SILVA, Kylvia Rocha de Castro e. Quirópteros como hospedeiros do fungo Coccidioides posadasii : descrição do primeiro registro de isolamento. 2011. 108 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-06-26T12:54:41Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_krcsilva.pdf: 3089034 bytes, checksum: 3da84739981bcd37b3118f8180fbb0c8 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-07-04T11:48:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_krcsilva.pdf: 3089034 bytes, checksum: 3da84739981bcd37b3118f8180fbb0c8 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-04T11:48:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_krcsilva.pdf: 3089034 bytes, checksum: 3da84739981bcd37b3118f8180fbb0c8 (MD5) Previous issue date: 2011 / The order Chiroptera is shown as a reservoir for various infectious agents, including protozoan, bacteria, virus and fungi. To investigate the eco-epidemiological aspects of Histoplasma capsulatum in Northeast Brazil, 83 bats were captured in urban and rural areas in Ceará, collected in day and night, during the period August 2010 to March 2011. After euthanasia, fragments of sleen, liver and lung were removed, macerated and 100 μL aliquots were plated on agar containing modified BHI, which were incubated for up to six weeks at temperatures of 28 ºC and 35 ºC. Aliquots of each remaing macerated material stored at -20 °C. Although the fungus was not isolated in any samples, after 21 days at 35 ºC was observed the growth of a fungal colony suggestive of Coccidioides spp. in lung samples of the species Carollia perspicillata. Fragments of the bet lung removed from storage at -20 ºC and analyzed by optical microscopy revealed spherical structures similar to the shape of the parasitic fungus. The colonies were investigated by means of the reversion in vivo in a murine model, with observation of the animals incoculated up to four weeks. The molecular identification of cultures was performed by PCR specific for C. posadasii, using the oligonucleotides Coi9-R and Coi9-F. Finally, samples of macerated lung, spleen and liver were investigated for the presence of antibodies or antigens specific for C. posadasii, as well as the presence of anti-Histoplasma, by immunodiffusion. Spherules of Coccidioides spp. features were visualized in lung samples of mice experimentally infected. Molecular analysis of cultures isolated from lungs of C. perpicillata, as well as organs of mice, showed approximately 630 pb band, characteristic of C. posadasii. By immunodiffusion reaction, two animals were detected reagents for Coccidioides antigens. The animals belonged to the species Glossophaga soricina and Desmodus rotundus and an animal of the species G. soricina antibody-positive for Coccidioides. There was no presence of anti-Histoplasma is any sample. The present study shows the first isolation of C. posadasii in bats. Additionally, in an unprecedented manner, we detected antigens and antibodies specific to C. posadasii these animals. Its is necessary to the study of bats in ecoepidemiology the pathogen. / A ordem Chiroptera mostra-se como reservatório para vários agentes infecciosos, incluindo protozoários, bactérias, vírus e fungos. A fim de investigar a a eco-epidemiologia de Histoplasma capsulatum no Nordeste do Brasil, foram capturados 83 morcegos em áreas urbanas e rurais no estado do Ceará, em coletas diurnas e noturnas, durante o período de agosto de 2010 a março de 2011. Após eutanásia, fragmentos de baço, fígado e pulmão foram removidos, macerados e alíquotas de 100μL foram semeadas em placas contendo ágar BHI modificado, as quais foram incubadas por até seis semanas nas temperaturas de 28ºC e 35ºC. Alíquotas remanescentes de cada material macerado foram estocadas a -20°C. Embora o fungo não tenha sido isolado em nenhuma amostra, após 21 dias de incubação à 35ºC foi observado o crescimento de uma colônia fúngica sugestiva de Coccidioides spp. em amostra de pulmão da espécie Carollia perspicillata. Fragmentos de pulmão do morcego retirados do estoque a -20°C e analisados ao microscópio óptico revelaram estruturas esféricas semelhantes a forma parasitária do fungo. A colônia foi investigada por meio do teste de reversão in vivo em modelo murino, com observação dos animais inoculados por até quatro semanas. A identificação molecular das culturas foi realizada por reação de PCR específica para C. posadasii, empregando os oligonucleotídeos Coi9-R e Coi9-F. Por fim, amostras de macerados dos pulmões, baço e fígado foram investigadas quanto à presença de anticorpos ou antígenos específicos para C. posadasii, bem como quanto à presença de anticorpos anti-Histoplasma, por meio da técnica de imunodifusão. Esférulas características de Coccidioides spp. foram visualizadas em amostras de pulmão dos camundongos infectados experimentalmente. Análise molecular das culturas isoladas de pulmão de C. perspicillata, bem como dos órgãos dos camundongos, mostraram banda de aproximadamente 630 pb, característica de C. posadasii. Por meio de reação de imunodifusão, foram detectados dois animais reagentes para antígenos de Coccidioides. Os animais pertenciam às espécies Glossophaga soricina e Desmodus rotundus e um animal da espécie G. soricina anticorpo-positivo para Coccidioides. Não foi observada presença de anticorpos anti-Histoplasma em nenhuma das amostras. O presente estudo mostra o primeiro isolamento de C. posadasii em quirópteros. Adicionalmente, de forma inédita, detectou-se de antígenos e anticorpos específicos para C. posadasii nestes animais. Faz-se necessário o estudo dos quirópteros na ecoepidemiologia do patógeno.

