Orientador: Ana Claúdia Pavarina / Banca: Juliana Campos Junqueira / Banca: Claúdia Helena Lovato da Silva / Banca: Ewerton Garcia de Oliveira Mima / Banca: Eunice Teresinha Giampaolo / Resumo: A capacidade de aderência dos micro-organismos a diferentes superfícies, a resistência a medicamentos, bem como a interação entre as espécies visam garantir a sobrevivência e a proliferação dos mesmos, resultando em menor susceptibilidade dos patógenos aos tratamentos e aos procedimentos de desinfecção. Este estudo teve como objetivo avaliar in vitro a eficácia da Terapia Fotodinâmica (PDT) mediada pelos fotossensibilizadores (FSs) Photodithazine® (PDZ) e Curcumina (Cur) sobre biofilmes multi-espécies compostos por Streptococcus mutans, Candida albicans e Candida glabrata. Para isso, o estudo foi divido em três partes: 1- avaliação do efeito fotodinâmico das diferentes concentrações de PDZ (100, 150, 175, 200 e 250mg/L) associada à luz LED (660nm/ 37,5J/cm2) na inativação de biofilme multi-espécies formado em fundo de placa de 96 orifícios; 2- avaliação do efeito fotodinâmico quando realizadas uma e três aplicações sucessivas de PDT, mediada por PDZ (175 e 200mg/L) e luz LED (660nm/ 37,5J/cm2) na inativação de biofilmes multi-espécies, formado sobre corpos-de-prova de resina acrílica. 3- avaliação do efeito fotodinâmico de diferentes concentrações do FS Cur (80, 100 e 120μM) associada à luz LED (455nm/ 37,5J/cm2) sobre biofilmes multi-espécies cultivados por diferentes períodos (24 e 48h) sobre corpos-de-prova de resina acrílica. Adicionalmente para cada condição avaliada foi verificado o efeito da aplicação isolada de cada concentração dos FSs PDZ e Cur em contato com o biofilme na ausência de luz (P+L-) e o efeito isolado da luz (P-L+). Além disso, foi realizado o grupo controle positivo, no qual o biofilme não esteve em contato com o FS e não foram iluminados com luz LED (P-L-). Após a aplicação dos tratamentos propostos, a viabilidade dos micro-organismos foi avaliada por meio da contagem de colônias (UFC/mL), teste do XTT, determinação da... / Abstract: The ability of adhesion of microrganisms to different surfaces, the drug resistance, as well as the interaction among the species help to ensure the survival and proliferation of these microrganisms and result in lower susceptibility of these pathogens to treatment and disinfection procedures. This study aimed to evaluate the in vitro efficacy of PDT mediated by photosensitizers (FSs) Photodithazine ® (PDZ) and Curcumin (Cur) against multispecies biofilms formed by Candida albicans, Candida glabrata and Streptococcus mutans. This study was divided into three parts: 1. evaluation of the effect of photodynamic therapy of different concentrations of PDZ (100, 150, 175, 200 and 250mg / L) associated with the LED light (660 nm / 37.5 J/cm2) in the inactivation of multspecies biofilms formed in 96-well microtiter plates; 2. evaluation of the photodynamic effect of one PDT applications only and three successive PDT applications mediated by PDZ (175 and 200 mg / L) and LED light (660 nm / 37.5 J/cm2) in the inactivation of multispecies biofilms, formed on acrylic resin samples; 3. evaluation of the photodynamic effect of different concentrations of Cur FS (80, 100, and 120μM) associated with LED light (455nm / 37.5 J/cm2) against multispecies biofilms grown during different periods (24 and 48h) on acrylic resin samples. Additional samples were treated either with FSs (PDZ or Cur) (P+L-) or LED light (P-L+) only. Positive control samples had neither light nor FSs (PDZ or Cur) (P-L-). After applying the proposed treatments, the viability of microrganisms was assessed by Colony Count (CFU / mL), the XTT assay, determination of the total biomass (CV) and confocal laser scanning microscopy (CLSM).The results were analyzed using ANOVA or Kruskal-Wallis test followed by Tukey or Dunn, respectively. For the biofilm formed in 96-well plate, the concentrations of 175 and 200mg/L showed greater reduction in cell... / Doutor

