Introdução: A atresia biliar (AB) inclui obstrução completas das vias biliares extra-hepáticas e uma colangiopatia intra-hepática progressiva, cirrogênica. A natureza da colangiopatia destes processos permanece obscura. Uma arteriopatia levando a colangiopatia isquêmica explicaria a natureza progressiva da lesão biliar. A imunolocalização do fator de crescimento endotelial vascular A (VEGFA) em ramos arteriais e ductos biliares intra-hepáticos e do porta hepatis dos pacientes com AB sugere isquemia nestas estruturas. A ocorrência de hipóxia hepatobiliar na AB necessita ser esclarecida. Objetivo: Determinar a presença de hipóxia nos fígados de pacientes com AB, analisando a expressão gênica dos fatores induzidos por hipóxia (HIF) -1α e -2α. Métodos: Estudo de amostras de biópsias em cunha coletadas na laparotomia exploradora de pacientes com AB isolada sem IgM+ para citomegalovírus (n= 32) comparando com lactentes com colestase intra-hepática (CIH, n= 09), pareados por idade. Uma amostra foi ultracongelada (análise molecular) e outra, parafinizada (análises histológica e imunoistoquímica). Por PCRq, usando sondas TaqMan®, avaliaram-se as expressões gênicas de: HIF1-α, HIF2-α, proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP1) (marcador de fibrose biliar), citoqueratina 19 (CK19) (marcador de colangiócitos). O gene normalizador foi 18S ribossômico. Por morfometria, foram quantificadas as extensões de fibrose e reação ductular. Dados clínico-laboratoriais foram prospectivamente coletados. Resultados: O grupo AB, comparado à CIH, apresentou maior expressão de HIF1-α e HIF2-α. No grupo AB, a expressão do HIF1-α correlacionou-se positivamente com a bilirrubina total (BT) sérica. Dois subgrupos de AB foram detectados quanto à expressão dos HIFs: alta (hiHIF, expressão 3x maior que a mediana da CIH) e baixa (loHIF). Pacientes hiHIF-1α eram mais velhos e com maiores níveis de BT e bilirrubina direta (BD) que loHIF-1α. O subgrupo hiHIF-2α apresentou expressão de CK19 inferior a do loHIF-2α. As demais variáveis foram semelhantes nos subgrupos HIFs. Conclusão: Na AB ocorre hipóxia tecidual hepática. Os dados sugerem a existência de hipóxia tecidual progressiva nos fígados afetados pela AB, associada ao desaparecimento de ductos biliares e à piora do quadro obstrutivo biliar. / Background: Biliary atresia (BA) includes a complete obstruction of the extrahepatic biliary tract and progressive intrahepatic cholangiopathy, and the nature of these processes remains unclear. An arteriopthy, leading to an ischemic cholangiopathy, can be involved. The immunolocalization of vascular endothelial growth factor A (VEGFA) in arterial branches and bile ducts both within the liver and at porta hepatis from patients with BA suggests ischemia in these structures. The occurrence of hypoxia in the hepatobiliary system in BA needs to be elucidated. Aim: To determinate the presence of hypoxia in the livers from patients with BA, by analyzing the gene expression of hypoxia-inducible factor (HIF) -1α and -2α. Methods: Liver biopsy specimens collected at exploratory laparotomy of age-matched patients with isolated, cytomegalovirus IgM-negative BA (n=32) and intrahepatic cholestasis (IHC, n=9) were evaluated. A sample was ultrafrozen (molecular analysis) and the other was paraffin-embedded (for histological and morphometric analyzes). Gene expression of: HIF-1α, HIF-2α, monocyte chemoattractant protein 1 (MCP1) (biliary fibrosis marker) and cytokeratin 19 (CK19) (cholangiocyte marker) were evaluated by PCRq using TaqMan® probes. The normalizing gene was 18S ribosomal. The extents of fibrosis and ductular reaction were assessed by morphometry. Clinical and laboratory data were prospectively collected. Results: There was higher HIF-1α and HIF-2α expression in BA in comparison with IHC. In BA, the HIF-1α expression was positively correlated with total serum bilirubin (TB). Two groups were observable in BA regarding HIFs: higher (hiHIF, considering as cutoff point a value higher than 3x the median of expression in IHC) and lower (loHIF). Patients with hiHIF-1α were older and presented increased levels of TB and direct-reacting serum bilirubin (DB) than loHIF-1α. Patients with hiHIF-2α presented CK19 expression lower than in loHIF-2α. The other variables were similar in subgroups HIFs. Conclusion: In BA there is hypoxia in the liver tissue, which seems to be progressive and associated with the disappearance of bile ducts and worsening biliary obstruction.

