Los tensioactivos son unos compuestos químicos que debido a sus propiedades fisicoquímicas pueden provocar irritación. Por tanto, es interesante desarrollar nuevos compuestos que sean más biocompatibles que los tensioactivos comerciales que se utilizan actualmente. Por otro lado, los ensayos de Draize, basados en la utilización de animales, son los únicos métodos aceptados oficialmente para valorar la irritación antes de la comercialización de nuevos compuestos. No obstante, por motivos éticos y científicos existe la necesidad de disponer de métodos que permitan remplazar los animales de experimentación en esos ensayos toxicológicos. Por ese motivo, se ha estudiado el potencial efecto irritante ocular y dérmico de nuevos tensioactivos derivados de aminoácidos utilizando distintos métodos alternativos a la experimentación animal. Para valorar la irritación ocular se ha utilizado, en primer lugar, el ensayo de hemólisis basado en un modelo celular. Según este ensayo, los lipoaminoácidos son menos irritantes oculares que los tensioactivos comerciales utilizados como referencia. También se ha valorado la irritación ocular mediante los ensayos HET-CAM y CAM-TBS que se basan en un modelo organotípico, la membrana corioalantoidea del huevo de gallina. A efectos comparativos también se realizó el ensayo de Draize ocular con algunos de los compuestos. Los resultados del ensayo in vivo han revelado que la membrana corioalantoidea del huevo de gallina es un modelo demasiado sensible a los tensioactivos por lo que se descarta su utilización para valorar ese tipo de compuestos. Para valorar la irritación dérmica se ha utilizado el cultivo en monocapa de líneas celulares y se han analizado diversos marcadores de irritación. En primer lugar, se valoró la citotoxicidad inducida por los compuestos mediante dos ensayos (NRU y MTT) y se calcularon las concentraciones de tensioactivo que inhibían un 50 % la viabilidad celular (CI50). A partir de esos resultados, se ha propuesto un modelo de predicción en la línea de fibroblastos 3T3: compuestos con una CI50 inferior a 50 µg/ml presentan un potencial irritante elevado, compuestos con una CI50 entre 50 y 100 µg/ml son irritantes moderados, y compuestos con una CI50 superior a 100 µg/ml presentan un potencial irritante bajo. También, se ha estudiado la producción de interleucina 1 alfa, un mediador proinflamatorio, en la línea de queratinocitos NCTC 2544. Según los resultados, los lipoaminoácidos tienen una menor capacidad para inducir la neosíntesis de la citocina que los tensioactivos comerciales, por tanto, presentan una menor capacidad para desencadenar una respuesta inflamatoria. Por último, se ha analizado la acumulación de lípidos neutros intracelulares como posible marcador de irritación dado que desempeñan un papel muy importante en la reparación de la membrana celular cuando esta sufre algún tipo de agresión. Se ha estudiado en la línea celular NCTC 2544 tras el tratamiento con los diferentes tensioactivos. Para la detección de los lípidos neutros se utilizó el colorante rojo de nilo que es específico de lípidos neutros y se realizó el análisis mediante citofluorometría y microscopia de fluorescencia. Los tensioactivos indujeron incrementos de fluorescencia con un perfil concentración dependiente. Además, los incrementos de fluorescencia se detectaron antes de observar incrementos en la actividad lactato deshidrogenasa en el medio de cultivo, un marcador de daños sobre la membrana. Ese hecho implica que la acumulación de lípidos neutros es un marcador que indica daños sobre la membrana previo a la muerte celular. Finalmente, a efectos comparativos también se ha realizado el ensayo de Draize dérmico con algunos de los compuestos. Según este ensayo los lipoaminoácidos se clasificaron como ligeramente irritantes. Además, los resultados revelaron que los ensayos in vitro son más sensibles y permiten detectar pequeñas diferencias en el potencial irritante de los compuestos, sobretodo cuando se trata de compuestos con un potencial irritante ligero y moderado. / Surfactants are among the most versatile and frequently used excipients in cosmetic and pharmaceutical products. However, the application of pharmaceutical or cosmetic preparations containing these compounds may result in eye and skin irritation. Therefore, it is of great interest to identify surfactants with low irritant properties and it is also necessary to have rapid assays to assess potentially damaging effects. The evaluation of the irritant potential of chemicals in vivo is traditionally conducted on rabbits using the Draize test method. However, due to increasing concern over animal use and in lights of its potential ban in the near future, in vitro alternative methods should now be encouraged. The purpose of this work was to evaluate the potential eye or skin irritation of new amino acid-based surfactants using different in vitro assays. For predicting eye irritation the red blood cell test was used. According to the results of this assay, the new surfactants were less toxic than the commercial surfactants employed as a reference. Two methods based on the chorioallantoic membrane were also used. The results showed that these methods are oversensitive to this class of compounds, therefore, their utilization for predicting the eye irritation potential of surfactants is not recommended. For predicting skin irritation, different cell lines (fibroblasts 3T3 and 3T6, keratinocytes NCTC 2544 and HaCaT) were employed taking into account different endpoints, such as cell viability, IL-1alpha production and lipid droplet accumulation. Cell viability was measured using two different assays (NRU and MTT) and we proposed a prediction model taking into account the IC50 values. The release and production of the cytokine IL-1alpha was measured in the NCTC 2544 cell line. The results revealed that new surfactants are less potent than the commercial surfactants to stimulate the synthesis of the cytokine. Lipid droplet accumulation was also studied in the NCTC 2544 cell line. After the surfactant exposure, cells were treated with Nile Red. The results of the fluorescence measurements showed a concentration dependent profile for all the compounds. Furthermore, fluorescence increases were detected before significant lactate deshidrogenase release into the culture medium was observed. Accordingly, the accumulation of lipid droplets could be used to detect membrane injuries prior to cell death.

