Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 668759 bytes, checksum: 554c480543a7e27e41087d744a247db0 (MD5) Previous issue date: 2013-03-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) comprise a group of plant viruses of great economic importance causing serious economic losses in tropical and subtropical crops. It is believed that the emergence of begomoviruses in Brazil occurred through horizontal transfer of viruses previously restricted to non-cultivated plants by the B biotype of Bemisia tabaci. Little is known about the genetic variability of weedinfecting begomoviruses. The study of this variability is important to understand how viruses evolve in order to adopt strategies for the development of crop cultivars with durable resistance. In this study we investigated the genetic variability of two weedinfecting begomoviruses, Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV) and Macroptilium yellow vein virus (MaYVV), which infect Euphorbia heterophylla and Macroptilium lathyroides, respectively. Our results, based on 19 DNA-A sequences of EuYMV and 18 of MaYVV obtained from samples collected in 2011 and 2012, support the hypothesis that the genetic structure of begomoviruses can be modulated by their hosts by common processes of selection, mutation and recombination. We observed distinct degrees of genetic variability between the two viruses. EuYMV presented a higher variability, similar to other weed-infecting begomoviruses, while MaYVV presented a lower variability. The nucleotide diversity of EuYMV (0.00819) was four-fold higher than that of MaYVV (0.00197). The mutation frequency of EuYMV (2.5×10-3) was higher than that of MaYVV (4.2×10-4). This difference was supported by the higher nucleotide diversity of all genes of EuYMV compared to MaYVV: CP (~three-fold), Rep (~seven-fold), Trap (~32-fold), Ren (~four-fold), AC4 (~eight-fold). Therefore the higher variability of EuYMV can be explained mostly by the Trap gene. The lower diversity observed for MaYVV could be due to its recent emergence compared to EuYMV, reported since the 1950's in Brazil. / Os begomovírus (gênero Begomovirus, familia Geminiviridae) são um grupo vírus de plantas de grande importância econômica causando sérias perdas em diversas culturas tropicais e subtropicais. Acredita-se que a emergência dos begomovírus presentes no Brasil se deu por meio da transferência horizontal de vírus anteriormente restritos a plantas silvestres e invasoras para plantas cultivadas mediada pelo biótipo B de Bemisia tabaci. A maioria dos trabalhos realizados até o presente tiveram enfoque na caracterização molecular dos begomovírus e pouco se sabe sobre a variabilidade genética das populações destes no campo. O estudo desta variabilidade é importante para entender como os vírus evoluem no sentido de serem adotadas estratégias para o desenvolvimento de cultivares com resistência durável. Neste trabalho foi investigada a variabilidade genética de dois begomovírus encontrados em plantas invasoras, Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV) e Macroptilium yellow vein virus (MaYVV), que infectam Euphorbia heterophylla e Macroptilium lathyroides, respectivamente. Os resultados, baseados em 19 sequências de EuYMV e 18 de MaYVV obtidas de amostras coletadas em 2011 e 2012, reforçam a hipótese de que a estrutura genética de begomovírus pode ser modulada pelo hospedeiro por processos comuns de seleção, mutação e recombinação. Foram observados diferentes graus de variabilidade genética entre os dois vírus. O EuYMV apresentou maior variabilidade, semelhante a outros begomovírus que infectam plantas não cultivadas, enquanto o MaYVV apresentou baixa variabilidade. A diversidade nucleotídica do EuYMV (0,00819) foi aproximadamente quatro vezes mais elevada do que a do MaYVV (0,00197). A frequência de mutação do EuYMV (2,5×10-3) foi superior à do MaYVV (4,2×10-4). Esta diferença foi suportada pela maior diversidade nucleotídica de todos os genes do EuYMV em comparação ao MaYVV: CP (aprox. três vezes maior), Rep (sete vezes), Trap (32 vezes), Ren (quatro vezes), AC4 (oito vezes). Esses resultados indicam que a maior variabilidade genética de EuYMV pode ser explicada, principalmente, pelo gene Trap. A menor variabilidade observada para o MaYVV pode ser devido à sua provável emergência recente em comparação ao EuYMV, relatado desde a década de 1950 no Brasil.