En este curso el alumno basándose en la curiosidad innata del ser humano, adentrará en el conocimiento profundo de la Biología y Bioquímica, a fin de obtener la base necesaria que le permita enfrentar los cursos posteriores que se desarrollarán en los siguientes años de su carrera. El objeto de esta guía es encaminar al alumno, bajo la dirección del Docente, por el mundo biológico desde lo más simple a lo complejo; la guía consta de una parte introductoria, con indicaciones generales a tomar en cuenta en todas las prácticas, y las indicaciones específicas por tema a desarrollar.

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En la siguiente Tesis Doctoral hemos analizado la influencia de la testosterona (T) exógena sobre el metabolismo de esteroides sexuales y la fisiología de la gónada de la dorada (Sparus aurata L.). Además hemos descrito la presencia de un mecanismo de procesamiento alternativo del ARN, para el receptor de andrógenos (AR), cuya expresión varía con el estado reproductor y se correlaciona con el nivel de T. Esta forma truncada del AR está presente en los granulocitos acidófilos (GAs), descubriéndonos así nuevos mecanismos de regulación en la biología de los neutrófilos de vertebrados. El uso de la dorada como ejemplar de estudio se debe a que es una especie de alto interés comercial en el Mar Mediterráneo. La dorada es un teleósteo marino que presenta un hermafroditismo protándrico, siendo los ejemplares machos durante sus dos primeros años de vida, y pudiendo cambiar de sexo a partir del segundo año. El ciclo reproductor (CR) de los ejemplares macho se caracteriza por presentar cuatro etapas secuenciales: espermatogénesis (ES), puesta (P), post-puesta (PP) y quiesciencia (Q) durante el primer CR. La etapa de Q es sustituida por una etapa de involución testicular (IT), en el segundo CR que permite el cambio de sexo. Tras la puesta, el testículo suele sufrir una serie de cambios morfológicos, entre los que se encuentra una infiltración masiva de leucocitos, la cual es mayor en la etapa IT, antes del cambio de sexo. En primer lugar, quisimos comprobar la capacidad de la T exógena para modificar el balance de las hormonas sexuales esteroideas y la fisiología de la gónada. Con este fin, incorporamos la T en las doradas utilizando el sistema de micropartículas in situ (ISM) (T-ISM). La T exógena promueve un incremento supra-fisiológico en los niveles plasmáticos de T y una disminución de los niveles de 17β-estardiol (E2). Sin embargo, no se vieron alterados los niveles de 11-cetotestosterona (11KT). La T, además, bloquea la proliferación de las células germinales del testículo aunque el incremento en la expresión del gen que codifica para dmrt1 podría prevenir la eliminación completa de las células germinales. Por otra parte, comprobamos que los andrógenos, al igual que había sido demostrado para los estrógenos, están implicados en la migración de leucocitos hacia la gónada. Además, la T de los T-ISM promueve una disminución de la expresión de los genes que codifican receptores Toll-like (tlrs), quedando inhibida la capacidad de reconocer y responder a patógenos. Posteriormente, identificamos una variante, constitutivamente activa, del AR que carece de dominio de unión al ligando (ARΔLBD) en testículo y riñón cefálico (RC) de dorada y su expresión varía con el estado reproductor y con los niveles plasmáticos de testosterona. Esta variante se forma por un procesamiento alternativo del ARNm del AR. Nuestros datos sugieren que este procesamiento alternativo es capaz de modificar la fisiología del testículo, debido a que los andrógenos son capaces de modular el procesamiento alternativo del AR. Además, los andrógenos, concretamente la T, es capaz de regular la respuesta inmunitaria a través de la variante ARΔLBD. Otro dato interesante es que sólo los AGs expresan esta forma truncada mientras que los macrófagos (MØs) no la expresan. Además, el procesamiento alternativo del AR también no sólo se ve modulado por T, sino también por estímulos inmunitarios, aunque esta modulación depende del estado reproductor de los individuos. Todos estos datos nos indican una interacción entre los estímulos endocrinos e inmunitarios en la regulación del procesamiento alternativo del AR así como de las funciones de los AGs. Además, la T podría estar implicada en los cambios fisiológicos de la gónada a través de la regulación del ARΔLBD. / During the development of this thesis, we want to analyze the effect of exogenous androgens, mainly testosterone (T), and the activity of androgen receptor (AR) in immune-reproductive interaction in the sparidae, gilthead seabream (Sparus aurata L.). Furthermore, we described the presence of a mechanism, in which the unique AR gene can give diverse transcripts either in testis or immune organs. The gilthead seabream is a marine, protandrous teleost fish with significant economic value in the Mediterranean aquaculture. The specimens of this specie are male during the two first years, and present a reproductive cycle (RC) divided in four stages. In first RC, the