Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-12T14:52:45Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Edson Renan Barros de Santana.pdf: 1248759 bytes, checksum: 2b3cc5382928525e5ef5fb420e538ad3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T14:52:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Edson Renan Barros de Santana.pdf: 1248759 bytes, checksum: 2b3cc5382928525e5ef5fb420e538ad3 (MD5) Previous issue date: 2014 / FACEPE / A Capraria biflora L. é uma planta pertencente à família Scrophulariaceae que produz em suas raízes um composto violeta denominado biflorina, uma o-naftoquinona que possui potencial antimicrobiano frente a bactérias Gram-positivas e fungos, além de ação antitumoral frente a algumas linhagens celulares, como as células de melanoma. Todavia, a biflorina é uma molécula hidrofóbica e fotossensível, o que dificulta sua manipulação e uso. Com o intuito de promover uma veiculação mais efetiva com uma melhor estabilização e preservação da atividade desta substância, neste trabalho preparamos nanoemulsões a partir da biflorina. Para tanto, a biflorina foi obtida do extrato bruto das raízes de C. Biflora L. e purificada por meio de cromatografia líquida clássica seguida de recristalização em éter di-isopropílico. Sua estrutura foi confirmada por análises espectroscópicas convencionais como UV-Vis, Infravermelho e RMN de 1H e 13C. Para a preparação da nanoemulsão foram utilizados cristais de biflorina solubilizados em Tween 80 e Tween 20 e salina (a 0,9%) como fase aquosa. A caracterização da nanoemulsão e de sua estabilidade foi realizada por espectroscopia UV-Vis e espalhamento dinâmico de luz (DLS). As análises de DLS mostraram que as nanoemulsões são estáveis e apresentam um tamanho médio de aproximadamente 82 nm. A fotodegradação da biflorina em forma de nanoemulsão foi avaliada em uma câmara de fotoestabilidade, durante seis horas de exposição sob UV e luz branca, usando como parâmetro comparativo a biflorina dissolvida em etanol. Como controle positivo foi utilizada uma solução de quinino monocloridrato dihidratado a 2%. A avaliação da fotodegradação foi verificada através de espectroscopia UV-Vis e a fotoproteção conferida à biflorina pela nanoemulsão foi comprovada, visto que a biflorina nanoemulsionada precisou de cerca de três vezes mais tempo de exposição para se degradar em comparação à biflorina dissolvida em etanol. A ação biológica da biflorina foi testada em ensaios com Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Micrococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans e Candida krusei, a partir da sua dispersão em meio de cultura líquido, utilizando-se comparativamente, a ação da biflorina em DMSO a 10%. Sua ação biológica foi observada e apresentou atividade frente às espécies representativas dos grupos das bactérias e leveduras, com valores de Concentração Mínima Inibitória (CMI) para Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Micrococcus luteus inferiores a 3,12 μg/mL. A CMI para Escherichia coli foi maior do que 100 μg/mL, para Candida albicans, 12,5 μg/mL e para Candida krusei observou-se concentração maior que 50 μg/mL. Os valores de CMI foram semelhantes para a nanoemulsão e para a biflorina solubilizada em DMSO. Portanto, os resultados indicam que a veiculação da biflorina na forma de nanoemulsão preserva à atividade da substância e ainda possui o adicional de oferecer fotoproteção e favorecer sua aplicação em meio aquoso.

