INTRODUCCIÓN: Las vesículas y los túbulos son los intermediarios de transporte (ITs) que regulan el flujo de membrana a través de la vía secretora y endocítica. A diferencia de las vesículas, poco se conoce sobre los mecanismos de formación de los túbulos. Cada vez más estudios apuntan a que los lípidos y las enzimas modificadoras de lípidos tienen un papel muy importante en la formación, mantenimiento y fisión de los intermediarios de transporte. Los glicerolípidos pueden jugar un papel importante en estos procesos reclutando proteínas a las membranas, modulando la función de estas o afectando directamente la curvatura de la membrana, Las proteínas relacionadas con la formación, mantenimiento y desacoplamiento de las proteínas de cubierta tipo I (COPI) también se han relacionado con la formación de túbulos. OBJETIVOS: El objetivo general de esta tesis doctoral fue el de avanzar en el conocimiento sobre el papel de los túbulos como ITs en la vía secretora temprana e identificar mecanismos moleculares y de regulación involucrados en el proceso de tubulación, más específicamente, en el papel de glicerolípidos y enzimas modificadoras de lípidos y de las cubiertas tipo COPI. METODOLOGÍA: Para llevar a cabo estos objetivos Para inducir la formación de túbulos derivados del aparato de Golgi las células HeLa se incubaron a baja temperatura (15ºC) y con la droga brefeldina A (BFA). Se usaron inhibidores específicos de enzimas implicadas en el metabolismo de lípidos de membrana para ver el efecto que producen sobre los túbulos mediante ensayos de inmunofluorescencia. Se determinó la localización de la enzima endógena fosfolipasa D2 (PLD2) en el complejo de Golgi mediante inmunocitoquímica ultraestructural. También, se analizó el efecto de la sobreexpresión y el silenciamiento génico de PLD2. CONCLUSIONES: De los resultados obtenidos se desprenden las siguientes conclusiones: 1. Las células HeLa incubadas a 15ºC son un buen modelo para estudiar el papel de glicerolípidos y enzimas modificadoras de lípidos en la formación de túbulos. 2. El ácido fosfatídico (PA) y el diacilglicerol (DAG) son necesarios para la formación y mantenimiento de los túbulos inducidos a 15ºC y BFA, respectivamente. 3. El PA generado por PLD es el más importante para la formación de los túbulos inducidos a baja temperatura. Este lípido está involucrado en un paso temprano de la formación y en la elongación de estos túbulos. 4. PLD2, pero no PLD1, es la enzima responsable de la formación del PA necesario en la tubulación inducida a baja temperatura. Esta enzima está asociada a las membranas del complejo de Golgi y está implicada en el mantenimiento de la arquitectura de este orgánulo. 5. La reducción del PA generado por PLD2 induce la formación de un tipo específico de túbulos que contienen proteínas de matriz. 6. El reclutamiento de ArfGAP1 en las membranas del complejo de Golgi es dependiente del PA generado por PLD2. ArfGAP1 podría ser un componente de la maquinaria molecular implicada en el reclutamiento de la carga en los túbulos. 7. Las membranas del complejo de Golgi son capaces de generar distintos tipos de túbulos con una composición específica. Cuando su actividad enzimática se ve potenciada o cuando la enzima se recluta en ciertas regiones del complejo de Golgi, el PA generado favorece la curvatura local de la membrana reclutando a ArfGAP1, el cual, a su vez, podría ser necesario para el reclutamiento de enzimas residentes. Por el contrario, cuando esta actividad enzimática es inhibida, podría haber una acumulación de DAG o ácido lisofosfatídico, podrían generar otro tipo de túbulos que contienen proteínas de matriz.. Se podría especular que algunos