stages are spermatogenesis (SG), spawning (S), post-spawning (PS) and resting (R); in the second RC, the last stage is substituted by testicular involution (TI) stage. After spawning there are various changes in gonad, between which are a massive infiltration of leukocytes, being higher in TI and that can lead to sex change. For this motive this specie can being used as a model for studying the immune-reproductive interactions. In first place, we wanted to observe the capacity of exogenous T to modify the balance of sex steroid hormones and on the physiology of the gonad (proliferation, apoptosis, leukocyte influx and immune status) of mature male specimens of the gilthead seabream. To this end, we used the in situ forming microparticle (ISM) system, which delivers sex steroids without promoting significant physiological alterations in gilthead seabream and that has been previously used in our laboratory to show that T modulates the inflammatory response of head kidney (HK) leukocytes in the gilthead seabream. The results suggest that in mature males, exogenous T can blocked the cell proliferation and increase the migratory influx of leukocyte, although decrease the ability to recognize and response to pathogens. Secondly, we identified a truncated form of the AR generated by alternative splicing that lacks the ligand-binding domain (ARΔLBD) either in testis, HK and acidophilic granulocytes (AGs). We studied the modulation of this variant by androgens and immune stimulus in order to demonstrate its mediation in the role of androgens in the immune response. The results showed that T is able to regulate the testicular morphology through the modulation of the expression of ARΔLBD variant. Furthermore, T was also able to regulate the immunecompetence through ARΔLBD variant. Interestingly, ARΔLBD variant only is expressed in AGs but no in macrophages (MØ). Furthermore, the stimulation with bacterial DNA, also regulated the alternative splicing of AR, but depending of the reproductive stage. These data suggest a crosstalk between endocrine and immune stimuli in the regulation of AR alternative splicing and AGs function. Furthermore, T might be implicated, in the migratory influx into gonad and the physiological changes in gonad through by means of regulation of ARΔLBD.

Objetivos. En el presente trabajo se han cumplido dos objetivos concretos: 1. Desarrollo de un nuevo sistema chivato basado en la luciferasa para el estudio de promotores tanto constitutivos como inducibles en el contexto de un organismo completo. 2. Estudio del papel extracurricular del componente de ARN de la telomerasa (TR) en la hematopoyesis usando el pez cebra como modelo. - Metodología. Embriones de pez cebra han sido manipulados genéticamente mediante la microinyección de plásmidos, morfolinos y ARN (solos o en combinación) en el estadío de desarrollo de 1-8 células para recrear las distintas condiciones experimentales de estudio. Para el abordaje del primer objetivo, el estudio de la actividad promotora en el contexto de un organismo completo se ha llevado a cabo mediante la medida de luminiscencia. Para el cumplimiento del segundo objetivo, el recuento de los distintos tipos de células sanguíneas en las distintas condiciones experimentales se ha abordado mediante la tinción específica con TSA (neutrófilos) o con o-dianisidina (eritrocitos), o mediante el uso de distintas líneas de pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes en neutrófilos y en macrófagos. La funcionalidad de los neutrófilos se ha estudiado mediante ensayos de reclutamiento a una herida y de respuesta a una infección bacteriana. El estudio de la actividad telomerasa se ha realizado mediante una técnica específica y cuantitativa llamada Q-TRAP basada en la amplificación de la secuencia telomérica, y la longitud de los telómeros se ha cuantificado mediante Q-FISH, que consiste en una hibridación in situ con una sonda telomérica fluorescente. El estudio de la expresión de genes se ha llevado a cabo mediante RT-PCR y PCR a tiempo real, y también mediante hibridación in situ con sondas de ARN. Peces cebra han sido mantenidos según se indica en el manual del pez cebra. Todos los experimentos cumplen con la directiva de la Unión Europea (86/609/EU) y han sido aprobados por el Comité de Bioética del Hospital Clínico Universitario “Virgen de la Arrixaca” (España) y por el Comité Institucional del Cuidado y Uso Animal del Hospital Infantil de Boston (EEUU). - Resultados y conclusiones. Para el desarrollo del primer objetivo se combinaron las ventajas que tiene el ensayo clásico de la doble luciferasa con las que tiene el pez cebra como modelo vertebrado para desarrollar una técnica que permita analizar la actividad promotora y la función génica en el contexto de un organismo completo. El resultado fue una técnica rápida y sensible que puede ser utilizada como una nueva herramienta para caracterizar in vivo la mínima región promotora de un gen, la respuesta de promotores inducibles ante distintos estímulos, la validación de construcciones genéticas