Introdução: A atresia biliar (AB) inclui obstrução completas das vias biliares extra-hepáticas e uma colangiopatia intra-hepática progressiva, cirrogênica. A natureza da colangiopatia destes processos permanece obscura. Uma arteriopatia levando a colangiopatia isquêmica explicaria a natureza progressiva da lesão biliar. A imunolocalização do fator de crescimento endotelial vascular A (VEGFA) em ramos arteriais e ductos biliares intra-hepáticos e do porta hepatis dos pacientes com AB sugere isquemia nestas estruturas. A ocorrência de hipóxia hepatobiliar na AB necessita ser esclarecida. Objetivo: Determinar a presença de hipóxia nos fígados de pacientes com AB, analisando a expressão gênica dos fatores induzidos por hipóxia (HIF) -1α e -2α. Métodos: Estudo de amostras de biópsias em cunha coletadas na laparotomia exploradora de pacientes com AB isolada sem IgM+ para citomegalovírus (n= 32) comparando com lactentes com colestase intra-hepática (CIH, n= 09), pareados por idade. Uma amostra foi ultracongelada (análise molecular) e outra, parafinizada (análises histológica e imunoistoquímica). Por PCRq, usando sondas TaqMan®, avaliaram-se as expressões gênicas de: HIF1-α, HIF2-α, proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP1) (marcador de fibrose biliar), citoqueratina 19 (CK19) (marcador de colangiócitos). O gene normalizador foi 18S ribossômico. Por morfometria, foram quantificadas as extensões de fibrose e reação ductular. Dados clínico-laboratoriais foram prospectivamente coletados. Resultados: O grupo AB, comparado à CIH, apresentou maior expressão de HIF1-α e HIF2-α. No grupo AB, a expressão do HIF1-α correlacionou-se positivamente com a bilirrubina total (BT) sérica. Dois subgrupos de AB foram detectados quanto à expressão dos HIFs: alta (hiHIF, expressão 3x maior que a mediana da CIH) e baixa (loHIF). Pacientes hiHIF-1α eram mais velhos e com maiores níveis de BT e bilirrubina direta (BD) que loHIF-1α. O subgrupo hiHIF-2α apresentou expressão de CK19 inferior a do loHIF-2α. As demais variáveis foram semelhantes nos subgrupos HIFs. Conclusão: Na AB ocorre hipóxia tecidual hepática. Os dados sugerem a existência de hipóxia tecidual progressiva nos fígados afetados pela AB, associada ao desaparecimento de ductos biliares e à piora do quadro obstrutivo biliar. / Background: Biliary atresia (BA) includes a complete obstruction of the extrahepatic biliary tract and progressive intrahepatic cholangiopathy, and the nature of these processes remains unclear. An arteriopthy, leading to an ischemic cholangiopathy, can be involved. The immunolocalization of vascular endothelial growth factor A (VEGFA) in arterial branches and bile ducts both within the liver and at porta hepatis from patients with BA suggests ischemia in these structures. The occurrence of hypoxia in the hepatobiliary system in BA needs to be elucidated. Aim: To determinate the presence of hypoxia in the livers from patients with BA, by analyzing the gene expression of hypoxia-inducible factor (HIF) -1α and -2α. Methods: Liver biopsy specimens collected at exploratory laparotomy of age-matched patients with isolated, cytomegalovirus IgM-negative BA (n=32) and intrahepatic cholestasis (IHC, n=9) were evaluated. A sample was ultrafrozen (molecular analysis) and the other was paraffin-embedded (for histological and morphometric analyzes). Gene expression of: HIF-1α, HIF-2α, monocyte chemoattractant protein 1 (MCP1) (biliary fibrosis marker) and cytokeratin 19 (CK19) (cholangiocyte marker) were evaluated by PCRq using TaqMan® probes. The normalizing gene was 18S ribosomal. The extents of fibrosis and ductular reaction were assessed by morphometry. Clinical and laboratory data were prospectively collected. Results: There was higher HIF-1α and HIF-2α expression in BA in comparison with IHC. In BA, the HIF-1α expression was positively correlated with total serum bilirubin (TB). Two groups were observable in BA regarding HIFs: higher (hiHIF, considering as cutoff point a value higher than 3x the median of expression in IHC) and lower (loHIF). Patients with hiHIF-1α were older and presented increased levels of TB and direct-reacting serum bilirubin (DB) than loHIF-1α. Patients with hiHIF-2α presented CK19 expression lower than in loHIF-2α. The other variables were similar in subgroups HIFs. Conclusion: In BA there is hypoxia in the liver tissue, which seems to be progressive and associated with the disappearance of bile ducts and worsening biliary obstruction.