túbulos de Golgi podrían estar relacionados con el transporte retrógado intra-Golgi, mientras que otros mantienen la arquitectura de la cinta del Golgi o bien intervienen en el transporte anterógrado intra-Golgi. / Vesicles and tubules are the transport carriers that regulate membrane flux through the secretory and endocytic pathways. In contrast to vesicles, little is known about the mechanism of formation of Golgi tubules. An increasing body of evidence has pointed to the crucial importance of lipids and lipid-modifying enzymes in the biogenesis, maintenance and fission of transport carriers. Glycerophospholipids may play an important role in these processes, by mediating protein recruitment to membranes, modulating protein functions or by affecting membrane curvature directly. The proteins involved in the formation, maintenance and detachment of the coat protein I (COPI) have also been related to the formation of tubules. AIMS: The aim of the present study was to deepen our understanding of the molecular mechanisms that participate in Golgi tubule formation. More specifically, we analysed the role of glycerolipids and related enzymatic activities in the generation and/or maintenance of Golgi tubules as well as their relationship with the COPI machinery. METHODS: To perform these aims we used low temperature (15°C) and the drug brefeldin A (BFA) to induce the formation of Golgi tubules in HeLa cells. Immunofluorescence microscopy was used to visualize the effect of specific inhibitors of lipid modified enzymes in the formation of Golgi tubules. We assessed the localization of endogenous phospholipase D2 (PLD2) within the Golgi membranes by cryoimmunoelectron microscopy. Furthermore, PLD2-overexpressed and depleted cells we analysed. CONCLUSIONS: The results obtained after these studies rendered these conclusions: 1. Hela cells cultured at low temperature (15ºC) are an useful model to study the role of glycerolipids and lipid modified enzymes in the formation of Golgi tubules. 2. Phosphatidic acid (PA) and diacylglycerol (DAG) are needed for the formation and maintenance of low temperature- and BFA-induced Golgi tubules, respectively. 3. PA generated by PLD is the most important glycerolipids for the formation of low temperature-induced Golgi tubules. This glycerolipid may be involved in an early step of the budding process as well as in the tubule elongation. 4. PLD2, but not PLD1, is the enzyme responsible for the formation of PA needed in the low temperature model of Golgi tubulation. This enzyme is associated to Golgi membranes and is involved in the maintenance of the architecture of this organelle. 5. The reduction of the levels of the PA generated by PLD2 induces the formation of a specific set of Golgi tubules containing matrix proteins. 6. ArfGAP1 recruitment to the Golgi membranes depends on the presence of the PA generated by PLD2. This protein might be a component of the molecular machinery involved in cargo recruitment into Golgi tubules. 7. Golgi membranes are able to generate different types of tubules of varied composition. When PLD2 enzymatic activity is enhanced or the enzyme is recruited to certain Golgi areas, the PA generated is able to bend the membrane and to recruit ArfGAP1, which might be necessary for the recruitment of resident enzymes. Conversely, when its activity is inhibited, there is an accumulation of DAG or lisophosphatidic acid, which might generate another type of tubule containing matrix proteins. It can be speculated that some Golgi tubules may be involved in retrograde intra-Golgi traffic, whereas others keep the architecture of the Golgi ribbon or anterograde intra-Golgi transport.