y la función de un gen de interés. La técnica desarrollada resulta muy valiosa cuando se combina con las ventajas que ofrece el pez cebra para hacer escrutinios a gran escala basados en el fenotipo, convirtiéndose en un sistema muy prometedor para la identificación y la validación de fármacos o genes que, por ejemplo, reviertan el fenotipo. El desarrollo del segundo objetivo de esta tesis muestra varias evidencias que apoyan al pez cebra como modelo para estudiar el papel del componente de ARN de la telomerasa (TR) en la disqueratosis congénita, que es una enfermedad hereditaria de envejecimiento prematuro, cuyos pacientes mueren principalmente debido al fallo de la médula ósea. En este modelo, la inhibición genética de TR resultó en la afectación de la mielopoyesis, a pesar de que el desarrollo de las células madre hematopoyéticas fue normal. Sorprendentemente, la neutropenia causada por la ausencia de TR fue independiente de la longitud telomérica y de la actividad telomerasa. El análisis genetico mostró que TR modula la decisión del destino mieloide/eritroide mediante el control de los niveles de los factores de transcripción mieloide y eritroide spi1 y gata1, respectivamente, mediante la estimulación de gcsf y mcsf. Este modelo de pez cebra deficiente en TR ilumina el papel extracurricular de TR, y podría establecer dianas terapéuticas para la disqueratosis congénita. / The zebrafish (Danio rerio) as a model to study in vivo the role of telomerase in hematopoiesis - Objectives. The specific objectives of the present work are: 1. Development of a new luciferase-based reporter system for studying both constitutive and inducible promoters in the context of a whole organism. 2. Study the non-canonical role of the telomerase RNA component (TR) in hematopoiesis using the zebrafish. - Methodology. Zebrafish embryos were genetically modified by injecting plasmids, morpholinos and RNA (alone or in combination) whitin the 1- to 8-cell developmental stage to simulate the different experimental conditions. For approaching the first goal, the study of the promoter activity in the context of a whole organism was carried out by measurement of luminiscence. To addressing the second goal, the counting of the different blood cells in the different experimental conditions was carried out by specific staining with TSA (neutrophils) or o-dianisidine (erythrocytes), or by using different transgenic zebrafish lines expressing fluorescent proteins in neutrophils or macrophages. The neutrophil functionality was studied by quantifying the recruitment to a wound and the response to a bacterial infection. The telomerase activity was determined by using a specific and quantitative assay based in the amplification of the telomere sequence and called Q-TRAP, and the telomere length was quantified by a whole-mount in situ hybridization with a fluorescent telomeric probe (Q-FISH). The study of gene expression was carried out by RT-PCR and real time PCR, and also by in situ hybridization with RNA probes. Zebrafish were maintained as described in the zebrafish handbook. The experiments performed comply with the Guidelines of the European Union Council (86/609/EU). Experiments and procedures were performed as approved by the Bioethical Committee of the University Hospital “Virgen de la Arrixaca” (Spain) and by the Children's Hospital Boston institutional Animal Care and Use Committee (USA). - Results and conclusions. Firstly, we have adapted the classical dual luciferase reporter assay from cell lines to whole zebrafish embryos/larvae. The result is a rapid and sensitive technique that can be used as a new tool to characterize the minimum promoter region of a gene as well as the in vivo response of inducible promoters to different stimuli. We have illustrated the usefulness of this system for studying both constitutive and inducible promoters. This assay has several advantages compared with the classical in vitro (cell lines) and in vivo (transgenic mice) approaches. Among others, the assay allows a rapid and quantitative measurement of the effects of particular genes or drugs in a given promoter in the context of a whole organism and it can also be used in high throughput screening experiments. We have showed several evidences supporting the zebrafish as a new model to study the role of the telomerase RNA component (TR) in DC, which is an inherited premature disease whose patients usually die of bone marrow failure. In this model, genetic depletion of TR results in impaired myelopoiesis, despite normal development of hematopoietic stem cells (HSCs). Interestingly, the neutropenia caused by TR depletion is independent of telomere length and telomerase activity. Genetic analysis shows that TR modulates the myeloid-erythroid fate decision by controlling the levels of the master myeloid and erythroid transcription factors spi1 and gata1, respectively, through stimulation of gcsf and mcsf. This model of TR deficiency in the zebrafish illuminates the non-canonical roles of TR, and could establish therapeutic targets for DC.