Orientador: Denise Madalena Palomari Spolidorio / Banca: Cristiane Duque / Banca: Regina Maria Puppin-Rontani / Resumo: O óleo essencial de Melaleuca alternifolia (TTO) é um extrato de ação antifúngica e preventiva em escala farmacêutica ou cosmética. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia do TTO e Terpinen-4-ol sobre isolados clínicos de Candida albicans. Este estudo foi realizado em três fases: 1- Identificação da CIM (Concentração Inibitória Mínima) e CFM (Concentração Fungicida Mínima) do TTO (0,25 a 2%) e Terpinen-4- ol (0,11 a 0,95%) sobre C. albicans na forma planctônica. 2- Análise das diferentes concentrações do óleo sobre biofilme monoespécie de C. albicans por meio da contagem das UFC/mL e avaliação da atividade metabólica das células pelo método colorimétrico de XTT. 3- Análise da ação inibitória das soluções de TTO e Terpinen-4- ol sobre biofilmes de C.albicans (cepa padrão e isolados clínicos) formados em corpos de prova de resina acrílica termopolimerizável previamente cobertos com saliva humana, por meio do teste de XTT e por microscopia confocal de varredura à laser (MCVL). A nistatina (Sigma) foi utilizada como controle positivo. Os resultados mostraram que isolados de C. albicans planctônicos foram sensíveis ao TTO 1%, Terpinen-4-ol 0,47% e Nistatina 8 μg/mL. As menores concentrações fungicidas para os isolados foram TTO 2 %, Terpinen-4-ol 0,95 % e Nistatina 16 μg/mL. Quando analisado em biofilme através da quantificação (UFC/mL) e teste de XTT as concentrações de TTO 2 % e Terpinen-4-ol 0,95 % foram eficazes quando comparado ao controle, sendo que as amostras da genotipagem A2 e B1 foram as mais resistentes. Os resultados de MCVL mostraram que todos os biofilmes desenvolvidos em corpos de resina acrílica apresentaram-se semelhantes à ação da Nistatina. Os extratos avaliados apresentaram ação antifúngica para os isolados clínicos e podem ser considerados tratamento alternativo para paciente com candidíase. / Abstract: The essential oil of Melaleuca alternifolia (TTO) is an extract of antifungal action and preventive in pharmaceutical or cosmetic scale. The aim of this study was to evaluate the efficacy of TTO and Terpinen-4-ol against clinical isolates of Candida albicans. This study was conducted in three phases: 1- Identification of MIC (Minimum Inhibitory Concentration) and CFM (Minimum Fungicidal Concentration) of TTO (0.25 to 2%) and Terpinen-4-ol (0.11 to 0.95 %) on C. albicans in planktonic form . 2- Analysis of different concentrations of oil on C. albicans biofilm single species by counting CFU/mL and evaluation of the metabolic activity of cells by XTT colorimetric method. 3- Analysis of the inhibitory action of TTO and Terpinen-4-ol solutions on C. albicans biofilms (standard strain and clinical isolates) formed in specimens of polymerizable resin acrylic microwave previously coated with human saliva , by means of the XTT test and confocal laser scanning microscopy (CLSM) . The nystatin (Sigma) was used as a positive control. The results showed that isolates of C. albicans planktonic were sensitive to TTO 1%, Terpinen-4-ol 0.47% and Nystatin 8 mg/mL. The smaller fungicidal concentrations for the isolates were TTO 2%, Terpinen-4-ol 0.95% and Nystatin 16 mg / mL. When analyzed by quantifying biofilm (CFU / ml) and XTT test, the concentrations TTO 2% and Terpinen-4-ol 0.95% were effective when compared to the control, and genotyping of samples A2 and B1 were more resistant. The CLSM results showed that all biofilms developed in bodies of acrylic resin were similar to the action of Nystatin. The extracts showed antifungal action for the clinical isolates and can be considered an alternative treatment for patients with candidiasis. / Mestre