Submitted by Lúcia Brandão (lucia.elaine@live.com) on 2015-12-09T19:19:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Gleyce dos Santos Barbosa.pdf: 2917376 bytes, checksum: 06d23d301fe537d8d8c6b4a14c4689cf (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-01-19T20:34:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Gleyce dos Santos Barbosa.pdf: 2917376 bytes, checksum: 06d23d301fe537d8d8c6b4a14c4689cf (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-01-19T20:42:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Gleyce dos Santos Barbosa.pdf: 2917376 bytes, checksum: 06d23d301fe537d8d8c6b4a14c4689cf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-19T20:42:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Gleyce dos Santos Barbosa.pdf: 2917376 bytes, checksum: 06d23d301fe537d8d8c6b4a14c4689cf (MD5) Previous issue date: 2012-01-27 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In the northern Brazil, especially in the states of Amazonas and Pará, there is a high incidence of gastric cancer which available treatments are ineffective in most cases. The biflorin, a prenylated ortanaftoquinona obtained from the roots of Capraria biflora L., showed, in previous studies, an inhibition of the tumor growth in vivo and in vitro in several cell lines, without inducing mutagenicity. The ACP02, main cell line used in this work, was established from a primary diffuse gastric adenocarcinoma, removed from the stomach cardia region of a 66-year-old pacient born in Pará. Among the main karyotypes and genetic changes of this lineage are the trisomy of chromosome 8, with amplification of the MYC oncogene, and the deletion of the chromosome 17’s short arm, where the tumor suppressor gene TP53 is located. These characteristics observed in the established line correspond to those observed in the original tumor, what indicates that this line is a good alternative to the study of the human gastric cancer pathophysiology and the drug screening. Considering biflorin’s promising potencial and the necessity to regionalize the study of new anticancer drugs to answer genotype particularities of each group of patients, we evaluated the activity of biflorin on ACP02 through the morphological cell analysis, the cell viability assays, the clonogenic assay, scratch assay, the cell differentiation test by NBT, the evaluation of the MYC status and telomere length by FISH, in 0, 1.0, 2.5 and 5.0 M concentrations, after 24 and 72 hours of treatment. The morphological changes indicate cell death by necrosis, and suggest the occurrence of the differentiation process, due to change in the format of the attached cell. The biflorin showed a cytotoxic activity (IC50 1.92 M) and cytostatic, anticlonogenic and antimotility activities, statistically significant (p<0,05) since 1 M. There was a significant reduction in MYC amplification rate in cells treated with 2.5 e 5 M of the drug (p<0,05), which can explain the occurrence of cellular differentiation process, in view of the physiological role of this gene. This differentiation was confirmed by the results obtained during the NBT test, in which the cells showed the ability to metabolize salt from a treatment of 1.0 M. The telomere length was reduced in cells treated with 5.0 M of biflorina (p<0,05). These results showed that biflorin acts on important targets of anticancer therapy, when used on the gastric line ACP02, at concentrations around 2.5 M, which makes it a promising substance for the treatment of this tumor type. / No norte do Brasil, sobretudo nos Estados do Amazonas e Pará, há alta incidência de câncer gástrico, cujos tratamentos disponíveis são ineficazes, na maioria dos casos. A biflorina, uma ortonaftoquinona prenilada obtida das raízes de Capraria biflora L., demonstrou, em trabalhos prévios, inibir o crescimento tumoral in vivo e in vitro de várias linhagens celulares, sem induzir mutagenicidade. A ACP02, principal linhagem celular utilizada nesse trabalho, foi estabelecida a partir de um adenocarcinoma gástrico difuso primário, retirado da região cárdia estomacal de um paciente de 66 anos oriundo do Pará. Entre as principais alterações cariotípicas e genéticas dessa linhagem estão a trissomia do cromossomo 8, com amplificação do oncogene MYC, e a deleção do braço curto do cromossomo 17, onde estaria localizado o gene supressor de tumor TP53. Essas características observadas na linhagem estabelecida correspondem àquelas observadas no tumor que a deu origem, evidenciando que tal linhagem é uma boa alternativa para o estudo da fisiopatologia do câncer gástrico humano e triagem de drogas. Tendo em vista o potencial promissor da biflorina e a necessidade de regionalizar o estudo de novas drogas anticâncer para atender as particularidades genotípicas de cada grupo de pacientes, avaliamos a atividade da biflorina sobre ACP02 através da análise morfológica das células, dos ensaios de viabilidade celular, do ensaio clonogênico, do teste de motilidade, do teste de diferenciação celular pelo NBT e da avaliação do status de MYC e comprimento dos telômeros por FISH, nas concentrações de 0, 1,0, 2,5 e 5 M, após 24 e 72h de tratamento. As alterações morfológicas indicaram morte celular por necrose, além de sugerirem a ocorrência de processo de diferenciação, devido à alteração no formato da célula aderida. A biflorina apresentou atividade citotóxica (CI50 1,92 M) e atividades citostática, anticlonogênica e inibidora da motilidade in vitro, estatisticamente significativas (p<0,05) desde a concentração de 1 M. Houve redução significativa da taxa de amplificação de MYC, nas células tratadas com 2,5 e 5,0 M da droga (p<0,05), o que pode justificar a ocorrência de processo de diferenciação celular, tendo em vista o papel fisiológico desse gene. Essa diferenciação foi confirmada pelos resultados obtidos durante o teste do NBT, no qual as células apresentaram capacidade de metabolizar o sal a partir do tratamento de 1,0 M. O comprimento do telômero foi reduzido nas células tratadas com 5,0 M de biflorina (p<0,05). Esses resultados demonstram que a biflorina atua sobre importantes alvos da terapia anticâncer, quando utilizada sobre a linhagem gástrica ACP02 em concentrações em torno de 2,5 M, o que a torna uma substância promissora para o tratamento desse tipo de tumor.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A presenÃa de metÃstase permanece como a principal causa de morte pelo cÃncer. Diante da ausÃncia de terapia farmacolÃgica para o tratamento de tumores secundÃrios, a pesquisa de novas drogas com potencial antimetastÃtico à de suma importÃncia para o desenvolvimento de novos fÃrmacos anticÃncer. Neste quadro, decidimos avaliar o potencial antimetastÃtico da biflorina, uma o-naftoquinona isolada das raÃzes da Capraria biflora. Em ensaio de proliferaÃÃo celular por Alamar blue, observamos que esta quinona possui atividade citotÃxica contra melanoma humano (MDAMB-435) a partir da concentraÃÃo 5 ÂM em 24h de exposiÃÃo. PorÃm, nessa mesma dose, nÃo houve efeito citotÃxico em 12h de exposiÃÃo. Ensaios de azul de tripan e cristal violeta mostraram que nas concentraÃÃes de 1,0; 2,5 e 5,0 ÂM durante 12h de exposiÃÃo a biflorina nÃo possui efeito citotÃxico. Utilizando as concentraÃÃes de 1,0; 2,5 e 5,0 ÂM (12h exposiÃÃo) foram realizados ensaio de migraÃÃo e invasÃo celular. Nestes ensaios observamos que a biflorina diminui a motilidade e a invasividade da cÃlula MDAMB-435. Em anÃlise morfolÃgica das cÃlulas, utilizando coloraÃÃo de May-Grunwald-Giemsa e coloraÃÃo de actina por faloidina, observamos que a biflorina altera a organizaÃÃo do citoesqueleto de actina, com a presenÃa de cÃlulas menores, retraÃdas e cÃlulas maiores com expansÃes filamentosas semelhantes à filopÃdios. Em ensaio de Western blot observou-se a diminuiÃÃo na expressÃo da molÃcula de adesÃo N-caderina e inibiÃÃo da via de sinalizaÃÃo PI3K/Akt. Estes resultados conferem à biflorina um potencial antimetastÃtico bastante promissor. / Metastasis remains the leading cause of death from cancer. Due to the absence of pharmacological therapy for the treatment of secondary tumors, the search for new drugs with antimetastatic potential is important to the development of new anticancer drugs. In this context we decided to evaluate the antimetastatic potential of biflorin, an o-naphthoquinone isolated from roots of Capraria biflora. In cell proliferation assay using Alamar blue, we found that this quinone has cytotoxic activity against human melanoma cells line (MDAMB-435) at 5 ÂM concentration during 24 