En este curso el alumno basándose en la curiosidad innata del ser humano, adentrará en el conocimiento profundo de la Bioquímica, a fin de obtener la base necesaria que le permita enfrentar los cursos posteriores que se desarrollarán en los siguientes años de su carrera. El objeto de esta guía es encaminar al alumno, bajo la dirección del Docente, por el mundo biológico desde lo más simple a lo complejo; la guía consta de una parte introductoria, con indicaciones generales a tomar en cuenta en todas las prácticas, y las indicaciones específicas por tema a desarrollar.

En este curso el alumno basándose en la curiosidad innata del ser humano, adentrará en el conocimiento profundo de la Bioquímica, a fin de obtener la base necesaria que le permita enfrentar los cursos posteriores que se desarrollarán en los siguientes años de su carrera. El objeto de esta guía es encaminar al alumno, bajo la dirección del Docente, por el mundo biológico desde lo más simple a lo complejo; la guía consta de una parte introductoria, con indicaciones generales a tomar en cuenta en todas las prácticas, y las indicaciones específicas por tema a desarrollar.

Esta Tesis estudia la caracterización de diferentes receptores purinérgicos, principalmente P2X7, en células presentadoras de antígeno de la estirpe mieloide mononuclear fagocítica (monocitos, macrófagos peritoneales y macrófagos derivados de médula ósea). En concreto, se determina como la señalización purinérgica afecta a la diferenciación de los macrófagos, la producción de eicosanoides y de TNF-α, en estados tanto pro-inflamatorias y como de inmunosupresión. Para ello, se emplearon diferentes estímulos celulares; señales de patógenos, principalmente lipopolisacarido (LPS) bacteriano, señal que activa a los macrófagos a través de los receptores tipo toll 4; y señales de daño celular, principalmente ATP y adenosina. Siendo los objetivos concretos de esta Tesis: 1) Estudiar cómo afecta la señalización purinérgica a la diferenciación de los macrófagos; 2) Analizar la relación entre la activación del receptor P2X7 en macrófagos y la producción de eicosanoides; 3) Determinar cómo el receptor P2X7 regula la liberación del factor de necrosis tumoral (TNF)-α en macrófagos extenuados. La metodología empleó macrófagos peritoneales humanos y monocitos de sangre periférica de donantes sanos y pacientes con un proceso séptico severo de origen abdominal; muestras de ratones de la cepa C57BL/6 y deficientes para los receptores a estudio (P2rx7-/- y P2rx4-/-) que se emplearon para estudios tanto in vivo como in vitro. En la mayoría de ensayos se emplearon macrófagos derivados de médula ósea de ratón. Los diferentes macrófagos fueron sometidos a distintos protocolos de estímulo según el objetivo abordado: diferentes dosis de LPS para estudiar la respuesta ante situaciones inflamatorias, o polarización de macrófagos a M1 con LPS e interferon-o a M2 con interleuquina (IL)-4, para en todos los casos estimular con un nucleótido. De los estudios in vitro se analizó la cantidad de IL-1β, TNF-α, prostaglandina (PG) E2, tromboxano A2 y leucotrieno B4 liberada al medio mediante la técnica ELISA, la muerte celular cuantificando la actividad de lactatodehidrogenasa en los sobrenadantes celulares; la viabilidad celular mediante ensayos de reducción meatabólica del bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol; la cuantificación de la expresión relativa de los genes que codifican para los diferentes receptores y marcadores citoquímicos de interés, empleando la técnica de PCR-transcriptasa reversa a tiempo real, la cuantificación de marcadores de membrana específicos de macrófagos mediante citometría de flujo, y finalmente la actividad de la enzima convertidora de TNF-α (TACE) y la actividad catepsina B, mediante técnicas fluorométricas. Los estudios in vivo realizados en ratón analizaron la actividad del receptor P2X7 tras la administración intraperitoneal de LPS, cuantificando IL-1β y TNF-α en lavados peritoneales empleando la técnica ELISA, la presencia de ATP extracelular en peritoneo se cuantificó mediante bioluminiscencia, y la medición de la temperatura rectal en un modelo inducido de sepsis mediante una sonda