Le lin cultivé (Linum usitatissimum L.) est l’une des principales sources de lignanes, faisant de cette plante un modèle d’étude de cette voie du métabolisme spécialisé. Les principaux lignanes de lin dérivent de composés optiquement actifs, en particuliers les stéréoisomères du sécoisolaricirésinol qui sont synthétisés à partir de pinorésinol via laricirésinol. Les principales enzymes impliquées dans la synthèse de ces stéréoisomères sont deux isoformes de pinorésinol-laricirésinol réductases (PLR) déjà caractérisées et possédant des énantiospécificitées opposées. Néanmoins l'action de ces deux réductases bifonctionnelles ne permet pas d'expliquer les profils d'accumulation complexes notamment de laricirésinol et ses dérivés observés dans les graines, tiges et suspensions cellulaires de lin. Afin de mieux comprendre les mécanismes mis en oeuvre menant à ces profils d’accumulation de lignanes chez cette plante, la recherche de nouvelles PLRs a révélé l’existence de deux nouvelles isoformes. L’analyse de l'expression des gènes ainsi que l'activité enzymatique in vitro de ces deux nouvelles PLR putatives, LuPLR3 et LuPLR4 ont été élucidées. LuPLR4, in vitro, présente une activité réductase uniquement du pinorésinol. Ce type d’activité est ici décrit pour la première fois en dehors de la famille Brassicées et permet d’expliquer en partie les profils d’accumulation complexes observés chez le lin. De par leurs propriétés biocides, les lignanes sont suspectés jouer un rôle dans les mécanismes de défense des plantes. Dans le cadre de ce travail, suite à une élicitation fongique à l’aide d’extraits de Fusarium oxysporum spp. linii, un agent pathogène commun du lin, l’analyse de l’expression des différents gènes codant les isoformes de PLRs a révélées une induction globale et coordonnée. En particulier, dans le cas de l’isoforme LuPLR1, des délétions et mutations dans la région promotrice de son gène ont permis de mettre en évidence une région impliquée dans la régulation de la réponse à l’élicitation par F. oxysporum. Cette région contient plusieurs boîtes W, sites de liaison putatifs pour des facteurs de transcription de type WRKY. Les facteurs de transcription WRKY jouent un rôle dans les réponses aux stress biotique et abiotique. Un facteur de transcription candidat LuWRKY36 a été isolé à partir de suspensions cellulaires traitées avec des éliciteurs de F. oxysporum ou de l'acide abscissique. En particulier, les expériences de gel-retard et DPI-ELISA ont montré la capacité de liaison de LuWRKY36 à la boîte W3 présente du promoteur du gène LuPLR1. Cette régulation a ensuite été confirmée in vivo. Nous rapportons également l'impact différentiel de l'élicitation par des extraits de F. oxysporum sur l’expression des gènes LuWRKY36 et LuPLR1 ainsi que la production de sécoisolaricirésinol dans les variétés de lin sensible (Barbara) et résistante (Baïkal) à la fusariose. Enfin, la pleine exploitation des nombreux effets bénéfiques (en santé humaine ou cosmétique notamment) du sécoisolaricirésinol et des autres composés phénoliques accumulés dans les graines de lin nécessitent la mise au point de procédés d’extraction “verts”, efficaces voir sélectifs. Nous rapportons ici que l’utilisation de solvants eutectiques de type NADES (Natural Deep Eutectic Solvent) qui couplée à une extraction assistée par ultrasons, dans le cadre d’un procédé de type cracking, utilisant comme matériel de départ un coproduit d’extraction de l’huile de lin produit de manière innovante, permet d’obtenir des rendements d’extraction élevés et sélectifs de ces différents composés d’intérêt dans le cadre d’une démarche d’éco-extraction. / L. usitatissimum is one of the richest sources of lignans. Main flax lignan is optically active secoisolariciresinol that is synthesized from pinoresinol via lariciresinol. Key enzymes involved in the synthesis of this lignans are two isoforms of pinoresinol-lariciresinol reductases with opposite enantiospecificity. The action of bifunctional reductase does not allow for an explanation for the accumulation of lariciresinol and its derivates in seeds, stem and cell suspension. To try and better understand complex lignan profile we report expression and activity of two new putative PLRs, LuPLR3 and LuPLR4. LuPLR4 in vitro acts only as pinoresinol reductase what has only been seen in Brassicaceae family until now. Lignans play a role in plant defense. All PLRs are upregulated following Fusarium oxysporum attack, a common flax pathogen. Promoter deletions and mutation evidenced region involved in regulation of LuPLR1 gene response to Fusarium. The region contains several W boxes, putative binding sites for WRKY transcription factors. WRKY transcription factors play a role in response to biotic and abiotic stress. We have isolated LuWRKY36 from two cell suspension treated with Fusarium oxysporum or abscisic acid. Gel-shift assay and DPI-ELISA showed binding of LuWRKY36 to W box present in the LuPLR1 gene promoter. This regulation was also confirmed in vivo. We also report the differential impact of F. oxysporum elicitation on LuWRKY36 and LuPLR1 gene expression and secoisolariciresinol production in flax cultivars Barbara (Fusarium sensitive) and Baikal (Fusarium tolerant). Many beneficial effects of secoisolariciresinol and other phenolic compounds found in flax require “green” extraction and sometimes targeted purification of a specific compound. We report here that natural deep eutectic solvents using ultrasound assisted extraction can extract phenolic compounds from flax seed coat and that results indicate that by tuning different parameters of extraction we can target purification of desired plant product.