Introdução: A atresia biliar (AB) inclui obstrução completas das vias biliares extra-hepáticas e uma colangiopatia intra-hepática progressiva, cirrogênica. A natureza da colangiopatia destes processos permanece obscura. Uma arteriopatia levando a colangiopatia isquêmica explicaria a natureza progressiva da lesão biliar. A imunolocalização do fator de crescimento endotelial vascular A (VEGFA) em ramos arteriais e ductos biliares intra-hepáticos e do porta hepatis dos pacientes com AB sugere isquemia nestas estruturas. A ocorrência de hipóxia hepatobiliar na AB necessita ser esclarecida. Objetivo: Determinar a presença de hipóxia nos fígados de pacientes com AB, analisando a expressão gênica dos fatores induzidos por hipóxia (HIF) -1α e -2α. Métodos: Estudo de amostras de biópsias em cunha coletadas na laparotomia exploradora de pacientes com AB isolada sem IgM+ para citomegalovírus (n= 32) comparando com lactentes com colestase intra-hepática (CIH, n= 09), pareados por idade. Uma amostra foi ultracongelada (análise molecular) e outra, parafinizada (análises histológica e imunoistoquímica). Por PCRq, usando sondas TaqMan®, avaliaram-se as expressões gênicas de: HIF1-α, HIF2-α, proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP1) (marcador de fibrose biliar), citoqueratina 19 (CK19) (marcador de colangiócitos). O gene normalizador foi 18S ribossômico. Por morfometria, foram quantificadas as extensões de fibrose e reação ductular. Dados clínico-laboratoriais foram prospectivamente coletados. Resultados: O grupo AB, comparado à CIH, apresentou maior expressão de HIF1-α e HIF2-α. No grupo AB, a expressão do HIF1-α correlacionou-se positivamente com a bilirrubina total (BT) sérica. Dois subgrupos de AB foram detectados quanto à expressão dos HIFs: alta (hiHIF, expressão 3x maior que a mediana da CIH) e baixa (loHIF). Pacientes hiHIF-1α eram mais velhos e com maiores níveis de BT e bilirrubina direta (BD) que loHIF-1α. O subgrupo hiHIF-2α apresentou expressão de CK19 inferior a do loHIF-2α. As demais variáveis foram semelhantes nos subgrupos HIFs. Conclusão: Na AB ocorre hipóxia tecidual hepática. Os dados sugerem a existência de hipóxia tecidual progressiva nos fígados afetados pela AB, associada ao desaparecimento de ductos biliares e à piora do quadro obstrutivo biliar. / Background: Biliary atresia (BA) includes a complete obstruction of the extrahepatic biliary tract and progressive intrahepatic cholangiopathy, and the nature of these processes remains unclear. An arteriopthy, leading to an ischemic cholangiopathy, can be involved. The immunolocalization of vascular endothelial growth factor A (VEGFA) in arterial branches and bile ducts both within the liver and at porta hepatis from patients with BA suggests ischemia in these structures. The occurrence of hypoxia in the hepatobiliary system in BA needs to be elucidated. Aim: To determinate the presence of hypoxia in the livers from patients with BA, by analyzing the gene expression of hypoxia-inducible factor (HIF) -1α and -2α. Methods: Liver biopsy specimens collected at exploratory laparotomy of age-matched patients with isolated, cytomegalovirus IgM-negative BA (n=32) and intrahepatic cholestasis (IHC, n=9) were evaluated. A sample was ultrafrozen (molecular analysis) and the other was paraffin-embedded (for histological and morphometric analyzes). Gene expression of: HIF-1α, HIF-2α, monocyte chemoattractant protein 1 (MCP1) (biliary fibrosis marker) and cytokeratin 19 (CK19) (cholangiocyte marker) were evaluated by PCRq using TaqMan® probes. The normalizing gene was 18S ribosomal. The extents of fibrosis and ductular reaction were assessed by morphometry. Clinical and laboratory data were prospectively collected. Results: There was higher HIF-1α and HIF-2α expression in BA in comparison with IHC. In BA, the HIF-1α expression was positively correlated with total serum bilirubin (TB). Two groups were observable in BA regarding HIFs: higher (hiHIF, considering as cutoff point a value higher than 3x the median of expression in IHC) and lower (loHIF). Patients with hiHIF-1α were older and presented increased levels of TB and direct-reacting serum bilirubin (DB) than loHIF-1α. Patients with hiHIF-2α presented CK19 expression lower than in loHIF-2α. The other variables were similar in subgroups HIFs. Conclusion: In BA there is hypoxia in the liver tissue, which seems to be progressive and associated with the disappearance of bile ducts and worsening biliary obstruction.