hours of exposure. However, with this same dose, there was no cytotoxic effect within 12 hours of exposure. Trypan blue and crystal violet assay showed that biflorina has no cytotoxic effect at 1.0, 2.5 and 5.0 ÂM during 12 hours of exposure. Migration assay and cell invasion assay were performed using concentrations of 1.0, 2.5 and 5.0 ÂM (12h exposure). In these trials we found that biflorin decreases cell motility and invasiveness. In morphological analysis of cells stained using May-Grunwald-Giemsa and actin stain by phalloidin, we observed that biflorin alters the organization of the actin cytoskeleton, with the presence of smaller, retracted and larger cells. In Western blot assay we observed a decrease in the expression of the adhesion molecule N-cadherin and inhibition of PI3K/AKT signaling pathway. These results give biflorin as an agent with promising antimetastatic potential.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A biflorina à uma 1,4 â orto-naftoquinona isolada de raÃzes de Capraria biflora, que possui uma ampla distribuiÃÃo nas amÃricas do Sul e do Norte. O objetivo desse trabalho foi avaliar se a biflorina apresentava um potencial citotÃxico e antitumoral utilizando modelos in vitro e in vivo. O presente estudo tambÃm avaliou a genotoxicidade dessa molÃcula em linfÃcitos perifÃricos humanos e em outros modelos como cÃlulas V79, bactÃrias, leveduras bem como em medula Ãssea de camundongos. Frente a dezesseis linhagens tumorais, dentre elas 15 humanas e 1 murina, a biflorina mostrou-se bastante citotÃxica, uma vez que teve sua CI50 variando de 0,43 e 14,61 Âg/mL. Para avaliar sua seletividade, ela foi testada tambÃm em linfÃcitos humanos estimulados com fitohemaglutinina, onde se pode concluir que ela nÃo à seletiva. A biflorina nÃo foi capaz de inibir o desenvolvimento de ovos de ouriÃo-do-mar e nem causar ruptura na membrana de hemÃcias de camundongos. Para avaliar seu mecanismo de aÃÃo e seu potencial antitumoral in vivo a linhagem B16 (Melanoma) foi escolhida para que os testes in vitro e in vitro pudessem ser realizados com a mesma cÃlula. Os estudos in vitro realizados por coloraÃÃo diferencial e por citrometria de fluxo sugerem que a biflorina induz morte celular por apoptose, uma vez que as cÃlulas tratadas apresentaram reduÃÃo do volume nuclear, condensaÃÃo de cromatina e formaÃÃo de corpos apoptÃticos. A citometria de fluxo confirmou a fragmentaÃÃo de DNA induzida na maior concentraÃÃo de biflorina e demonstrou que as cÃlulas tratadas apresentaram despolarizaÃÃo da mitocÃndria significante. AlÃm disso, por citometria a integridade de membrana nÃo foi alterada e nÃo exibiu aumento da percentagem de cÃlulas nÃo viÃveis, sendo o mesmo observado com as cÃlulas avaliadas por exclusÃo por azul de tripan. A atividade in vivo da biflorina foi avaliada em trÃs modelos, sarcoma 180, carcinoma de Erlich e melanoma B16. A biflorina inibiu o crescimento dos tumores dos animais transplantados com sarcoma 180 e carcinoma de Erlich, bem como foi capaz de aumentar a resposta antitumoral e diminuir a toxicidade sistÃmica do 5-FU quando associada com ele. Nos animais transplantados com B16 a sobrevida dos animais tratados com biflorina aumentou significativamente. Foi demonstrado tambÃm que a biflorina possui aÃÃo imunoadjuvante aumentando a produÃÃo de anticorpos contra ovalbumina, o que pode estar relacionada com suas propriedades antitumorais. TambÃm foi estudada a interaÃÃo da biflorina com o DNA de fita dupla e de fita simples, mostrando que ela inibe diretamente o DNA, mas nÃo inibe Topoisomerase I, sugerindo que outro mecanismo deve estar associado a essa interaÃÃo, podendo estar relacionado à induÃÃo de dano ao DNA. Contudo a biflorina mostrou-se genotÃxica apenas no teste do cometa, onde a freqÃÃncia e o Ãndice de danos em linfÃcitos humanos aumentaram significativamente, sem, no entanto induzir efeito clastogÃnico pelo teste de aberraÃÃes cromossÃmicas. Por outro lado, por sua comprovada atividade antioxidante, possivelmente associada à remoÃÃo de grupos hidroxil, a biflorina demonstrou ter uma atividade antimutagÃnica, contra cÃlulas V79 e linhagens de Saccharomyces cereviseae tratadas com H2O2, quando usada em baixas concentraÃÃes, alÃm de nÃo causar peroxidaÃÃo lipÃdica bem como