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 737365 bytes, checksum: 3b9e993a4f8a367d7f1b82a2dded22f8 (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Begomoviruses belong to the Geminiviridae family which includes viruses with genomes containing one or two single stranded DNA molecules within icosahedral geminate particles. Begomoviruses are transmitted by the whitefly Bemisia tabaci and may cause diseases of economical importance in several crops mainly in tropical and subtropical regions. In Brazil there are several reports of begomovirus causing serious losses to the common bean and tomato crops, and sporadic reports of infection of soybean. Virus-induced gene silencing (VIGS) is an attractive and fast alternative for studying the expression and function of genes because it does not require plant transformation. Viruses with RNA or DNA genomes have been successfully used as vectors to induce gene silencing in plants. However, there are few examples of efficient vectors for inoculation of tomato and soybean. The main goal of this work was to build a viral vector based on the DNA-A of the begomovirus Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) to induce gene silencing in plants of soybean, tomato and Nicotiana benthamiana. The viral vector, designated pToR-A1.4ΔCP, was built from an infectious ToRMV-A clone from which the gene encoding the capsid protein was removed and replaced by the multiple cloning site of the plasmid vector pBluescript KS+ (pKS+). Like other begomoviruses, ToRMV does not require the capsid protein to cause a systemic infection. The construction of the viral vector was confirmed by PCR, enzymatic cleavage and DNA sequencing. To be used on gene silencing experiments, fragments from the following genes were PCR amplified from cDNA clones: phytoene desaturase (PDS) from soybean and tomato, myo-inositol-1-phosphate synthase (MIPS) from soybean and stachyose synthase (STS) from soybean. All fragments were amplified with primers contained restriction sites for cloning. After amplification, the fragments were cloned in pGEM-T Easy vector, sequenced and aligned to the corresponding cDNAs to confirm their identity. To clone these fragments in the viral vector they were cleaved out of the pGEM-T Easy vector, purified and cloned into the pToR-A1.4ΔCP vector previously cleaved at the multiple cloning site with the same enzymes used to cleave the plasmid vector. The ligation reaction used T4 DNA ligase and ultracompetent Escherichia coli cells were transformed by heat shock. Transformants colonies were analyzed by PCR and enzymatic cleaved. Systemic infection of soybean, tomato and Nicotiana benthamiana plants with the empty pToR-A1.4ΔCP vector co-inoculated with ToRMV DNA-B was checked by PCR 21 days after inoculation. In the case of N. benthamiana, the viral vector presented 82% infectivity, indicating the high potential of this vector for VIGS studies in this plant species. In the case of soybean and tomato, the viral vector presented low replication efficiency. New infectivity tests need to be done to confirm these results. It is expected that this viral vector will represent an alternative for functional genomic studies and for the analysis of genes involved in several biological processes. / Os begomovírus pertencem à família Geminiviridae, que inclui vírus com genoma composto por uma ou duas moléculas de DNA circular de fita simples, encapsidado em partículas icosaédricas geminadas. Os begomovírus são transmitidos pela mosca branca Bemisia tabaci e causam doenças de importância econômica em diversas culturas, principalmente em regiões tropicais e