térmica. Resultados y conclusiones: En esta Tesis se demuestra que la señalización purinérgica es capaz de reducir el número de macrófagos diferenciados de médula ósea, resultando en una regulación positiva de ciertos marcadores M2, derivando en un fenotipo específico de macrófago. En los macrófagos maduros, la activación de P2X7 induce la liberación del mediador lipídico PGE2, siendo P2X7 importante en la respuesta febril, un signo clásico asociado con el proceso inflamatorio. Además, la señalización mediante el receptor P2X7 en macrófagos M1 extenuados es capaz de controlar la liberación clásica de TNF-α. Estos resultados tienen implicaciones clínicas, ya que el receptor P2X7 emerge como una diana terapéutica prometedora para la fiebre y su potenciación durante inmunosupresión podría aumentar la inmunidad en los procesos sépticos. / This Thesis studies the characterization of different purinergic receptors, mainly P2X7, analyzing their functions in antigen presenting cells of mononuclear phagocytic myeloid lineage (monocytes, peritoneal macrophages and bone marrow derived macrophages). Precisely, the Thesis determine how purinergic signaling affects macrophage differentiation, eicosanoids and tumor necrosis factor (TNF)-α release, during both proinflammatory and immunosuppressive conditions. Therefore, cells were treated with bacterial products, mainly lipopolysaccharide (LPS), which specifically activates Toll-like receptor 4, and signals of cell damage, mainly ATP and adenosine. Objectives: 1) To study how purinergic signaling affects macrophage differentiation; 2) To analyze the association between the activation of P2X7 in macrophages and the production of eicosanoids; 3) To identify how P2X7 receptor regulates TNF-α release during immune extenuation. Methods: The experiments were performed using peritoneal human macrophages and peripheral blood monocytes of healthy subjects and patients with severe sepsis; mice samples from strain C57BL/6 and the knockout for the genes encoding the receptors to study (P2rx7-/- and P2rx4-/-), these mice were used for both in vivo and in vitro studies. Mice bone marrow derived macrophages were used in almost all the experiments of this thesis. The different macrophages were stimulated with different protocols to address the different objectives: different doses of LPS to mimic inflammatory conditions; LPS and interferon- to polarize macrophages to M1 and with interleukin (IL)-4 to polarize to M2. The amount of IL-1β, TNF-α, prostaglandin (PG) E2, thromboxane A2 and leukotriene B4 released, were measured by ELISA; cell death quantification was measured by the activity of lactate dehydrogenase in cells supernatants; macrophage viability was measured by the metabolic reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; relative expression of genes encoding for the desired receptors and markers was quantified by real-time reverse-transcription PCR; the quantification of specific macrophage membrane markers was analyzed by flow cytometry; the converting TNF-α enzyme (TACE) and cathepsin B activity were measured by fluorometric techniques. In vivo mouse studies to study P2X7 receptor activity after intraperitoneal administration of LPS was analyzed by ELISA, measuring IL-1β and TNF-α in peritoneal lavage; detection of extracellular ATP in peritoneum was quantified by bioluminescence; rectal temperature was measured in a sepsis model. Results and Conclusions: this Thesis demonstrates that purinergic signaling is able to reduce the number of differentiated macrophages from bone marrow, which display upregulation of certain M2 markers, resulting in a specific phenotype of macrophage. In mature macrophages, ATP activating P2X7 receptor induces the release of the lipid mediator PGE2, being P2X7 important for the febrile response, a classical signal associated with the inflammatory process. Furthermore, P2X7 receptor signaling in extenuated M1 macrophages is able to control the classical release of TNF-α. These findings have important clinical implications, since P2X7 receptor emerges as a promising target for fever, however its potentiation during immunosuppression could boost immunity in septic processes.