diminuir a peroxidaÃÃo lipÃdica medida pelos nÃveis de TBARS em cÃlulas V79. Ainda para descartar quaisquer dÃvidas em relaÃÃo a nÃo induÃÃo de mutagenicidade pela biflorina, outros dois testes sugeridos pelos protocolos internacionais como testes padrÃo para comprovaÃÃo de seguranÃa de muitos quÃmicos incluindo biocidas e fÃrmacos, foram realizados os testes de Ames em Salmonella thyphimurium e o teste de micronÃcleos em medula Ãssea de camundongos, ambos com resultados negativos. Todos esses dados compilados sugerem que a biflorina à uma droga com uma potente atividade citotÃxica em cÃlulas neoplÃsicas, antitumoral, atividade imunoadjuvante, potencial antioxidante que interage diretamente com DNA de fita simples e de fita dupla, mas nÃo inibe topoisomerase, porÃm mostra-se genotÃxica, mas nÃo mutagÃnica quando testada em vÃrios modelos biolÃgicos / Biflorin is a 1,4 - o-naftoquinone isolated from the roots of Capraria biflora, which has an ample distribution among North and South AmÃrica. The goal of this study was to evaluate the antitneoplastic potential of biflorine in vitro and in vivo models. Genotoxic effects in human peripheral lymphocytes and other cell models, such as V79, bacteria and yeasts, as well as in mice bone marrow. Was also accessed biflorin was highly cytotoxic against 15 human tumor cell lines and 1 murine cell line, with IC50 ranging from 0.43 to 14.61 Âg/mL. Cell selectivity was was not observed, since in was equally toxic to normal human lymphocytes stimulated with phytoheamaglutinin. No inhibitory effect on see-urchin egg development or lysis of mouse erythrocyte was observed following biflorin treatment. Mode of action studies and antitumor potential was evaluated on the B16 melanoma cell line, which enables in vitro and in vivo studies. The in vitro data suggests that biflorin induces cell death by apoptosis, as treated cells showed a decrease in nucleus size, chromatin condensation and formation of apoptotic bodies. Flow cytometry confirmed DNA fragmentation and a significant mitochondrial depolarization on the highest concentration tested. Membrane integrity disruption was not observed when analyzed by flow cytometry and no increase in non viable cells was registered. The later result was also seen on the trypan blue exclusion cell count. In vivo antitumor activity was evaluated in three tumor models: Sarcoma 180, ErlichÂs Carcinoma and Melanoma B16. Biflorin inhibited tumor growth in S-180 and Erlich transplanted animals and increased the antitumor effect of 5-FU where decreasing its toxicity. On B16 transplanted animals, survival span of biflorin-treated animals increased significantly. It was demonstrated that biflorin possess immune-adjuvant proprieties, increasing the production of anti-albumin antibodies, which can be related to its antitumor activity. Interaction of biflorin with single and double stranded DNA was confirmed, but was shown that it does not inhibit topoisomerase I, suggesting that a different mechanism is associated with this interaction, probably DNA damage induction. Biflorin showed genotocicity only on the comet assay, in which frequency and damage index towards human lymphocytes were significantly increased, without, however, inducing clastogenic effect on chromosome aberration assessment. On the other hand, due to its antioxidant effect, possibly associated to removal of hydroxi groups, biflorin, in lower concentrations, showed antimutagenic activity towards V79 cells and Saccharomyces cereviseae treated with H2O2. Moreover, it does not induce lipidic peroxidation, thus reducing this effect in V79 cells, as seen by assessment of TBARS levels. To discard any doubts on biflorinÂs non-mutagenic proprieties; the Ames test in Salmonella thyphimurium and the micronucleus assay on mouse bone marrow was carried out, both presenting a negative result. Taken together, these results suggest that biflorin is a strong cytotoxic compound against neoplastic cells as possess antitumor, immune-adjuvant and antioxidant potential, interacts directly with single and double stranded DNA, but not topoisomerase I, has a genotoxic but not mutagenic effect and increases survival rate in treated mice