In the present thesis, we have studied the evolution of the inflammasome functions in fish. We observed that inflammasome and caspase-1 trigger pyroptotic cell death but they are not involved in the processing of IL-1β. In addition, we have developed a zebrafish-Salmonella infection model to study the role of the inflammasome in the clearance of intracellular bacteria. Finally, we have identified and characterized a new member of the IL-1 family, IL-1Fm2, which is exclusively present in most evolutionarily advanced teleosts. The identification of this new IL-1 family member helps to understand the evolution of this family of cytokines in vertebrates and point out to its complexity. / En la presente tesis doctoral se ha estudiado la evolución de las funciones del inflamasoma en peces, llegando a la conclusión de que tanto el inflamasoma como la caspasa-1 desencadenan muerte celular conocida como piroptosis, pero no son necesarios para el procesamiento de la IL-1β. Además se ha desarrollado un modelo de infección en pez cebra para el estudio del papel del inflamasoma en la eliminación de bacterias intracelulares, como Salmonella. Por último, se ha descrito un nuevo miembro de la familia de la IL-1, IL-1Fm2, perteneciente exclusivamente a los peces teleósteos más avanzados evolutivamente. La identificación de este nuevo miembro de la familia de la IL-1, IL-1Fm2, ayuda a entender la evolución de esta familia de citoquinas en vertebrados e indica su gran complejidad.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa la calidad microbiológica de aguas subterráneas (pozos), utilizadas para el consumo humano ubicadas en el Centro Poblado de Santa María de Huachipa en el distrito de Lurigancho, Lima. Se recolectaron treinta y cuatro muestras de aguas subterráneas (pozos). Para la determinación de Coliformes Totales, Escherichia coli, y Enterococcus sp., el análisis es realizado con la técnica del Número Más Probable (NMP), para bacterias heterotróficas y Pseudomonas aeruginosa, se emplean los métodos de recuento en placa y filtración de membrana respectivamente. En los resultados se observan valores superiores a los límites establecidos por el MINAM-2008, DIGESA y Código Alimentario Argentino, encontrándose que el 74% (25) de las muestras de agua supera el parámetro de bacterias heterotróficas (máximo 500 UFC/mL), el 100% (34) de las muestras de agua no cumple con el parámetro para coliformes totales (< 1,8 NMP/100mL o ausencia), y el 53% (18) de las muestras de agua supera los límites establecidos para Escherichia coli (< 1,8 NMP/100mL o ausencia). En el caso de Enterococcus sp. (< 1,8 NMP/100mL o ausencia) el 85% (29) de las muestras de agua supera el límite permisible; y el 53% (18) de las muestras presentó Pseudomonas aeruginosa (< 1 UFC/100mL o ausencia). Se concluye que ninguna muestra de agua cumple con los requisitos microbiológicos para ser aceptable como aguas de consumo humano, constituyendo un riesgo potencial para la salud de los consumidores debido a los elevados niveles de contaminación microbiana. / Tesis

El documento digital no refiere asesor / Busca probar algunas técnicas de laboratorio que sean eficaces y sensibles para poder determinar los anticuerpos circulantes en los animales portadores de la Sarcocystiosis, de esta manera obtendríamos un método de diagnóstico in vigo. Selecciona para el Sarcocystis, las técnicas de Aglutinación Directa (Arcay, 1966), Hemaglutinación Indirecta (Knierdm, 1966) y Fijación del Complemento (Knierim, 1958), aplicadas por muchos autores para el diagnóstico serológico de lo toxoplasmosis, pues el toxoplasma presenta una apárrente semejanza morfológica con el Sa rcocystis.ambos géneros pertenecen a la Orden Toxoplasmida. El objetivo era investigar la posibilidad de la aplicación de dichas técnicas al diagnóstico serológico de la infección de llamas (Lama glama) por Sarcocyatis aucheniae (Brurmpt, 1933) y determinar además la prevalencia del Sarcocystis en las llamas del departamento de Puno, mediante la necropsia y búsqueda por métodos histológicos. / Tesis

