can reach the BCECs, interact with them and be transported to the BBB through a saturable mechanism independent of the phosphorylation of its receptor FGFR1. Efflux mechanisms also govern the transport of FGF21 from the brain to the blood. Brain FGF21 transport remains constant, both in aged 3xTg-AD mice mimicking amyloid and tau pathologies, and following consumption of a fat-enriched diet. In sum, these results show that the BBB is involved in several physiological processes of brain transport and metabolism but may also participate in pathological processes such as BIR. Our results support the targeting of the BBB in the research and development of therapeutics aimed at maintaining sufficient energy intake to sustain cognitive function in AD.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / La barrière hématoencéphalique (BHE) est une barrière biologique qui protège le cerveau de molécules potentiellement toxiques pour le SNC. Plusieurs études laissent penser que des modifications de la BHE ont lieu au cours de la maladie d’Alzheimer (MA). Ainsi, la BHE demeure un grand défi dans le développement de médicaments pour les maladies cérébrales. Cependant, des systèmes de transport biologique au niveau de la BHE pourraient être ciblés par des anticorps afin d’améliorer la disponibilité cérébrale de différents médicaments. Notre objectif était d’évaluer la BHE dans la MA et de quantifier l’accumulation cérébrale d’un anticorps monoclonal ciblant le récepteur de la transferrine (RTf). Dans la première partie du projet, nous avons évalué la BHE chez deux modèles de souris de la MA, des souris doubles (APP/PS1) et triples (3xTg-AD) transgéniques. Une diminution du volume vasculaire a été observée dans l’hippocampe des souris 3xTg-AD âgées de 6 à 18 mois par rapport aux souris témoins. Ces souris ont démontré une diminution du transport cérébral du glucose et de l'expression de GLUT1 à l’âge de 18 mois. En revanche, aucune différence n’a été observée chez les souris APP/PS1. Dans la deuxième partie du projet, nous avons étudié l’effet de l’allèle ε4 de l’apolipoprotéine E, un facteur de risque génétique majeur de la MA, sur la BHE. Les souris APOE4 ont démontré une réduction de la vascularisation cérébrale et du transport cérébral du glucose de manière dépendante de l’âge. De plus, une réduction de l’épaisseur de la lame basale, une augmentation de l’expression de RAGE et une diminution du passage cérébral du DHA ont été observées chez les souris APOE4 par rapport aux souris APOE2 et APOE3. Finalement, nous avons développé la technique de la perfusion cérébrale in situ pour quantifier l’accumulation cérébrale d’un anticorps fluorescent (Ri7) ciblant le RTf. Ainsi, nous avons confirmé l’accumulation cérébrale de Ri7 au niveau des cellules endothéliales en utilisant un mécanisme saturable et sans affecter l’intégrité physique de la BHE. Cet anticorps pourrait donc être utilisé pour modifier l’expression capillaire de différents récepteurs/transporteurs, ce qui pourrait être efficace dans le traitement de la MA. / The blood-brain barrier (BBB) is a biological barrier which protects the brain from potential toxic molecules. Several studies suggest that changes in the BBB occur in Alzheimer's disease (AD). On the other hand, the BBB is a major challenge in the development of drugs for cerebral diseases. However, biological transport systems at the BBB, such as the transferrin receptor (TfR), could be targeted with monoclonal antibodies to develop the technology of Trojan horse and improve the brain availability of different drugs. The aim of my PhD project was to assess the BBB in AD and quantify the brain uptake of a monoclonal antibody targeting the TfR. In the first part of the project, we evaluated the BBB in two mouse models of AD, doubles (APP / PS1) and triple (3xTg-AD) transgenic mice. A reduction of the vascular volume was observed in the hippocampus of 3xTg-AD mice aged 6-18 months compared to control mice. These mice showed a decrease in glucose cerebral transport and expression of GLUT1 at the age of 18 months. However, no difference was observed in APP/PS1 mice. In the second part of the project, we studied the effect of the ε4 allele of apolipoprotein E, a major genetic risk factor of AD, on the BBB. The APOE4 mice showed a reduction of the cerebral vascularization and glucose cerebral transport in age dependent manner. Moreover, a reduction in the thickness of the basement membrane, an increase in the expression of RAGE and a decrease in cerebral passage of DHA were observed in APOE4 mice compared to APOE2 and APOE3 mice. Finally, we developed the in situ brain perfusion technique to quantify the brain uptake of a fluorescent antibody (RI7) targeting the TfR. In this section, we confirmed the cerebral accumulation of RI7 in the endothelial cells. This accumulation was made without affecting the physical integrity of the BBB and using a saturable mechanism. Hence, this antibody could be used to modify the expression of various receptors/transporters in the cerebral capillary, which may be effective in the treatment of neurodegenerative diseases such as AD.