Actualment, es pot considerar que vivim a l'era dels plàstics. En els últims 50 anys els plàstics d'origen petroquímic han esdevingut un dels materials més emprats. La seva versatilitat, propietats tècniques i un cost relativament baix (0,70$US per Kg) són alguns dels factors que han influït en la proliferació del seu ús. Fins al moment han estat descrites moltes i molt diverses aplicacions per aquest material (Zinn et al., 2001).El principal desavantatge dels plàstics convencionals és la seva baixa biodegradabilitat. Els residus plàstics no són biodegradables i els costos dels processos de reciclatge són molt elevats (Yu et al., 1998). D'altra banda, la disponibilitat, l'accessibilitat i l'explotació de les fonts de carboni d'origen fòssil són cada vegada més limitades. El fet que sigui una font d'energia no renovable, conjuntament amb l'augment del seu cost ha fet necessari buscar altres fonts d'energia alternatives, per la qual cosa l'aplicació de processos biotecnològics ha despertat gran interès pel seu potencial.Per aquest motiu, al començament dels anys 80s, es començaren a realitzar diferents aproximacions en el desenvolupament i en la producció de plàstics biodegradables com per exemple: la cel·lulosa, el midó, la quitina, la poliamida, l'àcid polilàctic (PLA) i els polihidroxialcanoats (PHAs), ja que són considerats com una alternativa als "petroplàstics".Els Polihidroxialcanoats (PHAs) són polièsters biològics sintetitzats per nombrosos microorganismes i acumulats intracel·lularment en forma de grànuls com a reservori d'energia i de font de carboni. Aquest fenomen, sovint, està associat a un excés de la font de carboni i a la limitació d'algun altre nutrient (p.e: el nitrogen, el fòsfor, etc.). Els PHAs són materials biodegradables, biocompatibles i totalment estereoespecífics (tots els estereocentres tenen configuració [R]). Aquests biopolímers presenten propietats mecàniques semblants a alguns termoplàstics sintètics (p.e. el polipropilè), per altra banda el fet de ser materials biocompatibles fa que siguin bons canditats en el camp de la biomedicina. D'altra banda els PHAs tenen una gran versatilitat en termes de composició, de tal manera que es poden obtenir mcl-PHAs funcionalitzats susceptibles de ser modificats químicament a posteriori per tal de modular les propietats del polímer original.Els objectius d'aquesta tesi són:1. L'obtenció de nous polihidroxialcanoats (PHAs) funcionalitzats a partir de cultius de Pseudomonas aeruginosa 42A2 emprant com a substrats fonts de carboni definides i olis vegetals.2. La determinació estructural, caracterització físico-química i l'estudi microscòpic dels polièsters obtinguts.3. La derivatització dels PHAs funcionalitzats.En el present treball s'ha demostrat que Pseudomonas aeruginosa 42A2 es capaç de créixer i acumular PHA a partir dels següents substrats: àcid nonanoic, àcid undecanoic, àcid undecenoic, extracte monodi, àcid linoleic i oli de llinosa. Tots els PHAs obtinguts han estat caracteritzats mitjançant RMN, CG-EM i FTIR, de la mateixa manera també s'han analitzat les propietats tèrmiques (DSC i TGA) i s'han determinat els pesos moleculars (GPC). Quan s'utilitza l'oli de llinosa com substrat s'obté un PHA altament funcionalitzat que conté un 16% d'unitats monomèriques poliinsaturades (8,3% de C14:3 i 7,6% de (C14:2+C12:2). Aquest polímer funcionalitzat s'ha derivatitzat mitjançant tractament fotoquímic amb radiació UV per tal d'induir l'entrecreuament de les cadenes laterals poliinsaturades i generant així un nou polímer.Els canvis estructurals deguts a la reacció d'entrecreuament han estat seguits mitjançant diverses tècniques analítiques (RMN, FTIR, CG-EM, DSC i TGA). En aquest treball, també es presenta un estudi tant del bacteri com del PHA com a biomaterial emprant diverses tècniques microscòpiques (TEM i AFM), essent la primera vegada que es recullen imatges d'un polihidroxialcanoat reticulat.Paral·lelament, es va realitzar l'escalat a bioreactor dels cultius amb àcid undecanoic i àcid undecenoic, com a co-substrats. En els diferents experiments realitzats en bioreactor s'han obtingut polímers amb diferent contingut de monòmers insaturats (15-70%), indicant així que, el règim d'alimentació continu en els cultius en bioreactor permet modular la composició del polímer i augmentar el percentatge d'acumulació de PHA fins a un 50% en front del 20% que s'obtenia en els cultius amb matrassos. / Nowadays one may consider that we are living in the age of the plastics. The global