Aisla un bacteriófago lítico denominado Vf1, procedente del mar peruano, capaz de infectar a Vibrio fluvialis, bacteria que afecta humanos y organismos acuáticos. El bacteriófago Vf1 fue caracterizado con respecto a su morfología, estabilidad térmica, diferentes rangos de pH, sensibilidad frente al cloroformo, exposición a la luz UV, rango de hospederos y la curva de crecimiento de un paso. La microscopía electrónica de transmisión, evidenció cabeza de forma icosaedrica con un diámetro de 82.773 nm y un talo largo no contráctil de 142.318 nm de longitud, características propias a la familia Siphoviridae. El fago Vf1, fue resistente al calor a 20°C por 30 minutos, perdiendo su viabilidad a partir de 50 y 60°C; y en valores de pH entre 7 y 8 mantuvo títulos elevados, disminuyendo el título entre 5 y 6, siendo nulo a valores de pH ácido. La viabilidad frente a la exposición al cloroformo, evidenció una reducción en el título del 50% y frente a la luz UV, la reducción fue del 100% a 90 segundos de exposición. En la curva de crecimiento de un paso evidenció un período de latencia de 20 minutos y el tamaño de la explosión o burst size fue 602 partículas por centro infectivo. Los parámetros biológicos evaluados en este estudio evidenciaron el potencial del bacteriófago Vf1 para poder ser utilizado en fagoterapia, además, la metodología evaluada podría ser utilizado para el aislamiento de otros bacteriófagos de ambientes marinos. / Tesis

Optimiza la prueba de microneutralización para la detección de anticuerpos neutralizantes contra DENV-2 en línea celular Vero-76. Se optimizó la prueba de microneutralización para DENV-2 evaluando distintas concentraciones celulares y porcentajes de suero bovino fetal usado en el medio de mantenimiento. Se realizó 5 pasajes de la semilla viral de DENV-2 confirmado por PCR para la adaptación de la semilla viral a la línea celular Vero-76. Luego, se evaluaron mediante la prueba de microneutralización para DENV-2, 5 sueros seronegativos a DENV-2 y YFV, 5 sueros seronegativos a DENV-2 Y seropositivos a YFV y 5 sueros seropositivos a DENV-2 (confirmados por la prueba de neutralización por reducción de placas para DENV-2 y YFV) en las diluciones 1:5; 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640. Los resultados indican que la concentración óptima de células Vero-76 fue 0,9 x 105 cel/mL y el porcentaje de Suero Bovino Fetal en el medio de mantenimiento fue de 2% para la prueba de microneutralización. Además, se redujo el uso de la concentración de células Vero-76 en un 64% y el tiempo de desarrollo del ensayo a 5 horas con respecto a la prueba de neutralización por reducción de placas para DENV-2. Así mismo, la mínima dilución capaz de diferenciar un suero seropositivo a DENV-2 de un suero seronegativo a DENV-2 mediante la prueba de microneutralización para DENV-2 fue 1:40 y el tiempo de incubación de la prueba de microneutralización para DENV-2 fue de 10 días. Se concluye que la prueba de microneutralización para DENV-2 es una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Su optimización permitirá realizar estudios de seroprevalencia para dengue lo cual contribuirá a una vigilancia epidemiológica eficiente en el país. / Innóvate Perú / Tesis

Estudia la variabilidad bacteriana de los cuerpos de agua de la zona de Mar Bravo en Ecuador, producido por la producción larvaria del camarón blanco Litopenaeus vannamei, basados en la cuantificación de bacterias viables y bacterias no viables. Encuentra que las concentraciones de bacterias fueron más altas en la estación seca, así como en las tomas realizadas en sicigia, presentando valores 4.5E+05 UFC/ml y para cuadratura 2.0E+05 UFC/ml. Los parámetros químicos como clorofila, carbono, DBO y DQO fueron influenciados con las estaciones ambientales guardando similitud entre los comportamientos de carbono y clorofila. Los datos de producción como sobrevivencia y densidades, no presentaron diferencias significativas cuando fueron analizados por épocas del año. Las correlaciones bacterianas comparando ufc/ml y sitios de muestreos, así como las correlaciones de las bandas moleculares con los sitios fueron más positivas cuando se trabajó con bacterias no viables demostrando que este método fue más exitoso que el método tradicional. No se detectaron genes de toxinas para los genes TDH, TRH y TOX en las bacterias analizadas y el análisis de resistencia a antibióticos fue mayor al 65 % para algunas cepas, teniendo relación también con la época del año. / Tesis