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13138号 / 論医博第2138号 / 新制||医||1025(附属図書館) / (主査)教授 伊達 洋至, 教授 坂井 義治, 教授 武藤 学 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

A atresia das vias biliares é afecção hepática da infância. A etiologia é desconhecida, e o diagnóstico baseia-se na biópsia hepática, cujo achado é a proliferação ductular. A ligadura do ducto biliar comum em ratos é modelo utilizado para estudo das doenças colestáticas. A proposta do trabalho foi estudar, em modelo experimental de obstrução biliar, as alterações histológicas hepáticas em ratos jovens e compará-las com o animal adulto. Avaliou-se a semiquantificação da proliferação ductular e inflamação pelo HE; quantificação da fibrose portal e periportal pelo picrosírius; semiquantificação da expressão de desmina e a-actina de músculo liso pelas células estreladas e miofibroblastos. Apesar das respostas de proliferação ductular e inflamação mais lentas no rato jovem, a fibrose e a expressão de desmina foram mais intensas neste grupo / Biliary atresia is an hepatic disease of infancy. Etiology is unknown, and diagnosis is made by liver biopsy, with ductular proliferation being the main histological feature. Bile duct ligation in rats is an useful experimental model of biliary obstruction. The aim of this study of extra-hepatic cholestasis was analyse hepatic histological alterations in young rats compared to adult animals. The responses were studied by semiquantification of ductular proliferation and inflammatory infiltrated by HE stain; quantification of portal and periportal fibrosis with the sirius-red stain; semiquantification of the expression of desmin and a-smooth muscle actin by the hepatic stellated cells and myofibroblasts. In young animals, despite the very slow response of ductular proliferation and inflammation observed with HE, there were significantly more fibrosis and expression of desmin than in adult group

A atresia biliar (AB) é uma colangiopatia de etiologia indeterminada que leva à necessidade de transplante hepático, mesmo com a realização da Portoenterostomia em tempo hábil. O espessamento da camada média da artéria hepática sugere o envolvimento de um distúrbio angiogênico. Este estudo objetivou avaliar a expressão imunoistoquímica do VEGF A e seus receptores nas estruturas hepatobiliares de pacientes com AB. Nós avaliamos, por método semiquantitativo, a positividade do VEGF A, VEGFR1 e VEGFR2 em biópsia de fígados obtidas por ocasião da Portoenterostomia de crianças com AB (n=52),com (n=14) e sem (n=38) malformação extra-hepáticas. Seviram como controles, pacientes com colestase intra-hepática (CI)\ (n=7). A positividade do VEGFA foi também avaliada em explantes (n=33) e porta hepatis (n=16) de pacientes com AB. Avaliamos morfometricamente as variáveis positividade de CK7 (PCK7) em biópsia de pacientes com AB e a relação espessura da camada média arterial/ diâmetro luminal (REMD) em ramos da artéria hepática de pacientes com AB e de pacientes com CI. Nós encontramos que a positividade do VEGF A foi maior em pacientes com AB por ocasião da Portoenterostomia (p=0, 006) que nos outros grupos, enquanto que nos explantes, a positividade de VEGF A foi maior no parênquima (P<0.001). A positividade do VEGFR2 em ducto biliares e hepatócitos foi menor em pacientes com AB que nos casos de CI (P=0.023 e P=0.011, respectivamente). Maior positividade de CK7 ocorreu em pacientes com artérias e estruturas biliares positivas para VEGF A (P<0.001 e P=0.040, respectivamente). Nos pacientes com AB por ocasião da Portoenterostomia a positividade do VEGF A em estruturas biliares, artérias e hepatócitos correlacionou-se com PCK7 (P=0.031, P=0.031 e P=0.032, respectivamente). O VEGF A foi expresso no porta hepatis de pacientes com AB em artérias e em ductos biliares, principalmente nos pacientes sem malformações extra-hepáticas (P=0.013). A positividade do VEGF A associou-se com a maior REMD (P=0.016 e P=0.044, respectivamente). Nossos achados sugerem que a colangiopatia isquêmica, agravada pela proliferação biliar, ocorre na AB por ocasião da Portoenterostomia, começando no porta hepatis. O espessamento da camada média arterial está associada à expressão do VEGF A. / In Biliary atresia (BA) a cholangiopathy of elusive etiology leads to the need of liver transplantation regardless of