Orientador: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Simone Baldini Lucheis / Banca: Valéria Maria Savoya da Silva / Banca: Mônica Regina Vendrame Amarante / Banca: Silvia Helena venturoli Perri / Resumo: A criptosporidiose, tanto humana como animal, tem distribuição cosmopolita. Esse parasito ocasiona diarreia em bezerros, retardo no crescimento, mortalidade e consequentes perdas econômicas. Nós realizamos a viabilização, desenvolvimento, avaliação e validação intralaboratorial de uma nova técnica parasitológica para a análise em microscopia óptica de oocistos de Cryptosporidium spp., denominada de TF-Test Coccidia, em amostras fecais de bezerros do município de Araçatuba, São Paulo. Para o desenvolvimento deste estudo e confirmação da nova técnica diagnóstica TF-Test Coccidia foram empregadas duas metodologias: centrífugo-sedimentação seguida da coloração negativa de verde malaquita (CSN-Malaquita) e Nested-PCR. Amostras positivas e negativas de bezerros foram utilizadas para a confecção e validação do TF-Test Coccidia. Portanto, podemos concluir a eficácia da técnica parasitológica de TF-Test Coccidia, na detecção de oocistos do parasito Cryptosporidium spp. e observamos boa concentração e morfologia das estruturas de eliminação do mencionado parasito, com baixa quantidade de impureza em esfregaço fecal. / Abstract: Cryptosporidiosis, both human and animal, has a worldwide distribution. This parasite causes diarrhea in calves, growth retardation, mortality and consequent economic losses. We performed the feasibility, development, evaluation and within-laboratory validation of a new parasitological technique by optical microscopy analysis of Cryptosporidium spp., Called TF-Test Coccidia in fecal samples of calves in the city of Araçatuba, São Paulo. To develop this study and confirmation of the new diagnostic technique TF-Test Coccidia were employed two methodologies: the centrifugal sedimentation followed by negative staining of malachite green (CSN-Malachite) and nested PCR. Positive and negative samples from calves were used for the preparation and validation of TF-Test Coccidia. Therefore, we conclude the effectiveness of parasitological technique TF-Test Coccidia, on the oocysts detection of the parasite Cryptosporidium spp. and observe good concentration and morphology of eliminated parasitic structures mentioned, with low amount of impurity in fecal smear. / Doutor

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Thesis (DR. P.H.)--University of Michigan.

Thesis (DR. P.H.)--University of Michigan.

