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Elaboration de biocatalyseurs artificiels à deux composantes

Npetgat Ngoutane, Eloïne Arlette 13 December 2012 (has links)
Depuis quelques années on assiste au développement de nouveaux bio-catalyseurs qui sont des hybrides combinant les avantages de la catalyse organométallique (système robustes, efficaces, mais couteux) à ceux de la catalyse enzymatique (écologique, spécifique mais peu flexible). Parmi les différentes stratégies mises en œuvre pour créer des enzymes artificielles, aucune d'elles n'a jusqu'à présent véritablement envisagé d'utiliser l'activité d'une enzyme et de la combiner à celle d'un composé organique. C'est la nouvelle approche proposée dans ce travail pour tenter d'orienter l'activité catalytique d'une oxydase à fort potentiel industriel, la laccase. Les produits d'oxydation de la laccase sont des radicaux phénoxyls qui se recombinent dans le milieu sans contrôle de l'enzyme. Chez certaines plantes, des petites protéines nommées « dirigent proteins » interagissent avec les radicaux phénoxyls pour conduire à la formation d'un seul produit optiquement pur. Dans ce travail, nous avons tenté de mimer ces « dirigent proteins » en greffant une molécule cage de type cyclodextrine à proximité du site actif de la laccase. Dans un premier temps, nous avons réalisé la synthèse de modules organiques dits « plateformes » possédants a) un point d'attachement à l'enzyme, b) un groupement pour la purification des protéines fonctionnalisées et c) une cyclodextrine qui permet d'encapsuler un grand nombre de molécules organiques. Par des mesures de fluorescences et d'immuno-détection, nous avons identifié les conditions optimales de fonctionnalisation pour la laccase et ainsi validé sa dérivatisation. / In recent years we are witnessing the development of new bio-catalysts which are hybrids combining the advantages of organometallic catalysis (robust and efficient system, but expensive) to those of enzymatic catalysis (ecological, specific but not very flexible). Among the various strategies used to create artificial enzymes, none of them has yet seriously considered to combine an enzyme activity with that of an organic compound. This is the new approach proposed in this work to try to orient the catalytic activity of the laccase, an oxidase with an industrial potential. The oxidation products of the laccase are phénoxy radicals which recombine in the medium regardless of the activity of the enzyme. In some plants, small proteins called "dirigent proteins" interact with phénoxy radicals leading to the formation of a single optically pure product. In this work, we tried to mimic the "dirigent proteins" by grafting a cyclodextrin-cage molecule near the active site of the laccase. As a first step, we performed the synthesis of organic modules called "platforms" with a) an anchor point to the enzyme, b) a group for functionalized protein purification c) a cyclodextrin that encapsulates a large number of organic molecules. By fluorescence and immunodetection measurements, we identified the optimal conditions for laccase functionalization and thus validated its derivatization. Monitoring the oxidation of coniferyl alcohol by the functionalized laccase with a cyclodextrined platform highlights a change in the kinetic profiles of the substrate and products. This difference appears due to the location of the cyclodextrin near the substrate oxidation site.
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L'intrigant couplage radicalaire stéréosélectif médié par la protéine dirigeante AtDIR6 / A stereoselective radical coupling mediated by the dirigent protein AtDIR6

Modolo, Camille 20 December 2017 (has links)
Dans la famille des protéines dirigeantes, AtDIR6, oriente le couplage de radicaux phénoxyles afin de former un lignane optiquement pur : le (-)-pinorésinol. Comme de nombreux lignanes, le pinorésinol est un produit d’intérêt avec des propriétés anti-cancéreuse et anti-fongique. Avec pour objectif à long terme de mettre au point de nouveaux biocatalyseurs énantiosélectifs, nous nous sommes intéressés au mécanisme d’action d’AtDIR6.Dans un premier temps, la production d’AtDIR6 et les conditions de bioconversion ont été optimisées. L’effet dose-dépendant de la protéine sur la formation du (-)-pinorésinol a été confirmé. Les études spectroscopiques entreprises afin de préciser la nature du « substrat » pris en charge par AtDIR6 ont permis de confirmer que l’alcool coniférylique est un mauvais substrat. De plus, par RPE nous avons pu mettre en évidence pour la première fois qu’AtDIR6 augmente la durée de vie de la forme radicalaire de l’AC. Par ailleurs, le greffage covalent d’une sonde radicalaire sur AtDIR6 nous a permis de marquer une tyrosine localisée dans la cavité. Avec AtDIR6 marquée la régiosélectivité de la réaction est affectée. Par ailleurs, la reconnaissance de molécules substrats par AtDIR6 semble être naturellement limitée à un motif 2-methoxy-phénol. Nous montrons pour la première fois que le motif propényle peut être modifié comme en témoigne les produits de bioconversion de l’acétate d’AC pour lesquels une régiosélectivité dépendante de la présence d’AtDIR6 est observée. L’ensemble de nos résultats ouvre des perspectives dans l’utilisation de protéines dirigeantes pour la formation contrôlée de nouveaux produits de couplage. / The family of the leading proteins gathers proteins widely spread within the plant world. In this family, AtDIR6, one of the first characterized proteins, directs the coupling of phenoxyl radicals to form an optically pure lignan: the (-)-pinoresinol. Like many lignans, pinoresinol is a product of interest with anti-cancer and anti-fungal properties. With the long-term goal of developing new enantioselective biocatalysts, we are interested in the mechanism of action of AtDIR6.At first, AtDIR6 production and bioconversion conditions were optimized. The dose-dependent effect of the protein on (-)-pinoresinol formation was confirmed. Spectroscopic studies undertaken to clarify the nature of the "substrate" accommodated by AtDIR6 have confirmed that coniferyl alcohol is a poor substrate. Furthermore, by EPR we have been able to highlight for the first time that AtDIR6 increases the life of the radical form of coniferyl alcohol. Moreover, the covalent grafting of a radical probe on AtDIR6 allowed us to tag a tyrosine located in the cavity. With the tagged protein the regioselectivity of the reaction is affected. On the other hand, the recognition of substrate molecules by AtDIR6 seems to be naturally limited to AC or its radical, apparently recognized because of the 2-methoxyphenol motif. We show for the first time that the propenyl unit can be modified as evidenced by the bioconversion products of AC acetate for which a regioselectivity dependent on the presence of AtDIR6 is observed. All of our results open up prospects for the use of dirigent proteins for the controlled formation of new coupling products.

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