timely performance of Portoenterostomy; hepatic arterial medial thickening suggests involvement of a disturbed angiogenesis. This study aimed to evaluate the immunohistochemical expression of VEGF A and its receptors in hepatobiliary structures in BA. We semiquantitatively analyzed the positivity rate of VEGF A, VEGF-R1 and -R2 in liver biopsies obtained at Portoenterostomy from infants with BA (n=52), with (n=14) and without (n=38) extrahepatic malformations. Controls were infants with intrahepatic cholestasis (IC, n=7). VEGF A positivity was also evaluated in explants (n=33) and at porta hepatis (n=16) from patients with BA. We morphometrically assessed the variables percentage of CK-7 positivity (PCK7) in biopsies from patients with BA, and the ratio medial layer thickness/luminal diameter (RMED) in hepatic arterial branches from infants with BA and IC. We found that arterial VEGF A positivity was higher in patients with BA at the time of Portoenterostomy (P=0.006) than in other groups, while explants’parenchyma presented the highest VEGF A positivity (P<0.001). Biliary and hepatocytic VEGFR2 positivity was lower in BA than IC (P=0.023 and P=0.011, respectively). Higher PCK7 occurred in arterial and biliary VEGF A-positive patients (P<0.001 and P=0.040, respectively). Biliary, arterial and hepatocytic VEGF A positivity in BA at Portoenterostomy was correlated with PCK7 (P=0.031, P=0.031 and P=0.032, respectively). VEGF A was expressed at porta hepatis from BA patients in arteries, and, in bile ducts mainly in patients without extrahepatic malformations (P=0.013). Biliary and arterial VEGF A positivity was associated with higher RMED (P=0.016 and P=0.044, respectively). Our findings suggest that an ischemic cholangiopathy, aggravated by biliary proliferation, exists in BA at the time of Portoenterostomy, beginning at porta hepatis. Medial layer thickening is associated with VEGF A expression.

A atresia biliar (AB) é uma colangiopatia de etiologia indeterminada que leva à necessidade de transplante hepático, mesmo com a realização da Portoenterostomia em tempo hábil. O espessamento da camada média da artéria hepática sugere o envolvimento de um distúrbio angiogênico. Este estudo objetivou avaliar a expressão imunoistoquímica do VEGF A e seus receptores nas estruturas hepatobiliares de pacientes com AB. Nós avaliamos, por método semiquantitativo, a positividade do VEGF A, VEGFR1 e VEGFR2 em biópsia de fígados obtidas por ocasião da Portoenterostomia de crianças com AB (n=52),com (n=14) e sem (n=38) malformação extra-hepáticas. Seviram como controles, pacientes com colestase intra-hepática (CI)\ (n=7). A positividade do VEGFA foi também avaliada em explantes (n=33) e porta hepatis (n=16) de pacientes com AB. Avaliamos morfometricamente as variáveis positividade de CK7 (PCK7) em biópsia de pacientes com AB e a relação espessura da camada média arterial/ diâmetro luminal (REMD) em ramos da artéria hepática de pacientes com AB e de pacientes com CI. Nós encontramos que a positividade do VEGF A foi maior em pacientes com AB por ocasião da Portoenterostomia (p=0, 006) que nos outros grupos, enquanto que nos explantes, a positividade de VEGF A foi maior no parênquima (P<0.001). A positividade do VEGFR2 em ducto biliares e hepatócitos foi menor em pacientes com AB que nos casos de CI (P=0.023 e P=0.011, respectivamente). Maior positividade de CK7 ocorreu em pacientes com artérias e estruturas biliares positivas para VEGF A (P<0.001 e P=0.040, respectivamente). Nos pacientes com AB por ocasião da Portoenterostomia a positividade do VEGF A em estruturas biliares, artérias e hepatócitos correlacionou-se com PCK7 (P=0.031, P=0.031 e P=0.032, respectivamente). O VEGF A foi expresso no porta hepatis de pacientes com AB em artérias e em ductos biliares, principalmente nos pacientes sem malformações extra-hepáticas (P=0.013). A positividade do VEGF A associou-se com a maior REMD (P=0.016 e P=0.044, respectivamente). Nossos achados sugerem que a colangiopatia isquêmica, agravada pela proliferação biliar, ocorre na AB por ocasião da Portoenterostomia, começando no porta hepatis. O espessamento da camada média arterial está associada à expressão do VEGF A. / In Biliary atresia (BA) a cholangiopathy of elusive etiology leads to the need of liver transplantation regardless of timely performance