La ribavirine est un agent antiviral à large spectre efficace in vitro contre de nombreux virus à ARN dont certains sont responsables d'encéphalites. In vivo la mauvaise diffusion de cet analogue nucléosidique au niveau de la barrière hémato-encéphalique, limite son efficacité dans le traitement des encéphalites virales. Des études antérieures ont montré la capacité des cyclodextrines natives à former des complexes d’inclusion avec la ribavirine et l’amélioration de l’activité antivirale de la ribavirine in vitro lorsque celle-ci est complexée à l’alpha- ou la bêta-cyclodextrine. Le bénéfice de cette complexation in vivo, a été évalué sur un modèle murin d'encéphalite utilisant une souche neuroadaptée du virus de la rougeole (CAM/RB) inoculée par voie intracrânienne chez la souris CBA/ca âgée de 3 à 4 semaines. Le développement de l’infection a été contrôlé par détermination de la charge virale dans le cerveau des souris, à l’aide d’une RT-PCR quantitative en méthode TaqMan amplifiant le gène N du virus de la rougeole et d’une gamme étalon externe. Lorsque les souris sont traitées par voie intrapéritonéale par 40 mg/kg de ribavirine complexée à l’alpha-cyclodextrine, la morbidité et la mortalité liées à l’encéphalite rougeoleuse sont diminuées par rapport à l’administration de ribavirine libre et la charge virale diminue de façon significative dans le cerveau au jour J6. La complexation à la bêta-cyclodextrine n’apporte pas de bénéfice comparé à la ribavirine libre. Ces données suggèrent que l’alpha-cyclodextrine améliore in vivo le passage de la ribavirine au travers de la barrière hémato-encéphalique. La cinétique de la ribavirine dans le cerveau des souris traitées par le complexe ribavirine/alpha-cyclodextrine a été étudiée de 30 minutes à 48 heures après l’administration de doses uniques ou répétées de ribavirine libre ou complexée à différents dosages. La ribavirine a été purifiée par une technique d’extraction en phase solide et quantifiée par chromatographie liquide haute performance après élaboration d'une gamme de calibration ex vivo. La quantité de ribavirine retrouvée dans le cerveau est plus élevée lorsque la molécule est injectée sous forme de complexe chez la souris saine ou infectée. Ces données illustrent l'amélioration de survie observée au préalable et ce modèle d'étude a permis de mettre en évidence l'impact virologique et pharmacologique de la complexation d'une molécule antivirale à l'alpha-cyclodextrine. / The objective of this work was to study the antiviral activity of ribavirin on measles encephalitis infection when using cyclodextrins as carriers. Ribavirin is a water-soluble synthetic nucleoside with broad spectrum antiviral properties, but it is ineffective against major viral encephalitis because of a failure to cross the blood brain barrier. The use of cyclic oligosaccharides can promote the activity of many drugs and the benefit of the association of ribavirin with alpha- or beta-cyclodextrine has already been demonstrated in vitro. The antiviral activity of the ribavirin/cyclodextrin complexes has been evaluated in vivo using an experimental model based on intracranial injection of the rodent adapted CAM/RB strain of measles virus in CBA/ca mice. Measles encephalitis development was monitored daily by viral load determination in mice brain. Intraperitoneal administration of the complex ribavirin/alpha-cyclodextrin (40 mg/kg of ribavirin) decreased the morbidity and the mortality of measles virus infected mice compared to free ribavirin treatment and the viral load in the brain is reduced at day 6 post-inoculation. At the opposite beta-cyclodextrin did not enhanced ribavirin in vivo antiviral activity. The role of alpha-cyclodextrin thus required to be defined and notably the hypothesis of ribavirin permeation enhancement through the blood brain barrier. Ribavirin specific extraction from brain tissue was developed, based on a solid phase extraction. It was quantified by high performance liquid chromatography at different time points after intraperitoneal injection of single or multiple doses of free ribavirin or of the complex ribavirin/alpha-cyclodextrin. Whatever the tested doses, quantity of ribavirin in the brain is significantly higher when the drug is injected as a complex with alpha-cyclodextrin, in healthy or measles virus-infected mice. So pharmacokinetic of ribavirin in brain tissue explains the advantage of the complex ribavirin/alpha-cyclodextrin over ribavirin in protecting mice from intracerebral infection with measles virus and confirms the interest of cyclodextrin complexes for human central nervous system diseases treatment.