Orientador: Débora Barros Barbosa / Coorientador: Fernanda Lourenção Brighenti / Banca: Alberto Carlos Botazzo Delbem / Banca: Juliano Pelim Pessan / Banca: Alessandra Marçal Agostinho / Banca: Emerson Rodrigues de Camargo / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antifúngica de nanopartículas de prata (NP) contra os biofilmes de Candida albicans e Candida glabrata. NP foram sintetizadas por meio da redução do nitrato de prata com citrato de sódio e estabilizadas com amônia ou polivinilpirrolidona. Os testes de concentração inibitória mínima (CIM) das NP contra células de Candida foram baseados no método da microdiluição. NP foram aplicadas sobre os biofilmes de Candida (48 horas) e após 24 horas de contato sua atividade antifúngica foi determinada por meio da quantificação da biomassa total (coloração com violeta cristal (VC)) e por meio da enumeração das unidades formadoras de colônias (UFCs). Após o tratamento com NP, as matrizes dos biofilmes foram extraídas e analisadas em termos de proteínas, carboidratos e DNA, e a estrutura dos biofilmes foi analisada por meio da microscopia eletrônica de varredura e de epifluorescência. A atividade antibiofilme da combinação de NP com nistatina e clorexidina foi avaliada por meio dos ensaios de VC e UFCs. Leveduras viáveis foram recuperadas a partir dos biofilmes previamente tratados com NP e adicionadas às células epiteliais HeLa e aos poços de placas de poliestireno e, após 2 horas de contato, a adesão foi determinada usando VC. A eficácia de NP submetidas às variações de temperatura (50, 70 e 100ºC) e pH (5 e 9) também foi avaliada, assim como a susceptibilidade às NP dos biofilmes de Candida em diferentes fases de crescimento. Os resultados de CIM mostraram que NP foram fungicidas contra os isolados testados em concentrações baixas (0,4-3,3 μg/mL). NP foram mais efetivas na redução da biomassa para os biofilmes de C. glabrata (reduções de 90% na concentração de 108 μg/mL) do que para C. albicans, e promoveram reduções significativas no log10 do número de UFCs... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the antifungal activity of silver nanoparticles (SN) against Candida albicans and Candida glabrata biofilms. Colloidal suspensions of SN were synthesized by reducing silver nitrate with sodium citrate and stabilized with ammonia or polyvinylpyrrolidone. Minimal inhibitory concentrations (MIC) were performed for Candida cells grown in suspension following the microbroth dilution method. Candida biofilms (48 h) were treated with SN for 24 h and then the total biomass quantification (by crystal violet (CV) staining) and the colony forming units (CFUs) were determined. Also, after treating with SN, extracellular matrices were extracted from Candida biofilms and analyzed chemically in terms of proteins, carbohydrates and DNA. To investigate the biofilm structure, scanning electron microscopy and epifluorescence microscopy were carried out. The antibiofilm activity of SN in combination with nystatin and chlorhexidine was also assessed by CV and CFU. Moreover, viable yeasts were recovered from the biofilms pretreated with SN and added to HeLa epithelial cells or to empty wells of polystyrene plates and, after 2 h of contact, the adhesion capacity of the yeasts was determined by using CV staining. The antibiofilm efficacy of SN subjected to variations of temperature (50, 70 and 100ºC) and pH (5 and 9) was also evaluated. Finally, the susceptibility to SN of biofilms in different stages of growth was analyzed. MIC results showed that SN were fungicidal against the tested strains at very low concentrations (0.4- 3.3 μg/mL). SN were more effective in reducing the total biomass of C. glabrata (reductions around 90% at 108 μg/mL SN) than C. albicans biofilms, and provided significant log10 reduction of... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os fungos dimÃrficos Coccidioides spp. e Histoplasma capsulatum var. capsulatum, sÃo os agentes causadores da coccidioidomicose e da histoplasmose, respectivamente, sendo capazes de acometer o homem e outros animais. A genÃtica das populaÃÃes H. capsulatum var. capsulatum tÃm sido caracterizadas mundialmente. Contudo, para Coccidioides spp. ainda hà escassez de estudos de variabilidade genÃtica, especialmente em isolados do Brasil. De modo geral, a terapia antifÃngica contra essas micoses à efetiva, embora em quadros crÃnicos ou disseminados, o tratamento seja muitas vezes, prolongado e difÃcil de tolerar. Ademais, casos refratÃrios e recidivos jà foram descritos. Recentemente, foi demonstrada a capacidade de H. capsulatum de formar biofilme. Pouco se sabe sobre qual o papel desse mecanismo na patogÃnese da histoplasmose e nenhum relato sobre a sensibilidade à antifÃngicos de H. capsulatum em biofilme, foi descrito atà o momento. Na busca por novos compostos com atividade antifÃngica, o sesquiterpeno farnesol tem se destacado por seu efeito inibitÃrio sobre o crescimento de bactÃrias e fungos. Diante do exposto, este trabalho teve por objetivo realizar a caracterizaÃÃo molecular de isolados brasileiros de C. posadasii, bem como, determinar o efeito in vitro do farnesol ante aos fungos dimÃrficos C. posadasii e H. capsulatum var. capsulatum, avaliando sua atuaÃÃo sobre o crescimento fÃngico, sensibilidade aos antifÃngicos, permeabilidade celular, produÃÃo de ergosterol e sobre o crescimento em biofilme. Para tanto, cepas de C. posadasii foram avaliadas por meio das tÃcnicas de RAPD e M13-fingerprinting. O mÃtodo de macrodiluiÃÃo foi utilizado para determinar a concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM) de farnesol isolado em combinaÃÃes com antifÃngicos. C. posadasii tambÃm foi submetido quantificaÃÃo do ergosterol apÃs a exposiÃÃo concentraÃÃes sub-inibitÃrias de farnesol. Ademais, a atividade do farnesol ante C. posadasii tambÃm foi avaliada na presenÃa de estresse osmÃtico, induzido por adiÃÃo de NaCl ao meio de cultura, durante os ensaios de sensibilidade. Por fim, cepas de H. capsulatum foram avaliadas na fase filamentosa e na fase leveduriforme, pelo mÃtodo de microdiluiÃÃo com farnesol isolado e em combinaÃÃo com antifÃngicos. A sensibilidade antifÃngica destas drogas tambÃm foi avaliada ante H. capsulatum sob a forma de biofilme. Os resultados de RAPD e M13-fingerprinting mostraram perfis eletroforÃticos semelhantes, mostrando poucos polimorfismos entres os isolados. O farnesol exibiu valores de CIMs baixos, variando de 0,0078-0,0616 ÂM para C. posadasii e de 0,0078-0,0312 para H. capsulatum. As combinaÃÃes de farnesol com antifÃngicos mostraram efeitos sinÃrgicos (FICI ≤ 0,5) em ambas as espÃcies. A quantificaÃÃo de ergosterol, mostrou que a exposiÃÃo a concentraÃÃes sub-inibitÃrias de farnesol diminuiu a quantidade de ergosterol extraÃdo das cÃlulas fÃngicas e CIMâs mais baixos foram encontrados para o farnesol quando as cepas foram submetidas a estresse osmÃtico, indicando que esse composto atua na membrana fÃngica. As combinaÃÃes de farnesol com itraconazol e com anfotericina B apresentaram as maiores porcentagens de reduÃÃo do crescimento fÃngico em biofilme. Em conclusÃo, o farnesol apresentou resultados promissores como agente antifÃngico ante C. posadasii e H. capsulatum, apresentando tambÃm aÃÃo adjuvante aumentando a sensibilidade aos antifÃngicos in vitro. Ademais, este estudo contribuiu para caracterizaÃÃo do perfil de sensibilidade do biofilme de H. capsulatum in vitro, bem como para caracterizaÃÃo genÃtica dos isolados de C. posadasii do Brasil.