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A principal causa de mortalidade em pacientes com cÃncer està relacionada com a presenÃa de tumores secundÃrios pelo organismo. Devido a falta de tratamento das metÃstases, muitos esforÃos estÃo sendo lanÃados para o desenvolvimento de novas drogas com potencial antimetastÃtico. Em estudos realizados em nosso laboratÃrio observamos que a biflorina, uma o-naftoquinona isolada das raÃzes da Capraria biflora, aumentava a sobrevida dos animais transplantados com o melanoma B16 sem expressiva toxicidade. Diante desse dado resolvemos avaliar a atividade antimetastÃtica desta naftoquinona, em modelos experimentais in vivo e in vitro, utilizando as linhagens celulares B16-F10 (melanoma murino) e MDAMB-435 (melanoma humano). A induÃÃo da metÃstase experimental foi realizada pela inoculaÃÃo da linhagem celular B16-F10 via veia caudal de animais C57BL/6. Neste ensaio, a biflorina (25 e 50 mg/kg/dia) inibiu a formaÃÃo dos nÃdulos metastÃtico em 57 e 71 %, respectivamente. Entretanto, em anÃlise histopatolÃgica dos pulmÃes dos animais tratados, foi observada a presenÃa de hemÃcias e hemossiderina, o que indica a presenÃa de hemorragia recente e tardia. Com objetivo de avaliar como a biflorina tem seu efeito sobre a metÃstase, foram realizados alguns ensaios in vitro utilizando duas linhagens de melanoma metastÃtico: B16-F10 e MDAMB-435. Em ensaio de adesÃo celular, a biflorina foi capaz de inibir a adesÃo de ambas as cÃlulas sobre o colÃgeno tipo I, um dos constituintes da matriz extracelular. AlÃm disso, em ensaio de migraÃÃo celular, utilizando o mÃtodo Wound healing (cicatrizaÃÃo), a biflorina tambÃm foi capaz de inibir a motilidade destas cÃlulas. Vale ressaltar que nesses ensaios foram utilizadas concentraÃÃes nÃo-citotÃxicas, o que exclue um efeito falso positivo. Por fim, em ensaio de zimograma com gelatina, foi observado que a biflorina nÃo alterava a liberaÃÃo das metaloproteinases -2 e -9 para o meio de crescimento, excluindo esse mecanismo de aÃÃo. Esses resultados sugerem que a biflorina apresenta um potencial antimetastÃtico bastante promissor atravÃs da sua aÃÃo sobre a adesÃo e migraÃÃo celular, eventos cruciais para que ocorra a formaÃÃo de metÃstase. Entretanto, futuros estudos sÃo necessÃrios para elucidar seu mecanismo de aÃÃo. / The main cause of mortality in cancer patients is related to the incidence of secondary tumors in the body. Owning up to the deficiency of therapeutic schemes direct to the treatment of metastasis, many efforts are being launched to develop drugs with anti-metastatic potential. In previous studies performed in our laboratory, biflorin, an o-naphthoquinone isolated from the roots of Capraria biflora, was found to increase the survival rates of B16-bearing mice without significant toxicity. In spite of these findings we decided to evaluate the anti-metastatic activity of biflorin using B16-F10 (murine melanoma) and MDAMB-435 (human melanoma) cells line. The experimental metastasis model was achieved by injecting B16-F10 cells in the tail vein of C57BL/6 mice. In this assay, biflorin (25 and 50 mg/kg/day) inhibited the formation of metastatic nodules in 57 and 71 %, respectively. Nevertheless, histopathological analyses of biflorin-treated lungs showed the presence of erythrocytes and hemosiderin, indicating the occurrence of recent and late hemorrhage. In order to evaluate how biflorin inhibits metastasis, we carried out in vitro tests using two cell lines of metastatic melanoma, B16-F10 and MDAMB-435. In the cell adhesion assay, biflorin inhibited adhesion of both cells lines on type I collagen, a substrate of the extracellular matrix. Moreover, biflorin was able to inhibit cell motility in the wound healing assay. The concentrations used in these assays did not show any cytotoxicity after 24 h of incubation, excluding a false-positive. Even so, in the zymogram assay we observed that biflorin did not alter the release of metallopeptidases -2 and -9 into growth medium, thus excluding this as the means by which biflorin exerts the anti-metastatic effect. These data suggest that biflorin has a promising anti-metastatic potential, as shown by its anti-adhesion and anti-migration properties on metastatic melanoma cell lines, however further studies are indispensable to elucidate its action mechanism.