subtropicais. No Brasil, há diversos relatos de begomovírus causando sérias perdas nas culturas do feijoeiro e tomateiro e relatos esporádicos de incidência na cultura da soja. O silenciamento gênico induzido por vírus (VIGS) é uma alternativa atraente e rápida para o estudo da expressão e função de genes, pois não há necessidade de transformação genética da planta. Vírus com genoma de RNA e de DNA têm sido utilizados com sucesso como vetores para indução de silenciamento gênico em plantas. Entretanto, existem poucos vetores eficientes para a inoculação em plantas de tomate e de soja. O objetivo deste trabalho foi a construção de um vetor viral, baseado no DNA-A do begomovírus Tomato rugose mosaic virus (ToRMV), para a indução do silenciamento de genes em plantas de soja, tomate e Nicotiana benthamiana. O vetor viral, denominado pToR-A1.4ΔCP, foi construído a partir de um clone infeccioso do ToRMV-A do qual foi removido o gene da proteína capsidial, substituindo pelo sítio múltiplo de clonagem do vetor pBluescript KS+ (pKS+). Assim como outros begomovírus, o ToRMV não requer a proteína capsidial para causar infecção sistêmica. A construção do vetor viral foi confirmada por PCR, clivagem enzimática e sequenciamento. Para serem utilizados em experimentos de silenciamento gênico, fragmentos referentes aos genes fitoeno dessaturase (PDS) de soja e tomate, myo-inositol- 1-fosfato sintase (MIPS) de soja e estaquiose sintase (STS) de soja foram isolados a partir de cDNA dessas plantas, utilizando primers específicos, contendo sítios de restrição adequados para as clonagens. Após a amplificação, todos os fragmentos obtidos foram clonados em pGEM-T Easy, sequenciados e sua identificação foi confirmada por meio de alinhamento utilizando o algoritmo BLASTn. Para a clonagem no vetor viral, os fragmentos foram liberados do vetor pGEM-T Easy com as enzimas de restrição adequadas, purificados e inseridos no vetor pToR-A1.4ΔCP, previamente clivado em seu sítio múltiplo de clonagem com as mesmas enzimas. A reação de ligação foi realizada utilizando T4 DNA ligase e células de Escherichia coli ultracompetentes foram transformadas por meio de choque térmico. Os transformantes foram analisados por PCR e reação de clivagem enzimática. A infecção sistêmica de plantas de soja, tomate e Nicotiana benthamiana pelo vetor pToR-A1.4ΔCP vazio, inoculado conjuntamente com o DNA-B do ToRMV, foi diagnosticada via PCR aos 21 dias após a inoculação. Em N. benthamiana, o vetor viral apresentou 82% de infectividade, indicando um grande potencial de uso em estudos de VIGS nessa planta. Já em plantas de soja e tomate, o vetor viral apresentou baixa taxa de replicação. Portanto, novo teste de infectividade deve ser realizado para confirmar os resultados obtidos. Dessa forma, espera-se que este vetor viral sirva como um complemento e uma alternativa em estudos de genômica funcional e na análise de genes envolvidos em vários processos biológicos.

Sabe-se que a grande maioria dos fitopatógenos depende quase que exclusivamente de vetores para disseminarem-se para novos hospedeiros, porém pouco foi estudado no que se refere aos efeitos dos micro-organismos sobre seus insetos vetores. Sendo Bemisia tabaci uma praga de elevada importância e vetora de inúmeros vírus para plantas cultiváveis, é de extrema relevância estudar os efeitos provocados pelos vírus sobre seu desempenho biológico. Assim, esta pesquisa objetivou: a) avaliar os efeitos direto e indireto dos begomovírus Tomato severe rugose vírus (ToSRV) e Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) sobre parâmetros biológicos de B. tabaci biótipo B e Q respectivamente, dos quais: duração e viabilidade do período ninfal; razão sexual; fecundidade; fertilidade e longevidade. Os resultados encontrados variam de positivos, neutros a negativos, dependendo do parâmetro, efeito e espécie do vírus estudado. Sendo assim, observou-se que há efeito direto de ambos os vírus na duração do período ninfal, sendo menor em insetos virulíferos que em sadios. Ademais, há