of Portoenterostomy; hepatic arterial medial thickening suggests involvement of a disturbed angiogenesis. This study aimed to evaluate the immunohistochemical expression of VEGF A and its receptors in hepatobiliary structures in BA. We semiquantitatively analyzed the positivity rate of VEGF A, VEGF-R1 and -R2 in liver biopsies obtained at Portoenterostomy from infants with BA (n=52), with (n=14) and without (n=38) extrahepatic malformations. Controls were infants with intrahepatic cholestasis (IC, n=7). VEGF A positivity was also evaluated in explants (n=33) and at porta hepatis (n=16) from patients with BA. We morphometrically assessed the variables percentage of CK-7 positivity (PCK7) in biopsies from patients with BA, and the ratio medial layer thickness/luminal diameter (RMED) in hepatic arterial branches from infants with BA and IC. We found that arterial VEGF A positivity was higher in patients with BA at the time of Portoenterostomy (P=0.006) than in other groups, while explants’parenchyma presented the highest VEGF A positivity (P<0.001). Biliary and hepatocytic VEGFR2 positivity was lower in BA than IC (P=0.023 and P=0.011, respectively). Higher PCK7 occurred in arterial and biliary VEGF A-positive patients (P<0.001 and P=0.040, respectively). Biliary, arterial and hepatocytic VEGF A positivity in BA at Portoenterostomy was correlated with PCK7 (P=0.031, P=0.031 and P=0.032, respectively). VEGF A was expressed at porta hepatis from BA patients in arteries, and, in bile ducts mainly in patients without extrahepatic malformations (P=0.013). Biliary and arterial VEGF A positivity was associated with higher RMED (P=0.016 and P=0.044, respectively). Our findings suggest that an ischemic cholangiopathy, aggravated by biliary proliferation, exists in BA at the time of Portoenterostomy, beginning at porta hepatis. Medial layer thickening is associated with VEGF A expression.

A atresia biliar (AB) é uma colangiopatia de etiologia indeterminada que leva à necessidade de transplante hepático, mesmo com a realização da Portoenterostomia em tempo hábil. O espessamento da camada média da artéria hepática sugere o envolvimento de um distúrbio angiogênico. Este estudo objetivou avaliar a expressão imunoistoquímica do VEGF A e seus receptores nas estruturas hepatobiliares de pacientes com AB. Nós avaliamos, por método semiquantitativo, a positividade do VEGF A, VEGFR1 e VEGFR2 em biópsia de fígados obtidas por ocasião da Portoenterostomia de crianças com AB (n=52),com (n=14) e sem (n=38) malformação extra-hepáticas. Seviram como controles, pacientes com colestase intra-hepática (CI)\ (n=7). A positividade do VEGFA foi também avaliada em explantes (n=33) e porta hepatis (n=16) de pacientes com AB. Avaliamos morfometricamente as variáveis positividade de CK7 (PCK7) em biópsia de pacientes com AB e a relação espessura da camada média arterial/ diâmetro luminal (REMD) em ramos da artéria hepática de pacientes com AB e de pacientes com CI. Nós encontramos que a positividade do VEGF A foi maior em pacientes com AB por ocasião da Portoenterostomia (p=0, 006) que nos outros grupos, enquanto que nos explantes, a positividade de VEGF A foi maior no parênquima (P<0.001). A positividade do VEGFR2 em ducto biliares e hepatócitos foi menor em pacientes com AB que nos casos de CI (P=0.023 e P=0.011, respectivamente). Maior positividade de CK7 ocorreu em pacientes com artérias e estruturas biliares positivas para VEGF A (P<0.001 e P=0.040, respectivamente). Nos pacientes com AB por ocasião da Portoenterostomia a positividade do VEGF A em estruturas biliares, artérias e hepatócitos correlacionou-se com PCK7 (P=0.031, P=0.031 e P=0.032, respectivamente). O VEGF A foi expresso no porta hepatis de pacientes com AB em artérias e em ductos biliares, principalmente nos pacientes sem malformações extra-hepáticas (P=0.013). A positividade do VEGF A associou-se com a maior REMD (P=0.016 e P=0.044, respectivamente). Nossos achados sugerem que a colangiopatia isquêmica, agravada pela proliferação biliar, ocorre na AB por ocasião da Portoenterostomia, começando no porta hepatis. O espessamento da camada média arterial está associada à expressão do VEGF A. / In Biliary atresia (BA) a cholangiopathy of elusive etiology leads to the need of liver transplantation regardless of timely performance of