La barrière hémato-encéphalique (BHE), localisée au niveau des capillaires cérébraux, est une composante cruciale de l’unité neuro-glio-vasculaire car elle est responsable du maintien de l’homéostasie cérébrale. En limitant l’accès de nombreuses molécules au parenchyme cérébral, cette structure protège efficacement le système nerveux central (SNC) de composés toxiques, mais empêche ainsi de nombreux médicaments d’atteindre leur cible. La difficulté à étudier les caractéristiques et la perméabilité de la BHE in vivo a mené lesscientifiques à développer différents modèles in vitro de BHE. Notre modèle, qui consiste en une coculture decellules endothéliales de capillaires cérébraux et de cellules gliales, a été largement caractérisé : il exprime les caractéristiques de la BHE in vivo et s’est avéré utile dans l’étude des interactions cellulaires au sein de la BHEen conditions physiologiques et pathologiques. Le modèle de coculture initialement développé a été complété par l’addition de péricytes cérébraux afin de former des tricultures. En effet, les péricytes apparaissent aujourd’hui comme des acteurs importants de la BHE, mais sont souvent absents des modèles in vitro. Réunir les trois principales populations cellulaires formant la BHE (cellules endothéliales, cellules gliales et péricytes cérébraux) semble nécessaire afin de reproduire encore plus finement la configuration retrouvée in vivo, dans le but de comprendre les interactions cellulaires ayant cours au sein de la BHE en conditions physiologiques et pathologiques. Sur la base de notre coculture originelle, deux tricultures ont été mises en place : alors que dans la première les péricytes sont cultivés à distance des cellules endothéliales, ces deux types cellulaires sont étroitement associés dans le second. Les deux modèles ont été caractérisés en terme de morphologie et d’expression de marqueurs endothéliaux, de perméabilité paracellulaire et d’expression de pompes d’efflux, démontrant qu’ils représentent tous deux des modèles pertinents de BHE. Ils permettront d’étudier la contribution des péricytes au phénotype de BHE et à sa réponse en conditions pathologiques, prenant en considération la composante glio-vasculaire. Dans la majorité des cas, l’utilisation des modèles in vitro de BHE au cours des processus de découverte de médicaments vise à prédire si de potentielles molécules thérapeutiques à visée cérébrale peuvent atteindre le SNC, permettant leur effet pharmacologique au niveau de leur cible centrale. Cependant, ces modèles neprésentent généralement pas un débit suffisant pour évaluer rapidement la perméabilité du grand nombre de composés générés par l’industrie pharmaceutique lors des étapes précoces de la découverte de médicaments. / The blood-brain barrier (BBB), located at the level of brain capillaries, is a crucial component of the neurogliovascular unit where it is responsible for brain homeostasis maintenance. By limiting the access of molecules to the brain parenchyma, it effectively protects the central nervous system (CNS) from harmful substances, but at the same time represents a major hurdle for potential neuropharmaceuticals to reach their central target. The difficulty to study BBB features and permeability in vivo led to the development of different in vitro BBB models. Our model, consisting of a coculture of brain capillary endothelial cells and glial cells, has been extensively characterized: it provides a robust model exhibiting in vivo BBB characteristics and hasproved useful in elucidating the cellular interactions at the level of the BBB in physiological and pathological conditions.The initially developed coculture model was completed by the addition of brain pericytes to design threecell culture models. Indeed, pericytes now appear as important actors of BBB formation and maintenance, but are often absent of in vitro BBB models. Gathering the three major cell populations forming the BBB – endothelial cells, glial cells and pericytes – seems important to more accurately reproduce in vivo configuration, with the aim of understanding cellular interactions in physiological and pathological conditions. On the basis of our original coculture model, two different three-cell culture models were designed: while pericytes were cultured distant from endothelial cells in the first model, both were closely associated in the second one. Both models were characterized in terms of endothelial marker expression and morphology, paracellular permeability and expression of efflux pumps, demonstrating that they provide reliable in vitro BBB models. They maybe useful in deciphering the contribution of pericytes to the BBB phenotype and in the response of BBB to injury, taking into account the gliovascular component. In most cases, the intended use of in vitro BBB models in drug discovery is to predict whether investigational drugs are likely to achieve relevant CNS exposure to elicit the desired pharmacological effect. However, in vitro BBB models usually do not allow high enough through put to efficiently evaluate the large number of compounds generated by pharmaceutical companies in early drug discovery stages.