MEDRANO, Delia Jessica Astete. Perfil de sensibilidade de cepas de Coccidioides posadasii a associação de drogas antimicrobianas. Fortaleza,2010. 146 f. Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2011-10-05T15:37:12Z No. of bitstreams: 1 2010_tese_djamedrano.pdf: 3128064 bytes, checksum: 0f3a21eec28eb85ca0c5d157d3bdc8aa (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2011-10-07T16:22:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_tese_djamedrano.pdf: 3128064 bytes, checksum: 0f3a21eec28eb85ca0c5d157d3bdc8aa (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-07T16:22:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_tese_djamedrano.pdf: 3128064 bytes, checksum: 0f3a21eec28eb85ca0c5d157d3bdc8aa (MD5) Previous issue date: 2010 / The coccidiodomicose is a systemic infection, predominantly lung caused by dimorphic fungi Coccidioides immitis and C. posadasii. Brazil is among the countries with endemic areas of coccidiodomicose, confined to the semiarid areas of Northeast Brazil. This scenario leads to a larger investigation into new strategies for an injunction against C.posadasii. Based on this context, the purpose of this study was to investigate new strategies, to evaluate the in vitro interaction of the major antifungal agents used in the treatment of coccidioidomycosis, analyze the inhibitory effect in vitro antimicrobial drugs, such as sulfamethoxazole and trimethoprim (SMX / TMP ) associated or not with amphotericin B (AMB) and evaluate the in vitro interaction of antituberculosis drugs with antifungal drugs against C. posadasii strains isolated in northeastern Brazil. The study was conducted in test macrodilution according to the protocol described in document M-38A, standardized by the Clinical Laboratory Standars Institute (CLSI, 2002). The synergistic interaction of the drugs was evaluated by the Checkerboard method. This study showed that the eight combinations of two antifungal drugs such as amphotericin B with azole derivatives and voriconazole with derivative azole and caspofungin, respectively showed inhibitory effect in vitro against the isolates of C. posadasii, but only a combination of voriconazole with amphotericin B showed synergistic interaction, whose minimum inhibitory concentration (MIC) was reduced by 15 times when compared with the MIC of the drug tested alone. SMX/TMP had an inhibitory effect in vitro against strains of C. posadasii, however, decreased the MIC of AMB at 5,85 times when associated with SMX / TMP. Regarding the 24 combinations of antifungal drugs with antituberculosis drugs tested showed any inhibitory effect in vitro against the isolates of C. posadasii. Of the 24 combinations, synergistic interactions were observed in 16 associations, of which, amphotericin B with rifampicin, itraconazole or rifampicin with ethambutol or pyrazinamide, ethambutol with fluconazole and voriconazole with ethambutol MICs were reduced ten-fold when compared with the MICs of drugs tested in isolation. Future studies in animal models are needed to confirm the usefulness of these combinations. This work is a source of support for new investigations of combinations that result in synergistic interactions, as well as to determine the correlation of results in vivo. / A coccidioidomicose é uma infecção sistêmica, predominantemente pulmonar, causada pelos fungos dimórficos Coccidioides immitis e C. posadasii. O Brasil está na relação de países com áreas endêmicas da coccidioidomicose (RESTREPO, 2006), circunscritas às zonas do semiárido da região do Nordeste (COX & MAGEE, 2004). Esse cenário leva a uma investigação maior para novas estratégias inibitórias contra Coccidioides posadasii. Baseando-se neste contexto, buscou-se estudar novas estratégias, como avaliar a interação in vitro dos principais antifúngicos utilizados no tratamento da coccidioidomicose, analisar o efeito inibitório in vitro de drogas antimicrobianas, como o sulfametoxazol com trimetoprim (SMX/TMP) associado ou não com anfotericina B (AMB), bem como avaliar a interação in vitro das drogas antituberculose com drogas antifúngicas frente a cepas de C. posadasii isoladas no Nordeste brasileiro. O estudo foi conduzido em ensaio de macrodiluição, de acordo com o protocolo descrito no documento M-38A, padronizado pelo Clinical Laboratory Standars Institute (CLSI, 2002). A interação sinérgica das drogas foi avaliada pelo método do Checkerboard. Este estudo mostrou que as oito combinações entre duas drogas antifúngicas testadas como anfotericina B com derivados azólicos e voriconazol com derivados azólicos e caspofungina respectivamente apresentaram efeito inibitório in vitro frente aos isolados de C. posadasii; porém apenas uma combinação voriconazol com anfotericina B exibiu interação sinérgica, cuja concentração inibitória mínima (CIM) foi reduzida em 15 vezes, quando se comparou com a CIM da droga testada isoladamente. O SMX/TMP mostrou efeito inibitório in vitro com frente a cepas de C. posadasii, entretanto, houve diminuição da CIM da AMB em cerca de 5,85 vezes quando associado à SMX/TMP. Com relação às 24 combinações entre drogas antifúngicas com drogas antituberculose testadas todas apresentaram efeito inibitório in vitro frente aos isolados de C. posadasii. Das 24 combinações, foram observadas interações sinérgicas em 16 associações, das quais anfotericina B com rifampicina; itraconazol com rifampicina ou etambutol ou pirazinamida; fluconazol com etambutol e voriconazol com etambutol foram reduzidas as CIMs em dez vezes, ao se comparar com a CIMs da droga testada isoladamente. Futuros estudos em modelos animais são necessários para confirmar a utilidade destas combinações. Este trabalho é fonte de apoio para novas investigações de combinações que resultem em interações sinérgicas, bem como para determinar a correlação de resultados in vivo.