Dans la famille des protéines dirigeantes, AtDIR6, oriente le couplage de radicaux phénoxyles afin de former un lignane optiquement pur : le (-)-pinorésinol. Comme de nombreux lignanes, le pinorésinol est un produit d’intérêt avec des propriétés anti-cancéreuse et anti-fongique. Avec pour objectif à long terme de mettre au point de nouveaux biocatalyseurs énantiosélectifs, nous nous sommes intéressés au mécanisme d’action d’AtDIR6.Dans un premier temps, la production d’AtDIR6 et les conditions de bioconversion ont été optimisées. L’effet dose-dépendant de la protéine sur la formation du (-)-pinorésinol a été confirmé. Les études spectroscopiques entreprises afin de préciser la nature du « substrat » pris en charge par AtDIR6 ont permis de confirmer que l’alcool coniférylique est un mauvais substrat. De plus, par RPE nous avons pu mettre en évidence pour la première fois qu’AtDIR6 augmente la durée de vie de la forme radicalaire de l’AC. Par ailleurs, le greffage covalent d’une sonde radicalaire sur AtDIR6 nous a permis de marquer une tyrosine localisée dans la cavité. Avec AtDIR6 marquée la régiosélectivité de la réaction est affectée. Par ailleurs, la reconnaissance de molécules substrats par AtDIR6 semble être naturellement limitée à un motif 2-methoxy-phénol. Nous montrons pour la première fois que le motif propényle peut être modifié comme en témoigne les produits de bioconversion de l’acétate d’AC pour lesquels une régiosélectivité dépendante de la présence d’AtDIR6 est observée. L’ensemble de nos résultats ouvre des perspectives dans l’utilisation de protéines dirigeantes pour la formation contrôlée de nouveaux produits de couplage. / The family of the leading proteins gathers proteins widely spread within the plant world. In this family, AtDIR6, one of the first characterized proteins, directs the coupling of phenoxyl radicals to form an optically pure lignan: the (-)-pinoresinol. Like many lignans, pinoresinol is a product of interest with anti-cancer and anti-fungal properties. With the long-term goal of developing new enantioselective biocatalysts, we are interested in the mechanism of action of AtDIR6.At first, AtDIR6 production and bioconversion conditions were optimized. The dose-dependent effect of the protein on (-)-pinoresinol formation was confirmed. Spectroscopic studies undertaken to clarify the nature of the "substrate" accommodated by AtDIR6 have confirmed that coniferyl alcohol is a poor substrate. Furthermore, by EPR we have been able to highlight for the first time that AtDIR6 increases the life of the radical form of coniferyl alcohol. Moreover, the covalent grafting of a radical probe on AtDIR6 allowed us to tag a tyrosine located in the cavity. With the tagged protein the regioselectivity of the reaction is affected. On the other hand, the recognition of substrate molecules by AtDIR6 seems to be naturally limited to AC or its radical, apparently recognized because of the 2-methoxyphenol motif. We show for the first time that the propenyl unit can be modified as evidenced by the bioconversion products of AC acetate for which a regioselectivity dependent on the presence of AtDIR6 is observed. All of our results open up prospects for the use of dirigent proteins for the controlled formation of new coupling products.