Many quinones have been associated with a wide range of biological activities, including antitumoral, antimalarial, larvicidal and antibacterial activities. Although, there are many clinically important agents containing a quinone nucleus with excellent anticancer activity, many other quinones require testing for additional activities, for instance: Oncocalyxone A, Juglone, Biflorin and some hydroxylated and halogenated quinones. DNA represents one of the main targets of biologically active quinonoid compounds, which, generally, belong to the group of DNA intercalating and/or alkylating agents, and/or topoisomerase inhibitors. As such, the use of DNA biosensors or other electrochemical methods based on the investigation of nucleic acid/organic compound interaction, would allow to predicting a biological action, if this one is related to damage to DNA. Due to the importance of quinones, for instance, Oncocalyxone A, Juglone and Biflorin, electrochemical analysis and the development of a new electroanalytical method for detection in nanomolar quantities, together with DNA interaction analysis with those quinones was therein performed. We have used diverse electrochemical methods performed in protic and aprotic media, using glassy carbon electrode, Ag/AgCl electrode as reference and latinum wire as counter electrode. The pKa of juglone was determined (5.98). The development of a highly sensitive voltammetric sensor for oncocalyxone A using a glassy carbon electrode modified with a bilayer iron(II) tetrasulfonated phthalocyanine (FeTSPc) and iron(III) tetra-(N-methyl-4-pyridyl)-porphyrin (FeT4MPyP) was described. The modified electrode showed catalytic activity and stability for the oncocalyxone A reduction, provoking the anodic shift of the reduction peak potentials of ca. 30 mV and presenting much higher peak currents than those obtained on the bare GC electrode. A wide linear response range between 0.005-1.210-6 mol L-1, with a sensitivity of 8.11 μA L μmol-1 and limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) of 1.5 and 5.010-9 mol L-1 were obtained with this sensor, respectively. The interaction of chosen quinones with ssDNA, poly-guanilic and poly-adenilic acid was investigated, using voltammetric analysis, in solution. The DNA interaction investigation with juglone, oncocalyxone and biflorin had shown significant DNA activity, represented by the decrease of oxidation current and shift of oxidation peaks of guanine and adenine and the binding constant values obtained for these aducts; these observations could be related to Michael addition reaction, among other possible effects. Some of the quinones do not cause any change on the oxidation peaks of the used bases, as is the case of -lapachone, being used as negative control. These results, upon comparison with biological/ pharmacological activities, show correlation and indicate electrochemistry and DNA sensors as important tools in the screening of biologically active compounds. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Muitas quinonas têm sido associadas a uma grande variedade de atividades biológicas, incluindo atividades antitumorais, antimaláricas, larvicidas e antibacterianas. Embora existam muitos agentes clinicamente importantes contendo núcleo quinônico com excelente atividade anticâncer, muitas outras quinonas requerem testes para busca de atividades adicionais, como por exemplo: Oncocalixona A, Juglona, Biflorina e outras quinonas hidroxiladas e halogenadas. O DNA representa um dos principais alvos de compostos quinônicos, que, geralmente, pertencem aos grupos de intercaladores de DNA e/ou agentes alquilantes, e/ou inibidores de topoisomerases. Desta forma, o uso de biossensores de DNA ou outros métodos eletroquímicos baseados na investigação da interação entre ácidos nucléicos e compostos orgânicos, permitiria predizer a ação biológica, e se estas estão relacionadas aos danos ao DNA. Devido à importância das quinonas, entre elas, Oncocalixona A, Juglona e Biflorina, análises eletroquímicas e eletroanalíticas para detecção em quantidades nanomolares, bem como a investigação da interação destas quinonas com o DNA foram realizadas, no presente trabalho.Utilizou-se uma série de métodos eletroquímicos, em diferentes condições, em meios aprótico e prótico, usando eletrodo de carbono vítreo, como eletrodo de trabalho, Ag/AgCl, como eletrodo de referência e fio de platina, como contra-eletrodo. O pKa da juglona foi determinado (5,98). O desenvolvimento de um sensor voltamétrico altamente sensível para oncocalixona A, usando eletrodo de carbono vítreo modificado com uma bicamada de ftalocianina tetrassulfonada de ferro(II) (FeTSPc) e tetra-(N-metil- 4-piridil)-porfirina de ferro(III) (FeT4MPyP) foi descrito. O eletrodo modificado mostrou atividade catalítica e estabilidade para a redução da oncocalixona A, proporcionando o deslocamento anódico do potencial de pico de redução de ca. 30mV, apresentando correntes de pico maiores do que aquelas obtidas em eletrodo de carbono vítreo limpo. Uma faixa linear entre 0,005-1,210-6 mol L-1, com uma sensibilidade de 8,11 μA L μmol-1 e limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) de 1,5 e 5,010-9 mol L-1 foram obtidos com este sensor, respectivamente. A interação das quinonas escolhidas com ssDNA, ácido poliguanílico e ácido poliadenílico foi investigada usando análises voltamétricas, em solução. Juglona, oncocalixona e biflorina mostraram forte interação em relação ao DNA, representado experimentalmente pela diminuição da corrente de oxidação e deslocamento dos picos diagnósticos de guanina e adenina, bem como pelos valores das constantes de associação calculadas para o aduto formado. Algumas das quinonas não causaram qualquer mudança nos picos de oxidação das bases usadas, como foi o caso da -lapachona, o que serviu como controle negativo, indispensável em relação a comparações com métodos farmacológicos. Estes resultados foram correlacionados positivamente com atividades biológicas/farmacológicas. Sensores de DNA são importantes ferramentas no mapeamento de compostos biologicamente ativos.