Ce mémoire de maîtrise soutient la thèse originale selon laquelle les déviations lentes du potentiel de courant direct (DC) liées au CO₂ et enregistrées au moyen de l'électroencéphalogramme (EEG) prennent source à travers l'interface ionique de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Les circuits corticaux neuronaux ont longtemps été considérés comme étant les générateurs quasi exclusifs de l'ensemble de l'activité électrique constituant le signal électroencéphalographique. Des études ont démontré la contribution des cellules gliales comme source alternative de courant électrique participant, entre autres, aux décharges épileptiques et au sommeil. Or, plusieurs chercheurs suggèrent que les variations lentes du potentiel de l'EEG enregistrées en DC et modulées en fonction de la pression partielle du CO₂ (pCO₂) sont issues de l'interface entre le liquide céphalorachidien (LCR) et le sang que constitue la BHE. Considérant les trois hypothèses mécanistiques susmentionnées, il devient essentiel d'élucider la contribution relative des générateurs électriques neuronaux et gliaux par rapport à l'interface de la BHE en ce qui a trait à la genèse des déviations lentes DC de l'EEG. Nous avons donc procédé à cette étude par l'entremise d'enregistrements épicrâniens, épiduraux, épicorticaux, intraventriculaires et intraparenchymateux (c.-à-d. intraneuronaux, intragliaux et les potentiels de champ) sur des chats anesthésies à la kétamine-xylazine. Les variations du potentiel DC ont été induites via la modulation des paramètres ventilatoires des chats anesthésies, causant ainsi des changements du CO₂ de 11 l'ordre de 2 à 5 % en fin d'expiration. L'hypercapnie était invariablement associée à des déviations négatives du potentiel DC de l'EEG (déviation moyenne de -284.4 uV/C02 %, intervalle allant de -216 à -324 pV/C02%), tandis que l'hypocapnie provoquait des déviations positives (déviation moyenne de l'ordre de 307.8 uV/C02 %, intervalle allant de 234 à 342 ^V/C02%), et ce, dans toutes les électrodes d'enregistrement. L'hypocapnie a provoqué une augmentation significative de la pression intracrânienne, tandis que l'hypercapnie ne l'a diminué que très légèrement. La rupture de la barrière hématoencéphalique a entraîné une déviation positive du potentiel DC et a réduit drastiquement les réponses subséquentes du potentiel DC à l'hypo-hypercapnie. Le thiopental et l'isoflurane ont aussi provoqué une déviation positive du potentiel DC reliée à la dose administrée, tandis qu'à des concentrations plus élevées, les réponses à l'hypo-/hypercapnie présentaient une polarité inversée. Pour ce qui est de la possible implication des neurones dans la production des déviations du potentiel DC, aucune inversion de polarité n'a été enregistrée entre le scalp, les diverses couches intracorticales et les structures profondes du cerveau. De plus, le potentiel de membrane des neurones et des glies n'a pas montré de variation significative ou systématique en association lors des déviations du potentiel DC liées au CO₂. Durant les crises épileptiques de type "pointe-onde", l'activité pathologique des neurones s'est accompagnée de déviations du potentiel DC d'amplitude significativement moins élevée que celles générées par hyper-/hypocapnie. Enfin, des déviations du potentiel DC étaient encore observées lors même de la quiescence des circuits neuronaux associée à l'état de burst-suppression du tracé électroencéphalographique induit par l'anesthésie. Nous soutenons donc la thèse selon laquelle les potentiels générés à travers la BHE sont la source principale des variations épi-corticales/crâniennes du potentiel DC de l'EEG enregistré à l'EEG dans des conditions qui affectent le pH du cerveau et/ou la circulation sanguine cérébrale.

Titre de l'écran-titre (visionné le 5 janvier 2024) / Le trouble dépressif majeur (TDM) représente un défi majeur pour la santé globale, accentué par le manque de thérapies efficaces. Le stress chronique est le principal facteur de risque environnemental du TDM, associé à des niveaux élevés d'activation proinflammatoire et d'hyperactivité de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HHS). Cette activation peut endommager la barrière hémato-encéphalique (BHE), une frontière critique régulant le transport des métabolites et empêchant l'accès des toxines au cerveau. Les dommages à cette barrière sont liés à l'inflammation cérébrale et aux déficits de comportement, suggérant une nouvelle voie pour les drogues antidépresseurs. Chez les humains, des facteurs environnementaux, tels que le statut socioéconomique et un mode de vie sédentaire, peuvent augmenter le risque de TDM, tandis que chez les souris, un environnement enrichi (EE) comprenant un nid, des jouets et un abri, ainsi que l'accès à une roue d'exercice volontaire (physical exercise, PE), peut prévenir les déficits de comportement induits par le stress chronique; cependant, le rôle de la BHE dans cet effet demeure inconnu. Dans cette étude, nous montrons que l'accès à l'EE ou PE lors de l'exposition au stress chronique peut prévenir les déficits de comportement chez les souris, ainsi que les dommages infligés à la BHE de manière spécifique au sexe et à la région cérébrale. De plus, nous identifions l'expression du fibroblast growth factor 2 (FGF2) comme un agent protecteur associé aux effets bénéfiques de l'EE et PE contre le stress chronique. FGF2 a suscité un intérêt croissant ces dernières années en raison de ses propriétés antidépressives et anxiolytiques. Par conséquent, nous avons approfondi son mécanisme d'action in vitro, dans les cellules endothéliales cérébrales de souris et d'humains exposées aux cytokines pro-inflammatoires, en tant que modèle de stress. Nous montrons que FGF2 peut prévenir la perte d'expression de claudin 5 (Cldn5), ainsi que l'intégrité de la barrière, associée à l'inflammation, et que ces effets peuvent être liés aux modifications de la phosphorylation et de la localisation de la protéine d'échafaudage β-catenin. Enfin, nous avons observé que FGF2 peut restaurer les déficits de motilité cellulaire induits par l'inflammation, suggérant en somme que FGF2 intervient dans la préservation de l'architecture cellulaire aux sites de contact entre cellules. Dans l'ensemble, cette thèse contribue à la compréhension de l'influence de l'environnement sur la pathogenèse de la dépression, tout en identifiant de nouvelles voies de recherche encourageant pour les traitements du TDM au niveau de la BHE. / Major depressive disorder (MDD) is a major global health challenge compounded by a lack of effective antidepressant therapies. Chronic stress is the main environmental risk factor for MDD and is associated with elevated levels of circulating pro-inflammatory cytokines and glucocorticoids which promote damage to the blood-brain barrier (BBB), a crucial frontier regulating nutrient transport to the brain while preventing access of toxins. Damage to the BBB is associated with neuroinflammation and depression-like behaviours, thus representing a promising therapeutic target for depression. In humans, environmental factors like low socioeconomic status and sedentary lifestyle can increase MDD risk, while in mice access to nesting, shelter and toys (enriched environment, EE) or a voluntary running wheel (physical exercise, PE), promotes stress resilience, but a role for the BBB in this effect has not yet been investigated. Here, we show that EE in mice prevents both behavioural and BBB deficits following chronic stress in a sex-and brain region-specific manner. Particularly, EE access reverses stress-induced loss of Cldn5, a major tight junction protein regulating BBB integrity, in males and females. We investigated this effect further in males with access to PE, finding a similar protective effect on both behaviour and the neurovasculature, and further identified elevated fibroblast growth factor 2 (FGF2) as a potential