Doctor of Philosophy / Department of Human Nutrition / Weiqun Wang / Wheat lignans are phenylpropane dimers linked by β-β bonds with a 1, 4-diarylbutane structure. They are biosynthesized in the cell cytoplasm through action of enzymes of the phenylpropanoid pathway. Pinoresinol lariciresinol reductase (PLR) catalyzes the final steps of biosynthesis of wheat lignans. In epidemiological and clinical investigations, studies show that high plasma lignan amounts correlate with reduced risks of breast, colon, and prostate cancers. However, in some of the studies, the results are not consistent. More consistent results are observed when animal and cell culture models are used. Our previous studies in the Wang lab demonstrated that treatment of human colon cancer cells, SW480 with lignans results in a dose and time dependent inhibition of cancer cell growth. In the first paper, we investigated direct experimental cancer preventative characteristics of a wheat lignan, secoisolariciresinol diglucoside (SDG) vs. its metabolite enterolactone in human colon cancer SW480 cells. Treatment of cancer cells with 0-40 µM SDG or enterolactone resulted into inhibition of cancer cell growth as observed by reduction of cell numbers. The reduction appeared related to induction of S-phase cell cycle arrest rather than cytotoxic effect. Further analysis revealed that SDG was more stable in cell culture medium than enterolactone. HPLC-MS/ESI showed that enterolactone is the principle metabolite in cancer cells but undetectable SDG or its metabolites were in the cells treated with SDG. In the second paper, we investigated over expression of the PLR gene and enhancement of lignan levels in transgenic wheat. We transformed wheat cultivars (‘Bobwhite’, ‘Madison’, and ‘Fielder’ respectively) with the Forsythia intermedia PLR gene under the regulatory control of the maize ubiquitin promoter. Of the total 217 transgenic wheat lines, we successfully obtained 7 transformants with the inserted ubiquitin PLR gene as screened by PCR. Real-time PCR further indicated 109-117% PLR over expression over the transgenic control in 3 transformants of the 7 at T0 generation. In addition, the levels of SDG, as determined by HPLC was found to be significantly elevated in one of the 3 positive transgenic plants. To the best of our knowledge, this is the first study reported that genetically engineered wheat with over expressed PLR enzyme enhancing phytochemical lignan has been successfully achieved.

Plante de grande culture aux multiples applications, le lin accumule dans ses graines des métabolites spécialisés appelés lignanes aux propriétés phytooestrogène et antioxydante, bénéfiques en santé humaine et, dans ses feuilles, des lignanes de nature toxique. Pour l’utilisation et l’étude de ces composés phénoliques issus de la voie des monolignols, une technique d’éco-extraction assistée par les ultrasons a été développée et appliquée à un criblage de différentes variétés pour leur contenu en lignanes conférant une haute valeur ajoutée aux extraits et produits. Les potentiels verrous métaboliques de la voie de biosynthèse de ces composés ont fait l’objet d’investigations au niveau de la régulation transcriptionnelle des gènes responsables de la formation des énantiomères opposés de sécoisolaricirésinol dans la graine et les parties aériennes. La famille multigénique des protéines dirigeantes (DIR) du lin, premiers acteurs de cette voie, a été criblée au niveau génomique et transcriptionnel afin de déterminer des candidates pour fonctionner avec les pinorésinol laricirésinol réductases (PLR), enzymes bifonctionnelles catalysant la formation du sécoisolaricirésinol. L’étude de la régulation fine de l’expression des deux isoformes des gènes PLR a mis en évidence des profils d’inductibilité très contrastés et a conduit à l’identification d’éléments cis-régulateurs ainsi que de facteurs de transcription impliqués dans ces voies de régulation. L’ensemble des résultats convergent vers un rôle de défense des lignanes in planta et a permis de construire une vue d’ensemble des mécanismes complexes de régulation de leur biosynthèse et enfin de proposer des pistes pour l’amélioration de la production de ces molécules naturelles par une stimulation de leur accumulation et l’augmentation des rendements d’extraction par chimie verte. / As a crop with multiple purposes, flax accumulates lignans, specialized metabolites with health benefits, known for their phytoestrogenic and antioxidant properties in its seed, and toxic lignans in its leaves. In order to use and study these phenolic compounds derived from monolignols, an eco-friendly method based on ultrasound-assisted extraction was developed and applied to the screening of cultivars for their lignan content which confers high value to extracts and flaxseed by-product. Regulation of the lignan biosynthetic pathway was investigated at the transcriptional level for the genes responsible for the formation of secoisolariciresinol in seeds and aerial parts. The multigene family of dirigent proteins (DIR), first actors of this pathway, was explored by genomic and transcriptional approaches in order to select candidates to operate with pinoresinol lariciresinol reductases (PLR), bifunctional enzymes catalyzing secoisolariciresinol biosynthesis. The study of the transcriptional regulation of PLR genes evidenced very contrasting expression profiles and led to the identification of transcription factors acting as master regulators of this biosynthesis and their cis-regulatory target elements. Results allowed first to reinforce the hypothesis of the lignans defensive role in planta, second to afford an overall view of complex mechanisms occurring in the regulation of lignan natural production and finally to suggest leads to improve lignan yield by a stimulation of natural production and an enhancement of extraction yield using green chemistry methods.