El documento digital no refiere un asesor / Establece la tendencia histórica de los factores en la dinámica del dengue en la ciudad de Guayaquil, durante el período 2008 - 2013. Utilizando un estudio observacional, de tipo descriptivo ecológico. En sus resultados, coincide que en la época de invierno se encuentra el mayor número de casos, pero con presencia durante todo el año; y al paso de los años 2010 y 2012 fueron de mayor incidencia, con una variabilidad en su comportamiento. Las variables ambientales mostraron hallazgos, en el que a más temperatura, con humedad por encima del 70% y escasos vientos, estos provocan condiciones para que pueda existir un incremento en la transmisión de la enfermedad. Además, los picos epidémicos de dengue presentados en los dos primeros períodos de cada año se relacionan en los mismos períodos con los índices de Breteau elevados considerados de alto riesgo, pudiendo influir en la transmisión de la enfermedad. Se comprueba la presencia de los 4 serotipos de virus circulante de dengue en Guayaquil, considerándose la existencia de circulación simultánea de DEN1, DEN2, y DEN4 durante los últimos 3 años. Por la historicidad de lo acontecido anteriormente en Guayaquil sobre la existencia del virus y personas susceptibles con infecciones previas, se ha creado una situación que pone en riesgo de dengue grave en un futuro próximo. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Identifica las especies de trematodos en Dives warszewiczi de Tambogrande, Piura. Las aves fueron capturadas utilizando redes de niebla. Se colectaron trematodos de la cloaca y vesícula biliar, algunos se fijaron en alcohol de 70% y colorearon con carmín acético de semichon, para su estudio a microscopía óptica. Para la microscopía electrónica de barrido los especímenes se fijaron en glutaraldehído al 4%. Los trematodos estudiados han sido identificados como Conspicuum peruvianus n.sp. y Prosthogonimus ovatus. Se determina una nueva especie para el género Conspicuum y se reporta a D. warszewiczi como nuevo hospedero para P. ovatus. Dives warszewiczi ( Passeriformes, Icteridae) (Cabanis, 1861) es una ave silvestre que se distribuye en el Norte del Perú, se le conoce comúnmente como “negro fino”, son observadas en zonas urbanas e inclusive tratadas como aves ornamentales. / Tesis

La arquitectura del genoma y la estructura de la cromatina, junto con los factores de transcripción son actores clave para la autorenovación, la pluripotencia y la diferenciación de las células madre embrionarias (ESCs). Combinando una microscopía cuantitativa de super-resolución (STORM) con simulaciones numéricas hemos sido capaz de definir cómo los nucleosomas están empaquetados en vivo, y hemos identificado un nuevo modelo de organización de la fibra de cromatina. Encontramos que la fibra de cromatina está formada por grupos de nucleosomas de diferentes tamaños, que llamamos "nucleosome clutches" y que estos están intercalados con regiones sin nucleosomas. Además, el número medio de nucleosomas y su nivel de compactación dentro de los clutches, está relacionado con el estado celular. Células madre pluripotentes, tienen en promedio clutches con menos nucleosomas incluidos y de menos densidad con respecto a las células diferenciadas. / Nuclear architecture and chromatin structure, together with the transcriptional network are key players for self-renew, pluripotency and differentiation of embryonic stem cells (ESCs). Combining quantitative super-resolution microscopy (STORM) with computer simulations we resolved how nucleosomes are arranged in vivo, identifying a novel model of organization of the chromatin fiber. We found that chromatin fiber is formed by groups of nucleosomes of varying sizes, which we term “clutches” and these were interspersed with nucleosome-depleted regions. Moreover the median number of nucleosomes and their compaction inside clutches highly correlated with cellular state. Ground-state pluripotent stem cells had, on average, less dense clutches containing fewer nucleosomes with respect to differentiated cells.