molecular response associated with the beneficial effects of both EE and PE against chronic stress. FGF2 has been studied in recent years as an endogenous antidepressant and anxiolytic agent and we thus investigated its therapeutic properties on mouse and human brain endothelial cells in vitro. We demonstrate that FGF2 can attenuate loss of claudin 5 (Cldn5) expression and barrier properties in cultured mouse and human brain endothelial cells exposed to inflammatory damage, and that this is associated with modulation of inflammation related patterns of scaffold protein β-catenin phosphorylation and subcellular localization. Finally, FGF2 rescues inflammatory deficits in cell motility, altogether suggesting that it interferes with inflammatory disruption of endothelial cell architecture at sites of cell adhesion. In sum, this thesis contributes to current understanding of how and why environmental conditions can influence depression pathogenesis, as well as identifying FGF2 signaling in brain endothelial cells as a promising avenue for future research into novel therapeutic targets for MDD.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une barrière quasiment imperméable assurant la protection du cerveau. Elle limite très fortement le passage de diverses molécules au cerveau, dont les molécules thérapeutiques. Les cellules endothéliales des capillaires cérébraux (CECC), principal constituant de la BHE, présentent abondamment à leur surface plusieurs transporteurs dont le récepteur de la transferrine (RTf). Le RTf est un récepteur qui pourrait potentiellement permettre l’apport de molécules thérapeutiques au cerveau via le mécanisme de transcytose médiée par récepteur (TMR). L’objectif général de ce projet est de développer, caractériser et valider une approche pharmaceutique non virale et non invasive de ciblage thérapeutique à l’aide de fragment Fab d’anticorps monoclonaux visant la libération de molécules thérapeutiques dans le parenchyme cérébral. Tout d’abord, des essais in vitro et in vivo ont été entrepris afin d’évaluer le transport des fragments Fab au cerveau. Les fragments Fab, obtenus par digestion enzymatique à la papaïne, n’ont malheureusement été détectés ni in vitro ni in vivo. Puis, nous avons étudié l’internalisation in vitro et in vivo de micelles polyioniques (MP) conjugués à des fragments Fab’ et renfermant un analogue d’un pARNi fluorescent. A ce jour, les résultats obtenus in vivo avec les MP ne permettent pas d’envisager l’utilisation de ce vecteur comme usage thérapeutique dans le cas de thérapie ciblant le parenchyme cérébral, mais les MP s’avèrent être très prometteurs dans le cas de thérapie génique ciblant les CECC impliquées dans plusieurs maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la sclérose en plaques, les accidents vasculaires cérébraux etc. / The blood-brain barrier (BBB) is an almost impermeable barrier protecting the brain. It greatly limits the passage of blood-borne molecules to the brain, including therapeutic molecules. Brain capillary endothelial cells (BCEC), forming the BBB, express transporters including the transferrin receptor (TfR) on their surface. The TfR is a receptor that could potentially allow the delivery of therapeutic molecules to the brain via receptor-mediated transcytosis (RMT). The main objective of this project is to develop, characterize and validate a non-viral noninvasive therapeutic targeting pharmaceutical approach with Fab fragments of monoclonal antibodies for the delivery of therapeutic molecules in the brain parenchyma. First, in vitro and in vivo experiments were done to assess the transport of Fab fragments into BCEC. Fab fragments, obtained by enzymatic digestion with papain, were detected neither in vitro nor in vivo. Then, we studied the internalization of polyion micelles (MP) conjugated to Fab' fragments and encapsulating an analog of a fluorescent siRNA in vitro and in vivo. The results obtained in vivo with MP conjugated with Fab’ fragments do not suggest penetration into the brain parenchyma, but are promising for gene therapy targeting BCEC to treat Alzheimer disease, multiple sclerosis or stroke.