Portoenterostomy; hepatic arterial medial thickening suggests involvement of a disturbed angiogenesis. This study aimed to evaluate the immunohistochemical expression of VEGF A and its receptors in hepatobiliary structures in BA. We semiquantitatively analyzed the positivity rate of VEGF A, VEGF-R1 and -R2 in liver biopsies obtained at Portoenterostomy from infants with BA (n=52), with (n=14) and without (n=38) extrahepatic malformations. Controls were infants with intrahepatic cholestasis (IC, n=7). VEGF A positivity was also evaluated in explants (n=33) and at porta hepatis (n=16) from patients with BA. We morphometrically assessed the variables percentage of CK-7 positivity (PCK7) in biopsies from patients with BA, and the ratio medial layer thickness/luminal diameter (RMED) in hepatic arterial branches from infants with BA and IC. We found that arterial VEGF A positivity was higher in patients with BA at the time of Portoenterostomy (P=0.006) than in other groups, while explants’parenchyma presented the highest VEGF A positivity (P<0.001). Biliary and hepatocytic VEGFR2 positivity was lower in BA than IC (P=0.023 and P=0.011, respectively). Higher PCK7 occurred in arterial and biliary VEGF A-positive patients (P<0.001 and P=0.040, respectively). Biliary, arterial and hepatocytic VEGF A positivity in BA at Portoenterostomy was correlated with PCK7 (P=0.031, P=0.031 and P=0.032, respectively). VEGF A was expressed at porta hepatis from BA patients in arteries, and, in bile ducts mainly in patients without extrahepatic malformations (P=0.013). Biliary and arterial VEGF A positivity was associated with higher RMED (P=0.016 and P=0.044, respectively). Our findings suggest that an ischemic cholangiopathy, aggravated by biliary proliferation, exists in BA at the time of Portoenterostomy, beginning at porta hepatis. Medial layer thickening is associated with VEGF A expression.

A atresia das vias biliares é afecção hepática da infância. A etiologia é desconhecida, e o diagnóstico baseia-se na biópsia hepática, cujo achado é a proliferação ductular. A ligadura do ducto biliar comum em ratos é modelo utilizado para estudo das doenças colestáticas. A proposta do trabalho foi estudar, em modelo experimental de obstrução biliar, as alterações histológicas hepáticas em ratos jovens e compará-las com o animal adulto. Avaliou-se a semiquantificação da proliferação ductular e inflamação pelo HE; quantificação da fibrose portal e periportal pelo picrosírius; semiquantificação da expressão de desmina e a-actina de músculo liso pelas células estreladas e miofibroblastos. Apesar das respostas de proliferação ductular e inflamação mais lentas no rato jovem, a fibrose e a expressão de desmina foram mais intensas neste grupo / Biliary atresia is an hepatic disease of infancy. Etiology is unknown, and diagnosis is made by liver biopsy, with ductular proliferation being the main histological feature. Bile duct ligation in rats is an useful experimental model of biliary obstruction. The aim of this study of extra-hepatic cholestasis was analyse hepatic histological alterations in young rats compared to adult animals. The responses were studied by semiquantification of ductular proliferation and inflammatory infiltrated by HE stain; quantification of portal and periportal fibrosis with the sirius-red stain; semiquantification of the expression of desmin and a-smooth muscle actin by the hepatic stellated cells and myofibroblasts. In young animals, despite the very slow response of ductular proliferation and inflammation observed with HE, there were significantly more fibrosis and expression of desmin than in adult group

Atresia de vias biliares (AVB) é uma hepatopatia colestática específica da criança, de etiologia desconhecida, com evolução para fibrose hepática precoce. AVB é a principal causa de cirrose na infância e principal indicação de transplante hepático pediátrico (Tx). Compreender os fatores envolvidos na progressão da fibrose é fundamental para estabelecer tratamentos efetivos nas hepatopatias crônicas. Identificar padrões histopatológicos associados ao prognóstico da AVB permitiria melhor planejamento dos centros de transplante e adequado aconselhamento familiar. OBJETIVO: Estabelecer padrões de marcadores histopatológicos e de imunofluorescência para colágenos em biópsias hepáticas