LIMA, Rita Amanda Chaves de. Estudos dos fungos dimórficos Coccidioides posadasii e Histoplasma capsulatum var. capsulatum : caracterização laboratorial com ênfase no perfil de sensibilidade ao sesquiterpeno farnesol, in vitro. 2013. 115 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Médica) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-10-26T12:57:33Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_raclima.pdf: 2195497 bytes, checksum: 24056eb6ed524c6317a8f30e993f565e (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-10-26T13:29:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_raclima.pdf: 2195497 bytes, checksum: 24056eb6ed524c6317a8f30e993f565e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-26T13:29:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_raclima.pdf: 2195497 bytes, checksum: 24056eb6ed524c6317a8f30e993f565e (MD5) Previous issue date: 2013 / Dimorphic fungi Coccidioides spp. and Histoplasma capsulatum var. capsulatum are the causative agents of coccidioidomycosis and histoplasmosis, respectively, being able to affect humans and other animals. The population genetics of H. capsulatum var. capsulatum ha ve been characterized worldwide. However, there are few studies of g enetic variability for Coccidioides spp., especially in isolates from Brazil. In general, antifungal therapy is effective against these mycoses, although in chronic or disseminated cases , the treatment is often prolonged and difficult to tolerate. Moreover , recurrence and refractory cases have been reported. Recently, it was demonstrated that H. capsulatum is able t o form biofilm. Little is known about the role of this mechanism in the pathogenesis of histoplasmosis and no report on the antifungal susceptib ility of H. capsulatum in biofilm was described to date. In search for new compounds with antifungal activity, the sesquiterpene farnesol has gained prominence for their inhibitory effect on the growth of bacteria and fungi. Considering the above, this stu dy aimed to perform molecular characterization of Brazilian isolates of C. posadasii , as well as, to determine the in vitro effect of farnesol against dimorphic fungi C. posadasii and H . capsulatum var . capsulatum , assessing its effect on fungal growth, sensitivity to antifungal agents, cell permeability, production of ergosterol and in biofilm growth. Thus, strains of C. posadasii were evaluat ed using the techniques of RAPD, M13 - fingerprinting . M acrodilution method was used to determine the min imum inhibitory concentration ( MIC) of farnesol alone and in combination with antifungals . C. posadasii was also subjected to quantification of ergosterol after exposure to sub - inhibitory concentrations of farnesol. In addition , farnesol activity against C. posadasii was also evaluated in the presence of osmotic stress induced by the addition of NaCl to the culture medium during the susceptibility test. Finally, H. capsulatum strains were evaluated in filamentous and yeast phase by microdilution method with farnesol alone and in combination with antifungals. The antifungal susceptibility of these drugs was also evaluated against H. capsulatum in a biofilm. The results of RAPD and M13 - fingerprinting showed similar electrophoretic profiles, showing few polymorphism s among the isolates . F arnesol exhibited low MIC values , ranging from 0.0078 to 0.0616 μ M for C. posadasii and 0.0078 to 0.0312 μM for H. capsulatum . Combinati ons of farnesol with antifungal showed synergistic effects (FIC I ≤ 0.5) in both species Quantification of ergosterol showed that exposure to sub - inhibitory concentrations of farnesol decreased the amount of ergosterol extracted from fungal cells and MIC's lower been found to farnesol when the strains were subjected to osmotic stress, indicating that this compound acts on the membrane fungal . Combinations of farnesol with itraconazole and amphotericin B showed the highest reduction percentages of fungal growth in biofilm . In conclusion, farnesol drug showed promising r esults as antifungal agent against C. posadasii and H. capsulatum , presenting adjuvant action and increasing sensitivity to antifungal agents in vitro . Furthermore, this study contributes to the characterization of the sensitivity profile of the biofilm of H. capsulatum in vitro as well as for genetic characterization of isolates of C. posadasii from Brazil / Os fungos dimórficos Coccidioides spp. e Histoplasma capsulatum var. capsulatum, são os