um incremento no número médio de ovos depositados por insetos virulíferos com ToSRV (225,2 ovos/fêmea) quando comparado com insetos sadios (180,1 ovos/fêmea). Já TYLCV afetou diretamente a longevidade de machos os quais tiveram a duração da fase adulta incrementada quando virulíferos (30 dias) e 24 dias quando sadios. Há um efeito indireto negativo de ToSRV sobre a viabilidade ninfal de seu vetor, sendo de 52% quando estes são mantidos em plantas infectadas e 86% em plantas sadias de tomate. A razão sexual também foi afetada por este vírus, favorecendo as fêmeas, sendo de 2:1 a proporção entre fêmeas e machos em plantas infectadas. Ademais, a longevidade de machos foi reduzida drasticamente quando em plantas infectadas com ToSRV. Também foi detectado um efeito indireto positivo do TYLCV sobre a fecundidade de fêmeas de B. tabaci biótipo Q, as quais depositaram em média maior quantidade de ovos em plantas infectadas que em plantas sadias de tomate, sendo 52,8 e 33,2 ovos respectivamente. Tais resultados permitem concluir que, nas condições em que os ensaios foram realizados, ToSRV afeta diretamente de forma positiva seu vetor, enquanto possui efeitos indiretos principalmente negativos sobre parâmetros biológicos de B. tabaci biótipo B. Igualmente TYLCV possui efeitos diretos positivos sobre o biótipo Q da espécie de mosca-branca. Já indiretamente este vírus, diferentemente de ToSRV, afeta positivamente a biologia de seu vetor B. tabaci biótipo Q, favorecendo a fecundidade dos indivíduos que se desenvolveram em plantas infectadas de tomate. / It is known that the vast majority of pathogens relies almost exclusively vector for spreading to new hosts, but little has been studied regarding the effects of micro-organisms on its insect vectors. Bemisia tabaci is a pest of high importance vector of numerous virus to cultivated plants, it is extremely important to study the effects caused by viruses on its biological performance. Thus, this study aimed to: a) evaluate the direct and indirect effects of the begomovirus Tomato severe rugose virus (ToSRV) and Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) on biological parameters of B. tabaci biotype B and Q respectively, of which duration and viability of nymphal development; sex ratio; fecundity; fertility and longevity. The results range from positive, neutral to negative, depending on the parameter, effect and species of the virus studied. Thus, it was observed that there is a direct effect of the both virus in the duration of nymphal development, being less than viruliferous insects in healthy individuals. Moreover, there is an increase in the average number of eggs laid by viruliferous insects with ToSRV (225,2 eggs / female) when compared with healthy insects (180,1 eggs / female). Already TYLCV directly affected the longevity of males which lasted adulthood increased when viruliferous (30 days and 24 when healthy). There is an indirect negative effect on the viability of ToSRV nymphal of its vector, and 52% when they are kept in infected plants and 86% in healthy tomato plants. The sex ratio was also affected by this virus, favoring females, with a ratio of 2:1 between females and males in infected plants. Furthermore, the longevity of males was reduced dramatically when plants infected with ToSRV. We also detected a positive indirect effect of TYLCV on fertility of female B. tabaci biotype Q, which placed greater average number of eggs in infected plants than on healthy plants of tomato, 52,8 and 33,2 eggs respectively. These results indicate that, under conditions in which the tests were performed, ToSRV directly affects positively its vector, while indirect effects has mostly negative on biological parameters of B. tabaci biotype B. TYLCV also has positive direct effects on the Q biotype of the whitefly species. Already indirectly this virus, unlike ToSRV, positively affects the biology of its vector B. tabaci biotype Q, favoring the fecundity of individuals that developed in infected tomato plants.