iniciais e finais de pacientes com AVB submetidos a tratamento cirúrgico. Correlacionar esses marcadores com o prognóstico da doença, definido com base no tempo de evolução até realização do Tx. MÉTODO: Avaliação histológica de alterações biliares e fibrose hepática e histomorfometria da fibrose marcada por picrossírius e da deposição dos colágenos tipos I, III, IV e V marcados por imunofluorescência indireta (IF), em biópsias hepáticas iniciais e finais de 36 pacientes com AVB submetidos à hepatoportoenterostomia de Kasai (KPE) e ao Tx nos últimos 20 anos em nossa instituição. RESULTADOS: A mediana das idades de realização da KPE foi de 12,5 semanas (6-20) e do Tx foi de 27 meses (6-120). Reação ductular e malformação de placa ductal foram mais intensas nas biópsias iniciais (p < 0,05), enquanto fibrose hepática e ductopenia apresentaram padrão progressivo (p < 0,001), sem correlações com a idade de realização da KPE nem com o tempo de evolução até Tx. A morfometria da fibrose hepática marcada pelo picrossírius nas biópsias iniciais apresentou correlação positiva com a idade da KPE (p = 0,01), mas não com a idade do Tx (p = 0,24). A deposição perissinusoidal dos colágenos dos tipos III e V foi mais intensa nas biópsias iniciais (p < 0,01), enquanto os colágenos dos tipos I e IV apresentaram padrão de deposição progressiva (p < 0,01). Pacientes com maior deposição perissinusoidal de colágeno tipo I nas biópsias iniciais apresentaram curva de tempo de evolução até Tx sugerindo pior prognóstico (p = 0,04). CONCLUSÃO: Marcadores histopatológicos de alterações biliares, fibrose hepática e deposição de colágenos apresentaram características evolutivas distintas nas fases inicial e final da AVB, sem correlação com o tempo de evolução até Tx. A morfometria da deposição perissinusoidal de colágeno tipo I em biopsias iniciais marcadas por IF pode ser correlacionada ao tempo de evolução até Tx em pacientes com AVB operada / Biliary atresia (BA) is a specific cholestatic liver disease of unknown etiology that affects children and progresses to early hepatic fibrosis. BA is the main indication of pediatric liver transplantation (LTx). Understanding the factors involved in the progress of fibrosis is essential to establish effective treatment to chronic liver disease. Histopathological markers in liver biopsies could be useful to predict progression to end stage disease and to make it possible to improve planning in transplantation centers and parental orientation. OBJECTIVE: To establish histopathological or immunohistochemical markers in initial or final liver biopsies of BA patients and correlate those markers with prognosis, as defined by progression time lapse until LTx. METHOD: Histological analysis of multiple parameters of biliary alterations and morphometrical assessment of liver fibrosis were performed, besides indirect immunofluorescence assays (IF) for type I, III, IV and V collagens in initial and final liver biopsies of 36 patients with BA submitted to Kasai hepatoportoenterostomy (KPE) and LTx in the last 20 years in a single center. RESULTS: The median of the ages at KPE was 12.5 weeks (6-20) and at LTx was 27 months (6-120). Ductular reaction and ductal plate malformation were more severe in the initial biopsies (p < 0.05), while ductopenia and liver fibrosis were more severe in final biopsies (p < 0.001), though without correlation with age at KPE nor with progression time lapse until LTx. Morphometrical assessment of liver fibrosis marked by picrosirius red in initial biopsies demonstrated positive correlation with age at KPE (p = 0.01) but not with age at LTx (p = 0.24). The perisinusoidal deposition of type III and V collagens was more extended in the initial biopsies (p < 0.01), while type I and IV collagens deposition indicated progression (p < 0.01). Patients with large amounts of perisinusoidal type I collagen in the initial biopsies had worse progression time curve until LTx (p = 0.04). CONCLUSION: Biliary alterations, liver fibrosis and collagens deposition demonstrated distinctive progression findings in the initial or final phases of the BA, without prognostic correlation. Morphometrical assessment of perisinusoidal deposition of type I collagen by IF in the initial biopsies can be correlated with progression time until LTx in patients with post-surgical BA