Determina la presencia de B. coli en cerdos procedentes de cinco chancherías clandestinas ubicadas en distritos de Lima y Callao (Callao, Carabayllo, San Juan de Lurigancho, San Juan de Miraflores y Huaral); así como de sus criadores. El estudio es de tipo descriptivo y de corte transversal. Se analizan 124 muestras fecales de cerdos y 12 de criadores de las cinco chancherías clandestinas. Las muestras son procesadas mediante los métodos directo y Baermann modificado por Lumbreras (1963); mientras que las muestras que resultaron negativas son cultivadas siguiendo la Técnica Boeck - Drbohlav modificada, 1997. Este es el primer trabajo donde se demuestra la prevalencia alta de Balantidium coli en cerdos en 5 chancherías clandestinas y sus criadores. / Tesis

Determina los parámetros de calidad de Schinus molle L. “Molle” que está compuesto por -4.35 % de materias extrañas, 12 % de humedad, 7.2 % de cenizas totales, 30.44 % y 60 .29 % de sustancias solubles en agua y alcohol respectivamente. Analiza y caracteriza los aceites fijos y volátiles del fruto de Schinus molle L, así como la actividad antimicrobiana del aceite volátil. Obtiene 1.2 % de aceite fijo, el cuál presenta: punto de solidificación a 28 oc, punto de fusión a 52.8 oc e índices de acidez 2. 8, de saponificación 182, y de iodo 108. Se han identificado ácido octanoico, palmítico, esteárico, oléico, linoléico y patchouleno. Por hidrodestilación se obtuvo 2 .87 % de aceite volátil, en el cuál se determinó el índice de refracción 1.45, densidad 0 .8420, y los índices de acidez 2.4, éster 3.1- y fenoles 2.85. Se han identificado compuestos como α-pineno, canfeno, B-pineno, B-rnirceno, B-felandreno, D-limoneno, 3-careno, α-cariofileno, α-cubebeno y spatulenol. En la determinación de la actividad antimicrobiana del aceite volátil, realizada por el método de excavación en placa, se observó que Sraphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Micrococcus luteus son sensibles, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Acinetobacter sp. y Proteus vulgaris son poco sensibles, Klebsiella pneumoniae, Shigella jlexneri y Pseudomonas aeruginosa son resistentes. / Tesis

Detecta la presencia y determina la prevalencia de E. coli O157:H7 en Latuca sativa (lechuga) y Spinacea oleracea (espinaca), obtenidas de fundos agrícolas de la periferia de la ciudad de Lima. Se analizan 120 muestras de hortalizas, proveniente de 4 fundos de Lima; se utiliza la técnica del número más probable para la enumeración de E. coli, para la caracterización de E. coli O157:H7 se emplea el enriquecimiento selectivo, el análisis bioquímico y pruebas serológicas. Para determinar la presencia de los factores de virulencia shigatoxina (stx) e intimina (eaeA) se emplea el método de PCR en tiempo real. Para la entero hemolisina se realiza la prueba de hemólisis. Del total de muestras recolectadas (120), el 13,33 %(16) resulta positivo para E. coli O157:H7, el 1,67 %(2) presenta E. coli O157 no H7. De las 16 cepas (13,33 %) de E. coli O157:H7 se obtienen las siguientes secuencias de factores de virulencia: 3 (2.50 %) stx - / eaeA + y Hem - ; 8 (6,65 %) stx +/ eaeA + y Hem -; 2 (1,67 %) stx + / eaeA + y Hem +; 2 (1,67 %) stx + / eaeA - y Hem -; y 1 (0,83 %) stx - / eaeA + y Hem +. Así mismo el 86,67 % resulta negativo para E. coli O157:H7. El estudio revela la presencia de E. coli O157:H7 con una prevalencia del 13,33 % en hortalizas de fundos agrícolas de la periferia de la ciudad de Lima. / Tesis