dependence on petroleum-derived plastics has increased over the last 50 years. However the rapid depletion of crude oil, the increasing problems with the biodegradation of these plastics and the environmental effects has prompted much interest in biologically derived polymers, particularly of the biodegradable class, produced by biotechnological processes. Among the different types of biodegradable polymers, a class that is drawing considerable attention is the polyhydroxyalkanoates (PHAs). Polyhydroxyalkanoates are optically active biopolyesters synthesized by a large number of microorganisms using a wide range of substrates such as fatty acids, sugars, oily wastes, etc. These polymers exhibit thermoplastic and elastomeric properties, depending on their composition. Moreover their high biocompatibility allows these polymers to be good candidates for medical applications.This doctoral thesis deals in a first part with the biosynthetic production and characterization of functionalized PHA, using defined substrates (nonanoic, undecanoic and undecenoic acid) and blends of fatty acids (linoleic acid (60%), linseed oil and an extract of hydroxylated fatty acids) as well as the undecanoic and undenoic acid has been used as a cosubstrates to obtained a block copolymer. The scale up to a 10L bioreactor of this process allows to improve the yield of PHA-accumulation reaching up to 50% versus the 20% obtained in the flasks experiments. Furthermore, the continuous feeding strategy let us to improve and to modulated the final composition of the biopolymers. Several experiments have been carried out rendering in polymers with different content of unsaturated monomers (15-70%). In the second part of this work, the functionalized PHA obtained from linseed oil, which contain up to 16% of polyunsaturated monomers (8,3% C14:3 i 7,6% (C14:2+C12:2), were modified by UV-irradiation to enhance the crosslinking reaction among the polyunsaturated side chains, in order to obtain a novel polymer with new and improved properties. The structural modifications as well as the thermal properties have been followed during the reaction by various analytical techniques (NMR, FTIR, GC, GC-MS, HPLC-MS, GPC, DSC and TGA). Besides the analytical techniques used for the characterization of these biopolymers, in this work is also showed a study of the bacterial cells as well as the PHA as a biomaterial using microscopical techniques (TEM and AFM), being the first time that a crosslinked PHA micrograph is acquired.

Los cementos de fosfato de calcio son biomateriales utilizados para la regeneración ósea. En esta tesis doctoral se estudia la influencia de la microestructura y la macroporosidad en el comportamiento biológico de un cemento de fosfato de calcio. En la primera parte, se caracterizaron las propiedades físico-químicas y superficiales de dos sustratos de apatita deficiente en calcio con diferente microestructura obtenidos a partir de un cemento de fosfato de calcio (CPC) cuyo principalmente componente es el fosfato tricálcico en fase $\alpha$. % con dos distribuciones de tamaño de partícula distintos. Se estudió la influencia de la microestructura en el comportamiento celular y la adsorción de proteínas como la albúmina, la fibronectina y la lisozima. El uso de dos agentes desorción (EDTA y SDS) permitió evidenciar la influencia de la morfología y tamaño de los cristales de apatita en la fuerza de adhesión de las proteínas estudiadas. Los cultivos celulares con la línea MG-63 mostraron el efecto de la microestructura y el intercambio iónico sobre la proliferación celular. Se observó asimismo una estimulación en la diferenciación celular en uno de los sustratos que fue atribuido a un efecto de la topografía. En la segunda parte, se desarrolló un cemento macroporoso inyectable para aplicaciones médicas, utilizando como agente espumante una solución proteica de albumen. Se optimizó la obtención de la macroporosidad a partir de variables como: la distribución del tamaño de partícula, la relación entre la fase sólida y la fase líquida, la cantidad de agente espumante y la adición de un agente de cohesión como el alginato de sodio para posibilitar su inyección directa en el lugar de implantación. Por último, se demostró mediante estudios \emph{in vivo} en fémur de conejos un mayor potencial de regeneración ósea por parte del cemento macroporoso en comparación con su homólogo microporoso, al obtenerse una mayor cantidad de tejido óseo y una mayor reabsorción en el cemento macroporoso.