Please read the abstract (Summary) in the section, 00front, of this document / Dissertation (MSc (Microbiology))--University of Pretoria, 2008. / Microbiology and Plant Pathology / unrestricted

<p><i>Mycobacterium abscessus </i>is a nontuberculous mycobacterium found in the environment that is becoming an emerging infectious pathogen capable of causing numerous types of infections. It is more antibiotic resistant than <i>Mycobacterium tuberculosis</i> and is becoming more prevalent in developed nations. Current treatments are not standardized and have poor success records and there is no definitive method in properly treating these infections. We tested an <i>in vitro </i>model that mimics the reducing environment that <i>M. abscessus</i> experiences during an infection by subjecting it to thiol-reductive stress. We observed that thiol reductive stress stabilized biofilms formed by <i>M. abscessus</i>. We found that <i>M. abscessus </i>in biofilms became tolerant to the antibiotics: clarithromycin, amikacin, and streptomycin. We postulated that efflux pumps might be involved in transport of the precursors of lipids associated with biofilm formation. Therefore, we investigated whether the efflux pump inhibitors affected biofilm formation and found that verapamil, CCCP and reserpine inhibited the formation of biofilms. We investigated the biosynthesis of lipids during biofilm formation by metabolic radiolabeling with ¹⁴C-acetate, the building block of fatty acids. We found that the biosynthesis of several phospholipids were elevated during biofilm formation and that the efflux pump inhibitor verapamil and exogenous fatty acids inhibited their biosynthesis. Further studies are needed to understand the roles of these lipids in biofilm formation.</p>

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Le lait cru constitue un milieu de culture favorable au développement de microorganismes dès la ferme. Malgré les différentes actions comme les nettoyages, la conservation au froid et les traitements thermiques utilisés pour limiter le développement ou détruire les bactéries pathogènes et responsables de l'altération du lait, ces dernières peuvent persister, parfois grâce à la formation de biofilms. Elles vont pouvoir s'établir sur les surfaces des équipements laitiers et seront responsables de pertes financières importantes. L'objectif de ce projet était de former des modèles de biofilms mixtes reproductibles à partir de bactéries isolées de l'environnement laitier afin d'étudier leur capacité à former des biofilms et caractériser ces derniers. Pour cela, six souches bactériennes thermorésistantes responsables d'altérations ont été sélectionnées. Leur capacité à former des biofilms a été évaluée par méthode statique avec des microplaques de 96 puits. Ensuite, les interactions entre les bactéries ont été étudiées grâce à des tests sur géloses. Enfin, la formation de biofilms a été reproduite par méthode dynamique avec un bioréacteur de type CDC. Les résultats de cette étude ont permis de mettre en évidence que des souches de Pseudomonas aeruginosa, Bacillus licheniformis, Streptococcus thermophilus et Enterococcus faecalis sont de fortes productrices de biofilms alors que les souches Clostridium tyrobutyricum et Rothia kristinae sont de faibles productrices de biofilm. En condition mixte, les bactéries fortement productrices de biofilms sont dominantes. Il ne semble pas y avoir de réactions antagonistes entre les bactéries à l'exception de P. aeruginosa qui pourrait freiner la croissance de B. licheniformis et E. faecalis. Les connaissances sur les biofilms mixtes acquises lors de cette étude, ainsi que les interactions observées entre les bactéries, permettront d'envisager des stratégies de contrôle impliquant notamment des phénomènes de compétition au sein des biofilms. / Raw milk is a rich culture medium allowing the development of microorganisms from the farm. Despite the various actions such as cleaning, cold storage and heat treatments used to limit the development of milk pathogenic and spoilage bacteria, they can persist due to the formation of biofilms. They will be able to establish themselves on the surfaces of dairy equipment and will be responsible for significant financial losses. The objective of this project was to establish reproducible multi-species biofilm models from bacteria isolated from the dairy environment in order to study their ability to form biofilms and characterize them. To do this, six heat-resistant bacterial strains responsible of milk adulteration were selected. Their ability to form biofilms was evaluated by a static method with 96-wells microtiter plates. Then, interactions between bacteria were studied through agar tests. Finally, the formation of biofilms was dynamically reproduced with