Depuis quelques années on assiste au développement de nouveaux bio-catalyseurs qui sont des hybrides combinant les avantages de la catalyse organométallique (système robustes, efficaces, mais couteux) à ceux de la catalyse enzymatique (écologique, spécifique mais peu flexible). Parmi les différentes stratégies mises en œuvre pour créer des enzymes artificielles, aucune d'elles n'a jusqu'à présent véritablement envisagé d'utiliser l'activité d'une enzyme et de la combiner à celle d'un composé organique. C'est la nouvelle approche proposée dans ce travail pour tenter d'orienter l'activité catalytique d'une oxydase à fort potentiel industriel, la laccase. Les produits d'oxydation de la laccase sont des radicaux phénoxyls qui se recombinent dans le milieu sans contrôle de l'enzyme. Chez certaines plantes, des petites protéines nommées « dirigent proteins » interagissent avec les radicaux phénoxyls pour conduire à la formation d'un seul produit optiquement pur. Dans ce travail, nous avons tenté de mimer ces « dirigent proteins » en greffant une molécule cage de type cyclodextrine à proximité du site actif de la laccase. Dans un premier temps, nous avons réalisé la synthèse de modules organiques dits « plateformes » possédants a) un point d'attachement à l'enzyme, b) un groupement pour la purification des protéines fonctionnalisées et c) une cyclodextrine qui permet d'encapsuler un grand nombre de molécules organiques. Par des mesures de fluorescences et d'immuno-détection, nous avons identifié les conditions optimales de fonctionnalisation pour la laccase et ainsi validé sa dérivatisation. / In recent years we are witnessing the development of new bio-catalysts which are hybrids combining the advantages of organometallic catalysis (robust and efficient system, but expensive) to those of enzymatic catalysis (ecological, specific but not very flexible). Among the various strategies used to create artificial enzymes, none of them has yet seriously considered to combine an enzyme activity with that of an organic compound. This is the new approach proposed in this work to try to orient the catalytic activity of the laccase, an oxidase with an industrial potential. The oxidation products of the laccase are phénoxy radicals which recombine in the medium regardless of the activity of the enzyme. In some plants, small proteins called "dirigent proteins" interact with phénoxy radicals leading to the formation of a single optically pure product. In this work, we tried to mimic the "dirigent proteins" by grafting a cyclodextrin-cage molecule near the active site of the laccase. As a first step, we performed the synthesis of organic modules called "platforms" with a) an anchor point to the enzyme, b) a group for functionalized protein purification c) a cyclodextrin that encapsulates a large number of organic molecules. By fluorescence and immunodetection measurements, we identified the optimal conditions for laccase functionalization and thus validated its derivatization. Monitoring the oxidation of coniferyl alcohol by the functionalized laccase with a cyclodextrined platform highlights a change in the kinetic profiles of the substrate and products. This difference appears due to the location of the cyclodextrin near the substrate oxidation site.

Une attention croissante est portée aux cascades multi enzymatiques pour l’élaboration de procédés de synthèse plus efficaces. Cependant, le contrôle de l’expression hétérologue de plusieurs gènes dans un même hôte s’avère difficile et peut mener à un déséquilibre du flux réactionnel. Pour exploiter au mieux les avantages d’une cascade in vivo, il est nécessaire d’ajuster les activités de chaque étape, et de construire des catalyseurs cellulaires capables de programmer la stœchiométrie des enzymes. Nous avons développé dans ce projet une approche originale pour moduler le ratio de deux enzymes in cellulo en jouant sur le nombre de copies de plasmides par cellule (PCN). Nous avons choisi comme modèle un système autosuffisant associant une Alcool Déshydrogénase (ADH) et une Baeyer-Villiger MonoOxygenase (BVMO), NADP(H)-dépendantes. Plusieurs plasmides recombinants portant les deux gènes ont été conçus et combinés dans E. coli. Les souches de co-expression construites ont été comparées en termes de PCN, de production d’enzymes et d’activité. Nous avons montré l’importance d’un choix judicieux de la combinaison de plasmides ainsi que l’existence d’une corrélation entre ratios d’enzymes et activité. Nos biocatalyseurs s’étendent sur une gamme allant du système inactif à un système affichant un TTN d’environ 6000. Ce système a permis la synthèse de lactones d’intérêt industriel, la dihydrocoumarine et la caprolactone, à partir d’indanol et de cyclohexanol. Enfin, sur ce modèle de combinaison de plasmides, trois nouveaux biocatalyseurs cellulaires, associant l’ADH à diverses BVMOs, ont été créés afin d’élargir la gamme d’esters et de lactones synthétisables à partir d’alcools. / Growing attention is paid to multienzymatic cascades to develop more efficient synthetic processes. However, in in cellulo process, the control of the simultaneous heterologous expression of several genes in the same host is often difficult and can lead to imbalances in the reaction flow. To exploit the benefits of cascades, activities of each step have to be adjusted and thus, cellular biocatalysts capable of programming enzymes stoichiometry have to be constructed. In this work, to modulate the stoichiometry of two enzymes in vivo, we developed an original approach based on the copy number per cell of plasmids (PCN) used as vectors. The PCN is regulated in bacteria by three main mechanisms leading, according to the replicon, to low, medium or high PCN. As proof of concept, we chose a self-sufficient system combining an Alcohol Dehydrogenase (ADH) and a Baeyer-Villiger MonoOxygenase (BVMO), both NADP(H)-dependent. Several recombinant plasmids harboring both genes were designed and combined in E. coli. Coexpression strains constructed were compared in terms of PCN, enzyme production and activity. We showed the importance of a judicious choice of plasmids combination and the existence of a correlation between enzymes ratios and activity. Our biocatalysts ranged from an inactive system to a system with a TTN of about 6000. This system allowed the synthesis of lactones of industrial interest, dihydrocoumarin and caprolactone, via double oxidation of indanol and cyclohexanol. Finally, based on this plasmids combination model, three new cellular biocatalysts combining ADH with various BVMOs were designed to broaden the range of esters and lactones synthesizable from alcohols.