agentes causadores da coccidioidomicose e da histoplasmose, respectivamente, sendo capazes de acometer o homem e outros animais. A genética das populações H. capsulatum var. capsulatum têm sido caracterizadas mundialmente. Contudo, para Coccidioides spp. ainda há escassez de estudos de variabilidade genética, especialmente em isolados do Brasil. De modo geral, a terapia antifúngica contra essas micoses é efetiva, embora em quadros crônicos ou disseminados, o tratamento seja muitas vezes, prolongado e difícil de tolerar. Ademais, casos refratários e recidivos já foram descritos. Recentemente, foi demonstrada a capacidade de H. capsulatum de formar biofilme. Pouco se sabe sobre qual o papel desse mecanismo na patogênese da histoplasmose e nenhum relato sobre a sensibilidade à antifúngicos de H. capsulatum em biofilme, foi descrito até o momento. Na busca por novos compostos com atividade antifúngica, o sesquiterpeno farnesol tem se destacado por seu efeito inibitório sobre o crescimento de bactérias e fungos. Diante do exposto, este trabalho teve por objetivo realizar a caracterização molecular de isolados brasileiros de C. posadasii, bem como, determinar o efeito in vitro do farnesol ante aos fungos dimórficos C. posadasii e H. capsulatum var. capsulatum, avaliando sua atuação sobre o crescimento fúngico, sensibilidade aos antifúngicos, permeabilidade celular, produção de ergosterol e sobre o crescimento em biofilme. Para tanto, cepas de C. posadasii foram avaliadas por meio das técnicas de RAPD e M13-fingerprinting. O método de macrodiluição foi utilizado para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) de farnesol isolado em combinações com antifúngicos. C. posadasii também foi submetido quantificação do ergosterol após a exposição concentrações sub-inibitórias de farnesol. Ademais, a atividade do farnesol ante C. posadasii também foi avaliada na presença de estresse osmótico, induzido por adição de NaCl ao meio de cultura, durante os ensaios de sensibilidade. Por fim, cepas de H. capsulatum foram avaliadas na fase filamentosa e na fase leveduriforme, pelo método de microdiluição com farnesol isolado e em combinação com antifúngicos. A sensibilidade antifúngica destas drogas também foi avaliada ante H. capsulatum sob a forma de biofilme. Os resultados de RAPD e M13-fingerprinting mostraram perfis eletroforéticos semelhantes, mostrando poucos polimorfismos entres os isolados. O farnesol exibiu valores de CIMs baixos, variando de 0,0078-0,0616 µM para C. posadasii e de 0,0078-0,0312 para H. capsulatum. As combinações de farnesol com antifúngicos mostraram efeitos sinérgicos (FICI ≤ 0,5) em ambas as espécies. A quantificação de ergosterol, mostrou que a exposição a concentrações sub-inibitórias de farnesol diminuiu a quantidade de ergosterol extraído das células fúngicas e CIM’s mais baixos foram encontrados para o farnesol quando as cepas foram submetidas a estresse osmótico, indicando que esse composto atua na membrana fúngica. As combinações de farnesol com itraconazol e com anfotericina B apresentaram as maiores porcentagens de redução do crescimento fúngico em biofilme. Em conclusão, o farnesol apresentou resultados promissores como agente antifúngico ante C. posadasii e H. capsulatum, apresentando também ação adjuvante aumentando a sensibilidade aos antifúngicos in vitro. Ademais, este estudo contribuiu para caracterização do perfil de sensibilidade do biofilme de H. capsulatum in vitro, bem como para caracterização genética dos isolados de C. posadasii do Brasil.

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Nikkomycin Z (NikZ) is a chitin synthase inhibitor with antifungal efficacy against Coccidioides spp. and other endemic fungi. Dogs suffer a rate and range of natural coccidioidomycosis similar to humans and were considered an excellent model for initially testing NikZ against naturally acquired disease. Twelve dogs with coccidioidal pneumonia that had been present for an average of three months were treated with 250 mg (5 - 15 kg) or 500 mg (> 15 - 30 kg) twice daily for 60 days. Nine dogs completed the course of treatment and seven dogs had improvement in disease based on radiographs, clinicopathological parameters, physical examination findings, and subjective assessment by the owners; three dogs had resolution or near resolution of disease. Based on this small study, NikZ shows efficacy to treat naturally acquired coccidioidomycosis and merits further development for trials in humans.