a CDC biofilm reactor. The results of this study have shown that strains such as Pseudomonas aeruginosa, Bacillus licheniformis, Streptococcus thermophilus and Enterococcus faecalis are strong biofilm producers while Clostridium tyrobutyricum and Rothia kristinae are weak biofilm producers. In multi-species biofilms, bacteria producing strong biofilms take over weak producers. There do not appear to be any antagonistic reactions between bacteria except P. aeruginosa which may inhibit the growth of B. licheniformis and E. faecalis. The knowledge on multispecies biofilms acquired during this study, thanks to the model formed as well as the interactions observed between bacteria, will make it possible to consider control strategies involving competition phenomena within biofilms.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2017-2018 / Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste qui cause des infections pulmonaires chroniques chez les gens atteints de fibrose kystique (FK). Certaines souches, adaptées au microenvironnement des poumons FK, se distinguent, entre autres, par une résistance accrue aux antibiotiques et une formation abondante de biofilm. L'étude d'isolats provenant de patients FK est nécessaire afin de comprendre les déterminants génétiques expliquant cette adaptation et trouver de nouveaux moyens de lutter contre cette bactérie. Une librairie de mutants de LESB58, souche épidémique chez les patients FK, a été créée en 2009. Dans l’étude présentée ici, un criblage successif dans trois hôtes différents a été réalisé sur ces mutants, permettant d'identifier un mutant particulièrement peu virulent : le mutant STM PALES_11731. Ce mutant, contrairement à la souche sauvage, s'est avéré incapable de former des biofilm-like structures (BLS), une forme d'agrégation bactérienne ressemblant à du biofilm, mais flottant dans le milieu de culture. Afin d’évaluer ce phénomène chez différentes souches, la formation de biofilm adhéré et de BLS chez LESB58 et trois autres souches (la référence PAO1 et deux souches environnementales, PPF-1 et Urg-7) a été comparée à l'aide d'une nouvelle approche de quantification par analyse d'images. L’effet de cations divalents sur la formation de ces structures a également été exploré. Une diversité dans les phénotypes de formation de biofilms et de BLS et a été observée. Un manque de corrélation entre la formation de biofilms adhérés et de BLS a également été noté, suggérant que ces phénomènes pourraient ne pas être directement reliés et soulevant plusieurs questions sur les mécanismes de formation des BLS. Les résultats de ce projet de maîtrise indiquent que les BLS pourraient jouer un rôle dans la virulence de P. aeruginosa chez les patients FK et soulèvent l’importance de déterminer les mécanismes moléculaires ou physiques responsables de leur formation. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen known to cause chronic lung infections in cystic fibrosis (CF) patients. Some strains, adapted to the CF lung microenvironment, show distinguishing phenotypes such as an increased resistance to antibiotic treatments and an enhanced biofilm formation. The study of P. aeruginosa isolates from CF patients is necessary to understand the genetic determinants explaining this adaptation and to allow the development of new ways to fight this bacterium. A library of LESB58 mutants has been created in 2009. LESB58 is an epidemic strain among CF patients. In the study presented here, a sequential screening in three different hosts has been performed, leading to the identification of a mutant with a strong virulence defect: the STM PALES_11731 mutant. This mutant, contrary to the wild type, was unable to form biofilm-like structures (BLSs), a type of bacterial aggregation resembling biofilm, but floating in the culture medium. To assess this phenomenon among P. aeruginosa strains, the formation of adhered biofilm and BLSs in LESB58 and three other strains (the reference strain PAO1 and two environmental strains, PPF-1 and Urg-7) was compared using a novel image analysis quantification approach. The impact of the addition of divalent cations on the formation of those structures was also assessed. The results obtained demonstrate some diversity of biofilm and BLS formation in this bacterial species. They also reveal a lack of correlation between the BLS and adhered biofilm formation response to the ion treatment, suggesting that these two phenomena might not be directly related and raising questions about the mechanisms of BLS formation. The results of this project indicate that BLSs could play a role in the virulence of P. aeruginosa in CF patients and highlight the importance, in a future study, of studying the molecular and physical mechanisms responsible for their formation.