Submitted by Rosana Amâncio (rosana.amancio@ufcg.edu.br) on 2018-07-19T20:53:36Z No. of bitstreams: 1 LARISSA CAVALCANTE COSTA - DISSERTAÇÃO PPGCNBio 2015..pdf: 1987711 bytes, checksum: 9d66a83ab8d2cec764aeaa785de117d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-19T20:53:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LARISSA CAVALCANTE COSTA - DISSERTAÇÃO PPGCNBio 2015..pdf: 1987711 bytes, checksum: 9d66a83ab8d2cec764aeaa785de117d4 (MD5) Previous issue date: 2015-07-31 / CNPq / O gênero Begomovirus pertence à família Geminiviridae de vírus que infectam plantas e são transmitidos pelo vetor mosca branca (Bemisia tabaci), também considerado umas das maiores pragas da agricultura. O presente estudo investigou a diversidade de begomovírus presente no vetor mosca branca (B. tabaci) em áreas da Paraíba, Minas Gerais e Distrito Federal. Um total de 17 amostras de moscas brancas foi coletado a partir de 12 espécies vegetaisem áreas da Paraíba, Minas Gerais e Distrito Federal e e usado para detecção do DNA-A de begomovirus por PCR, por RCA e por PCR-RCA, com primers específicos. Amplicons virais foram clonados e os clones recombinantes foram selecionados sob meio de cultura seletivo, contendo X-Gal e IPTG. A presença de amplicons foi confirmada por padrões de restrição gerados pelas enzimas EcoR I e Msp I em DNAs plasmidiais isolados dos clones selecionados e, então, sequenciados. As sequencias de DNA-A de begomovírus isoladas de moscas brancas coletadas em plantas de algodoeiro EMEPA-PB, em Emília, picão preto, barba-de-falcão, jatrofa, berinjela e malvona, presentes na área do Distrito Federal, foram analisadas quanto a porcentagem de identidade de sequencias de nucleotídeos e agrupamentos filogenéticos comparando com outras sequencias de isolados de begomovírus disponíveis no banco de dados GenBank. Como resultado, 5 espécies de begomovírus (SiYBV, CoMoV, SiMMV, BGMV e SiGLSV) evidenciaram a diversidade de begomovírus presente em moscas brancas nas áreas estudadas, mas que não necessariamente está presente nas respectivas plantas onde as moscas foram coletadas. Os primers PAL1v 1978 e PAR1c 496 descritos para detecção de DNA-A de begomovírus a partir de plantas foram eficientes para detecção específica desse componente genômico viral a partir do vetor mosca branca. A detecção específica de DNA-A do componente de begomovírus por PCR a partir do DNA total extraído de moscas brancas foi enriquecida pela amplificação por RCA. O begomovírus BGMV foi predominantemente encontrado em moscas brancas coletadas em plantas na área do Distrito Federal. A diversidade presente nos isolados dos 5 vírus identificados neste trabalho foi agrupada em 4 ramos filogenéticos suportados pela porcentagem de identidade de sequencias de nucleotídeos comparadas com sequencias dos isolados de begomovírus disponíveis no banco de dados GenBank / The Begomovirus genus belongs to Geminiviridae family of viruses that infect plants and is transmitted by whitefly (Bemisia tabaci) vector, which is also considered one of the major pests of agriculture. The present study investigated the diversity of begomovirusesin the whitefly vector (B. tabaci) in areas of Paraíba, Minas Gerais and the Federal District. A total of 17 samples of whiteflies were collected from 12 plant species in areas of Paraíba, Minas Gerais and the Federal District and used for the detection of begomovirus DNA-A by PCR, RCA and RCA-PCR with specific primers. Viral amplicons were cloned and the recombinant clones were selected on selective medium containing X-Gal and IPTG. The presence of amplicons was confirmed by restriction enzyme patterns generated by EcoR I and Msp I on plasmid DNAs of selected clones isolated and then sequenced. The begomovirus DNA-A sequences isolated from whiteflies collected from cotton plants EMEPA-PB, in Emilia, black prick, beard-of-hawk, jatropha, eggplant and malvona present in the Federal District, were analyzed bynucleotide sequence identity percentage and phylogenetic groups compared to other begomovirus strain sequences available in GenBank database. As a result, five species of begomovirus (SiYBV, CoMoV, SiMMV, BGMV e SiGLSV) revealed the diversity of begomovirus present in whiteflies in the studied areas, but that is not necessarily present in the respective plants where the flies were collected. The PAL1v 1978 PAR1c 496 primers described for begomovírus DNA-A detection from plants were also efficient for detection of this specific viral genomic component from whitefly vector. The specific detection of begomovirus DNA-A component by PCR from total DNA extracted from whiteflies was enriched by amplification by RCA. The BGMV begomovirus was found predominantly in whiteflies on plants collected in the Federal District. The diversity present in strains of thefive virus identified in this work was grouped into four phylogenetic branches supported by the nucleotide sequence identity percentage compared to sequences of the begomovirus strains available in GenBank database