Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:13:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lira_NayaraPatriciaVieirade_M.pdf: 3098417 bytes, checksum: 6441392e6b6c275daba6bd89e88cbaf8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Xylella fastidiosa e Agrobacterium tumefaciens são bactérias fitopatogênicas que infectam, respectivamente, o interior do xilema e de tecidos vasculares de raiz, ambientes cuja tensão de oxigênio é relativamente baixa. Uma vez que Xylella e Agrobacterium são bactérias estritamente aeróbicas, elas apresentam o operon bigR, responsável pela detoxificação do sulfeto de hidrogênio ou gás sulfídrico, um potente inibidor do citocromo c oxidase e respiração aeróbica. O operon bigR codifica cinco proteínas denominadas Blh (Beta-lactamase-like hydrolase), BigR (biofilm growth-associated repressor), um repressor transcricional e regulador do operon, e MP1-3, proteínas que compõem um transportador de membrana. Em trabalho anterior, foi demonstrado que mutantes de Agrobacterium deficientes na produção de Blh acumulavam gás sulfídrico, enquanto mutantes no repressor BigR secretavam mais sulfito, indicando que a proteína Blh convertia gás sulfídrico em sulfito e que este, que também é tóxico, seria exportado pelo complexo MP1-3. Além disso, dados de modelagem molecular indicaram que Blh poderia desempenhar funções de sulfotransferase e dioxigenase de enxofre, uma vez que apresenta os domínios DUF442 (rodanase) e ETHE1 (dioxigenase). A fim de testar tais hipóteses, este trabalho teve como principais objetivos a caracterização enzimática dos domínios DUF442 e ETHE1 da Blh de Xylella e Agrobacterium, como também confirmar interações proteína-proteína entre os componentes do operon bigR. Ensaios de atividade enzimática usando-se proteínas recombinantes purificadas confirmaram a função de dioxigenase de enxofre e de rodanase dos domínios ETHE1 e DUF442, respectivamente. Além disso, verificou-se que ambos os domínios produzem sulfito como produto final da reação, embora atuando em substratos diferentes. Ainda, ensaios de duplo híbrido de levedura mostraram haver inúmeras interações entre as proteínas do operon bigR, mas não entre os dois domínios DUF442 e ETHE1 de Blh que, de acordo com os ensaios enzimáticos, atuam de forma independente. / Abstract: Xylella fastidiosa and Agrobacterium tumefaciens are phytopathogenic bacteria that infect, respectively, the xylem vessels and root vascular tissues, where the oxygen tension is relatively lower. Since Xylella and Agrobacterium are strict aerobic organisms, they use the bigR operon for the detoxification of hydrogen sulfide, a potent inhibitor of cytochrome c oxidase and aerobic respiration. The bigR operon encodes five proteins designated Blh (Beta-lactamase-like hydrolase), BigR (biofilm growth-associated repressor), a transcriptional repressor that regulates the operon, and MP1-3, proteins that act as a membrane transporter. In a previous work, it was shown that Agrobacterium mutants deficient in Blh production accumulated hydrogen sulfide, whereas BigR-deficient mutants secreted sulfite at higher levels than the wild type bacteria, indicating that Blh converted hydrogen sulfide into sulfite, which would be exported by the MP1-3 complex. In addition, molecular modeling indicated that Blh could function as a sulfur transferase and sulfur dioxigenase, since it carries a DUF442 (rhodanese) and ETHE1 (dioxygenase) domains. To test such hypothesis, this work aimed to demonstrate the enzymatic activities of the DUF442 and ETHE1 domains of Blh from Xylella and Agrobacterium, as well as to confirm protein-protein interactions between components of the bigR operon. Enzyme activity assays using the purified proteins confirmed the sulfur dioxygenase and rhodanese activities of the ETHE1 and DUF442 domains, respectively. In addition, it was found that both domains produce sulfite as a final product, although having different substrates. Furthermore, yeast two-hybrid assays showed that many of the bigR operon proteins interact with each other, suggesting the formation of a protein complex. However, no physical interactions were detected between DUF442 and ETHE1 domains, which, according to the enzyme activity assays, act independently. / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T01:25:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa_RosiclerLazaro_D.pdf: 3769373 bytes, checksum: ba15f76eb9d63f64834d030ffed2482a (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O gene XF0767 de Xylella fastidiosa está localizado num operon composto por mais quatro genes classificados como proteínas hipotéticas (XF0768-XF0767-XF0766-XF0765-XF0764). Este operon está conservado em uma série de bactérias associadas a plantas, incluindo Agrobacterium tumefaciens, Mezorhizobium loti e Sinorhizobium meliloti. A região upstream ao códon de iniciação deste operon possui seqüências canônicas correspondentes a sítios -35 e ¿10 de regiões promotoras reguladas por fatores sigma70. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o sistema de regulação do operon pela proteína XF0767, nomeada BigR (biofilm growth-associated repressor), visando à compreensão deste sistema e sua importância para a bactéria. A proteína BigR se liga na seqüência repetida invertida (9-4-9) localizada na região ¿10 do promotor do operon XF0768-0764, denominada BigRbox. BigR inibe a atividade do operon reprimindo a expressão do gene repórter GFP em Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens e Xylella fastidiosa. Mutações no BigRbox dos promotores de Xylella e Agrobacterium afetam a ligação do repressor e abole a transcrição do gene repórter. Esses dados indicam, portanto, que BigR compete com a RNA polimerase pelo mesmo sítio de ligação ao DNA, revelando assim o mecanismo de regulação do operon. BigR apresenta similaridade com fatores transcricionais de bactérias contendo domínio HTH (helix-turn-helix) de ligação ao DNA. Apesar de BigR ter sido inicialmente classificada como uma proteína da família SmtB/ArsR, as quais regulam operons relacionados à resistência a metais, nossos dados indicam que BigR não atua como sensor de metal. A adição de cádmio, ferro e cobre na mistura de ligação causam uma aparente dissociação do complexo DNA/BigR, entretanto, estudos in vivo na presença de metais não evidenciaram nenhuma alteração na expressão do gene repórter. Mutantes deficientes em BigR também não apresentam diferença de crescimento na presença de metais. O gene XF0768 codifica uma proteína nomeada BLH (beta-lactamase-like hydrolase) por pertencer à superfamília das metalo-beta-lactamases. Dada a presença de BigR e BLH no operon de Xylella e Agrobacterium, a atividade do operon foi analisada em diferentes condições como crescimento das células repórter in planta, co-cultivo com bactérias endofíticas e deficiência nutricional. Entretanto, uma maior atividade do operon em Xylella e Agrobacterium foi detectada apenas na condição de biofilme. Células de Agrobacterium aderidas em raiz de tabaco também apresentaram maior expressão do gene repórter quando comparadas às células em suspensão. Mutantes de Agrobacterium deficientes em BigR (bigR-) apresentam maior expressão do gene repórter, confirmando que BigR age como o repressor transcricional do operon. A quantificação da formação de biofilme das células mutante e selvagem revelou uma maior densidade de biofilme no mutante bigR- em superfície de vidro e também maior quantidade de células aderidas em raiz de tabaco, indicando que o operon pode estar envolvido com o processo de adesão ou desenvolvimento do biofilme bacteriano. Do ponto de vista estrutural, foi mostrado que a proteína BigR truncada no N-terminal (?BigR) encontra-se estruturada na forma de trímero, diferindo do observado para as proteínas com domínio HTH que em geral formam dímeros e monômeros. BigR é estável termicamente, começando a perder estrutura à 74oC, mas retendo um sinal residual de a-hélice até 90oC. Tratamentos com altas concentrações de (NH4) SO 2 4 interferiram na ligação da proteína ao DNA alvo e no conteúdo de estrutura secundária sem alterar, contudo, sua estabilidade térmica. A purificação e cristalização da proteína ?BigR resultou na coleta de alguns conjuntos de dados da proteína nativa e derivada, através de soaking ou marcada com SeMet. Apesar dos dados obtidos serem de boa qualidade, até o momento, não foi possível a resolução da estrutura cristalográfica desta proteína / Abstract: The XF0767 gene from Xylella fastidiosa is located in an operon composed by a set of genes (XF0768-XF0767-XF0766-XF0765-XF0764) of unknown function. This operon is conserved in a number of plant-associated bacteria including Agrobacterium tumefaciens, Mezorhizobium loti e Sinorhizobium meliloti. The DNA region upstream of the operon has canonical sequences corresponding to ¿35 and ¿10 elements found in sigma70-regulated promoters. The aim of this work was to elucidate the biological function of the protein encoded by XF0767, named BigR (biofilm growth-associated repressor), as a transcriptional regulator and its importance to the bacteria. BigR binds to an inverted repeat sequence (9-4-9) located in the ¿10 region of the XF0768-0764 operon promoter. This sequence was named BigRbox. BigR repressed transcription of its own operon upon binding to the BigRbox in Xylella fastidiosa and Agrobacterium tumefaciens. Mutations in the BigRbox significantly affected the repressor binding and abolished transcription of the reporter gene in both bacteria, indicating that BigR compete with the RNA polymerase for the same promoter site. BigR is similar to HTH transcriptional factors of the SmtB/ArsR family, which control tolerance and detoxification of heavy metals in prokaryotes. Despite the similarities, BigR does not appear to function as a metal sensor, as initially predicted. Although binding of BigR to its target DNA was diminished in the presence of cadmium, copper and iron, operon regulation in response to metals was not demonstrated in vivo. In addition, Agrobacterium mutants deficient in BigR did not show changes in growth rates in the presence of metals. BLH is an unusual beta-lactamase-like hydrolase coded by the XF0768 gene. To gain insights into the possible function of the operon, the activity of reporter cells was observed in the presence of different compounds and conditions including in planta growth, effect of endophytic competition and nutrient deficiency. Significantly, an increased operon activity was observed in Xylella and Agrobacterium biofilms. Agrobacterium cells attached to tobacco roots also showed high levels of reporter gene expression in comparison to cells in suspension. A. tumefaciens mutants deficient in the BigR showed constitutive expression of the operon, confirming that BigR acts as a transcriptional repressor. Biofilm quantification showed increased biofilm formation in glass surfaces as well as in tobacco roots, indicating that the operon may play a role in cell adherence or biofilm development. Structurally, the truncated BigR protein (?BigR) is a trimmer in solution, as opposed to most HTH regulators known, which are usually found as dimmers or monomers. BigR is stable at high temperatures (74oC); however, treatments with high concentrations of ammonium sulfate interfere with the protein secondary structure and its DNA binding capacity, without affecting its thermal stability. Good quality X-ray diffraction data were collected for the native and derivative ?bigR protein; however, structure resolution was not possible probably due to problems with the crystals / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular