La Ca2+-ATPasa de RS puede hidrolizar ATP a través de una ruta alternativa en la que solo intervienen conformaciones de la proteína que no unen Ca2+. El mecanismo molecular de esta actividad hidrolítica implica un cambio conformacional inducido por ATP que produce aproximaciones de los dominios citosólicos. El uso de indicadores fluorescentes y compuestos que movilizan Ca2+ permite caracterizar flujos y depósitos intracelulares de Ca2+ que están implicados en la generación de señales intracelulares de Ca2+ en células H9c2. La mitocondria es capaz de interpretar señales citosólicas de Ca2+ que se generan en el retículo sarco-endoplásmico (RSE). El efecto apoptótico que se observa en presencia del inhibidor Tapsigargina (TG) es dependiente de la concentración usada. La muerte celular se produce antes cuando TG provoca apertura del poro de permeabilidad transitoria mitocondrial. El daño producido en el RSE activa la ruta apoptótica mitocondrial con participación de cas pasa 8 en un lazo que amplifica la cascada degradativa de las caspasas. Las células disponen de mecanismos alternativos de muerte celular en los que no participan caspasas.

En este curso el alumno basándose en la curiosidad innata del ser humano, adentrará en el conocimiento profundo de la Bioquímica, a fin de obtener la base necesaria que le permita enfrentar los cursos posteriores que se desarrollarán en los siguientes años de su carrera. El objeto de esta guía es encaminar al alumno, bajo la dirección del Docente, por el mundo biológico desde lo más simple a lo complejo; la guía consta de una parte introductoria, con indicaciones generales a tomar en cuenta en todas las prácticas, y las indicaciones específicas por tema a desarrollar.

En este curso el alumno basándose en la curiosidad innata del ser humano, adentrará en el conocimiento profundo de la Bioquímica, a fin de obtener la base necesaria que le permita enfrentar los cursos posteriores que se desarrollarán en los siguientes años de su carrera. El objeto de esta guía es encaminar al alumno, bajo la dirección del Docente, por el mundo biológico desde lo más simple a lo complejo; la guía consta de una parte introductoria, con indicaciones generales a tomar en cuenta en todas las prácticas, y las indicaciones específicas por tema a desarrollar.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Investiga 15 bacterias con potencial PGPR (bacterias promotoras de crecimiento vegetal) seleccionadas del banco de cepas del laboratorio con el objetivo de caracterizar y cuantificar la expresión de los genes aos, erf2 y pr-p2 que están relacionados con la activación de la respuesta celular defensiva en plantas de tomate inoculadas con PGPR durante la infección del patógeno / Tesis

Las fórmulas infantiles desempeñan un papel indispensable sobre todo después de 4 a 6 meses de vida de un recién nacido ya que la leche materna ya no es suficiente para satisfacer todas las necesidades nutricionales a esta edad. Aunque las fórmulas infantiles deben ser similares a la leche materna madura en términos de sus macronutrientes y micronutrientes, por lo general no tienen, ni cualitativa ni cuantitativamente, los ingredientes funcionales que se encuentran en la leche humana, ni tienen la misma composición de proteínas y la diversidad de oligosacáridos de la leche materna. Por lo tanto, es muy importante agregar estos ingredientes de las fórmulas infantiles. La evolución en la composición las fórmulas infantiles con mejoras en sus procesos de fabricación permiten ejercer más efectos positivos en un grupo grande de los recién nacidos que no pueden ser alimentados con leche materna como fuente primaria por distintas causas. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio ha sido evaluar la funcionalidad de lactoferrina humana recombinante (rhLf), hidrolizada de rhLf y GOS en las fórmulas infantiles. A este fin, el estudio se dividió en cuatro experimentos: 1. Objetivos de la tesis 1. Evaluación in vitro de la biodisponibilidad del hierro de las fórmulas infantiles suplementadas con diferentes concentraciones de rhLf y/o GOS, usando la cantidad de ferritina sintetizados por las células Caco-2 como criterio. 2. Evaluación in vitro del efecto anti-inflamatorio de diferentes concentraciones de rhLf y el hidrolizado de rhLf. 3. Evaluación in vitro de la actividad prebiótica de rhLf y/o GOS. 4. Evaluación in vitro del efecto de la digestión simulada in vitro sobre la fraccionación de rhLf y el perfil de los ácidos grasos de cadena larga (LCFAs). 2. Metodolgía 1. Diseño de fórmulas infantiles con la suplementación de rhLf y/o GOS con leche materna madura como un modelo. 2. En la digestión simulada in vitro de muestras suplementadas con diferentes concentraciones de rhLf y/o GOS para determinar la (bio)-disponibilidad del hierro de fórmula infantil mediante células Caco-2 (Frontela et al., 2009). Un kit de ELISA se usa para cuantificar la ferritina formada por las células la que se utiliza como un criterio de la disponibilidad de hierro. 3. En la digestión simulada in vitro de las muestras, los digeridos obtenidos se guardaron para investigar el efecto in vitro de la digestión sobre la fraccionación de rhLf y el perfil de los ácidos grasos de cadena larga mediante el análisis de western blot, HPLC-masas y GC. 4. Para investigar los efectos anti-inflamatorios de rhLf y el hidrolizado de rhLf, se utilizaron dos tipos de células Caco-2 y RAW 264.700 (Tanoue et al., 2008) y con el estímulo de las células de RAW 264.700 por el lipopolisacárido (LPS) (de la Escherichia coli). En este modelo, el efecto del LPS en la monocapa de células y el efecto anti-inflamatorio de rhLf y el hidrolizado de rhLf pueden visualizarse utilizando la determinación de algunos parámetros: TEER, ROS, IL-8 y NO. 5. Para investigar el efecto prebiótico de rhLf y/o GOS mediante cultivos por lotes utilizando como sistema de fermentación, se midieron algunos parámetros como el pH y los ácidos grasos de cadena corta. 3. Conclusiones y trabajo del futuro 1. Además de los transportadores específicos de hierro hemo y no-hemo para la absorción de hierro en las células duodenales, se ha demostrado que rhLf tiene un sitio específico para la absorción de formas ferrosos y férricos de hierro. Los resultados obtenidos del estudio llevado a cabo con células Caco-2 modelo confirmó la importancia de la suplementación de las fórmulas infantiles con Lf y GOS que llevó a aumentar ferritina formada por los cultivos celulares. Los resultados confirmaron que la solubilidad no es el único factor correlacionado con la mejora de la biodisponibilidad del hierro, por lo tanto, es útil investigar el papel de algunos genes relacionados con la biodisponibilidad del hierro como DMT1. 2. rhLf y su hidrolizado ejercen su actividad anti-inflamatoria a través de su capacidad para unirse a LPS y posteriormente modular la producción de citoquinas. El mecanismo de acción de Lf también depende en gran medida de su capacidad para influir en las respuestas tempranas, incluyendo la modulación de la producción de ROS intracelular. La actividad anti-inflamatoria de rhLf y el hidrolizado de rhLf, esta última se ha mostrado más eficaz y es considerado como un destacado agente terapéutico que se debe tener en cuenta durante el diseño de las fórmulas infantiles. 3. Los resultados del estudio llevado a cabo con cultivos por lotes utilizando como sistema de fermentación ha mostrado que tanto la rhLf y/o GOS influyen en la obtención de productos finales de fermentación como los ácidos grasos de cadena corta, este proceso fermentativo además lleva a la disminución de bacterias patógenas y de forma complementaria el incremento de las bacterias bifidogénicas. 4. Los resultados obtenidos confirmaron que rhLf es más estable que Lf humana, por lo que se considera un factor importante para la suplementación de las fórmulas infantiles. Aunque se necesitan estudios complementarios para descubrir y detectar esta característica, los resultados propuestos un papel de GOS a proteger Lf contra las enzimas digestivas. Del mismo modo, los resultados obtenidos confirman la importancia de la lactancia materna relacionada a los ácidos grasos liberados por la digestión. 5. En conjunto, los resultados obtenidos confirman y apoyan la urgente necesidad de suplementación con Lf y/o GOS de las fórmulas infantiles. Los resultados demostraron la importancia del hidrolizado de rhLf como un nuevo aditivo y puede ser en un futuro próximo nuevas fórmulas contienen el hidrolizado de rhLf será visto en los mercados. / Infant formulas, as milk substitute, play an indispensable role especially after 4-6 months of infant life where human milk is no longer sufficient to meet all necessary nutritional requirements. Although infant formulas should be similar to mature human milk in terms of its macronutrients and micronutrients, normally it do not have the functional ingredients that are found in human milk, nor do they have the same protein composition and the diversity of oligosaccharides as human milk. So it is critically important adding these ingredients to infant formulas. This evolution of infant formulas manufacturing allow to exert more functionalities in a large group of infants who cannot feed human milk as a primary source and for several physiological as well as social reasons. For mimicking the structure of human milk, galactooligosaccharides (GOS, as prebiotic) and recombinant human lactoferrin (rhLf) are strongly added to infant formulas to obtain similar functionalities for what human milk has. Thus, the present study is aimed to explore the functionality of rhLf, rhLf hydrolysate and GOS whether alone or added in infant formulas. The present study is divided into four experiments: 1. Objectives of the PhD Thesis 1. In vitro assessment of the bioavailability of iron from infant formulas supplemented with different concentrations of rhLf and/or GOS, using the amount of ferritin synthesized as criteria 2. In vitro evaluation of the anti-inflammatory effect of different concentrations of rhLf and rhLf hydrolysate. 3. In vitro evaluation of the prebiotic activity of rhLf and/or GOS. 4. In vitro evaluation of the effect of simulated gastrointestinal digestion on the added rhLf fractionation and long chain fatty acids (LCFAs) profile. 2. Methodology 1. Design of infant formulas with the supplementation of rhLf and/or GOS with mature human milk as a model. 2. In the in vitro simulated digestion of samples supplemented with different concentrations of rhLf and/or GOS aimed to determine the (bio)-availability of iron of infant formula by using Caco-2cell model (Frontela et al., 2009). An ELISA kit for the analysis of ferritin formed by the cells which is used as a criterion of the availability of iron. 3. In the in vitro simulated digestion of supplemented samples, the digests were kept to investigate the effect of the in vitro digestion on the fractionation of rhLf and the profile of the long-chain fatty acids by using the western blot, HPLC-mass and GC. 4. To investigate the anti-inflammatory effects of rhLf and rhLf hydrolysate, it were used two types of cells are Caco-2 and RAW 264.7 (Tanoue et al., 2008) and with the stimulation of the RAW 264.7 cells by lipopolysaccharide (LPS) (from Escherichia coli). In this model, the effect of LPS on the monolayer of cells and the anti-inflammatory effect of rhLf and rhLf hydrolysate and can be viewed using the extent of some parameters: TEER, ROS, IL-8 and NO. 5. To investigate the prebiotic effect of rhLf and/or GOS by using batch fermentation culture system, some parameters were measured as pH and short-chain fatty acids. 3. Conclusions and future work 1. Beside heme and non-heme specific transporters for the absorption of iron in duodenal cells, it has been proved that rhLf has a specific site for the absorption of ferrous and ferric forms of iron. The obtained results of the study carried out using Caco-2 cell model confirmed the importance of the supplementation of infant formulas with rhLf and GOS where it led to increase ferritin formed by cell cultures. The results confirmed that solubility is not the only factor correlated with improvement of iron bioavailability, therefore it is useful investigate the role of some genes related with iron bioavailability such as rhLf hydrolysate exert their anti-inflammatory activity through its ability to bind LPS and subsequently modulate cytokine production. The mechanism of Lf’s action is also largely dependent on its ability to influence early responses, including the modulation of intracellular ROS production. Between rhLf and rhLf hydrolysate, rhLf is more effective and is considered a prominent therapeutic agent, which must to be taken into account during infant formulas design. 2. The results of study carried out using batch culture fermentation system proposed that rhLf and/or GOS influenced the fermentation end products such as SCFAs. This fermentation process lead to a decreasing of the pathogenic bacteria and complementary an increase of the bifidogenic ones. 3. The obtained results confirmed that rhLf is more stable than human Lf and thus it is considered a prominent factor for infant formulas supplementation. Although many studies are needed to discover this characteristic, the results proposed a role for GOS in protect rhLf against the digestive enzymes. Likewise, the results confirmed the importance of the breastfeeding pattern concerning with the released free fatty acids by digestion. 4. Overall, the obtained findings confirm and support the urgently need to supplementation with rhLf and/or GOS of infant formulas. The results demonstrated the importance of the hydrolysate of human recombinant lactoferrin as a new additive and may be in the near future new formulas contain the hydrolysate of rhLf will be seen in the markets.

El análisis del metaboloma presenta multitud de aplicaciones en el estudio de los sistemas biológicos debido a la disponibilidad actual de técnicas analíticas. En la presente memoria, se ha desarrollado una plataforma de perfil metabólico que incluye: la paralización del metabolismo celular (quenching), la extracción de los metabolitos intracelulares, el análisis cualitativo/cuantitativo de los metabolitos y el procesamiento de datos. Debido a que diversos metabolitos son extremadamente lábiles, se validó el protocolo de extracción de los mismos. Los resultados mostraron que el NADP(H), NAD(H),glutatión (GSH y GSSG), y la relación de AcetilCoA/CoA, se alteraban al incluir la liofilización en el proceso o el metanol/agua como disolvente de extracción. En consecuencia, el protocolo basado en ACN/CHCl3 resultó ser el más eficiente y se aplicó en el estudio de diversos sistemas biológicos (Capítulos 2-5). En el Capítulo 2, se aplicó el análisis metabólico para el estudio de los mecanismos de resistencia a la quimioterapia. Se determinaron 21 metabolitos por LC-UV en las líneas celulares: L1210 (sensible a daunomicina, DNM), L1210R (resistente a múltiples fármacos) y CBMC-6 (expresa la glicoproteína P, P-gp), antes y después de la exposición a DNM. L1210R y CBMC-6 presentaron 5 y 2 veces, respectivamente, la concentración de GSH con respecto a L1210, lo cual se correlacionó con la alta supervivencia de estas células durante la exposición a DNM. Además, las relaciones NADH/NAD+, AcCoA/CoA, la carga energética (AEC), entre otros, resultaron mayores en L1210R que en L1210. Curiosamente, las células CBMC-6 presentaron un comportamiento intermedio entre las otras dos, posiblemente debido a la presencia de la P-gp. En el capítulo 3, se analizó el metaboloma de hígados de ratas con la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), donde se cuantificaron por LC-MS más de 70 metabolitos. Los resultados mostraron diferentes perfiles metabólicos entre los hígados sanos y con EHGNA, en concordancia con los los biomarcadores clásicos. La alteración metabólica incluyó las moléculas redox (GSH, GSSG, NAD(P)(H)), y otros metabolitos como L-carnitina, CoA y diversos aminoácidos. En el Capítulo 4, se estudiaron los eventos metabólicos que tuvieron lugar en E. coli durante la exposición a altas concentraciones de NaCl durante un tiempo prolongado. Las alteraciones metabólicas intracelulares incluyeron aminoácidos, nucleótidos, metabolitos redox, L-carnitina, fosfato y derivados de CoA. Además, tuvo lugar un descenso muy pronunciado de las concentraciones de los aminoácidos extracelulares en el momento del choque osmótico. Los datos metabólicos se integraron con datos del análisis del transcriptoma por medio del análisis de rutas metabólicas (pathway-based analysis). Entre las vías alteradas se encontraron rutas del metabolismo central así como del GSH, aminoácidos y purinas. Además, se realizó el análisis de flujos metabólicos, mostrando una orientación hacia la síntesis de productos de fermentación, tales como etanol en el caso de NaCl 0.5M y lactato en el caso de NaCl 0.8M. En el Capítulo 5, se estudió la función de la deacetilasa de E. coli (CobB) en quimiostatos con acetato como única fuente de carbono. Se realizó el análisis del metaboloma y transcriptoma, y ambos conjuntos de datos se integraron por medio del análisis de rutas metabólicas. Los resultados obtenidos mostraron que los efectos más notables tuvieron lugar en el metabolismo del azufre y del nitrógeno, sugiriendo que el metabolismo del nitrógeno podría estar directa o indirectamente regulado por la acetilación de proteínas. En conclusión, la metabolómica ha sido utilizada con éxito en la presente Memoria en conjunción con la transcriptómica, la flujómica o biomarcadores clásicos. Asimismo, la cuantificación de cofactores redox, nucleótidos, coenzimas y aminoácidos es sumamente importante para la comprensión global del estado metabólico, siendo clave ATP, GSH, AcCoA, CoA y algunos aminoacidos ya que al menos uno de los mencionados ha resultado alterado en todas las situaciones descritas en esta Tesis a lo largo de los Capítulos 2-5. Además, algunas de las moléculas clave mencionadas como GSH, AcCoA, CoA y también NAD(P)H han resultado ser lábiles durante el proceso de extracción, de modo que es esencial el uso de un protocolo que no altere per se estos metabolitos. / Metabolome analysis is widely used in the study of biological systems due to the affordable analytical techniques currently available. A metabolic profile platform has been carefully developed, including quenching of the cell metabolism, extraction of the intracellular metabolites, qualitative/quantitative analysis and data processing. The metabolic quantification process has been thoroughly validated, including some commonly used steps such as lyophilization, since our results suggested that the ratios NADPH/NADP+, NADH/NAD+, GSH/GSSG and the AcetylCoA/CoA were modified when lyophilization was included in the extraction process or when methanol/water is used as the extraction solvent. To avoid this, a highly efficient extraction protocol based on ACN/CHCl3 was validated with standard mixtures. Then, the metabolome analysis was applied to the study of metabolic alterations in liver tissues or bacterial cultures. In Chapter 2, it is shown how metabolic analysis contributed to the better understanding of the chemotherapy resistance mechanisms. For that purpose, 21 metabolites were determined by LC/UV before and after DNM exposure in different murine cell line cultures: L1210 (sensitive to DNM), L1210R (multidrug-resistance phenotype, MDR) and CBMC-6 (L1210 transfected with the glycoprotein P, P-gp). P-gp is one of the known mechanisms of chemotherapy resistance since it is able to take out the drug outside the cell. The results showed that L1210R and CBMC-6 presented 5 and 2-fold, respectively, the concentrat on of GSH with respect to L1210, which suggest that this metabolite plays a protective role since it was correlated with the high survival percentage of these lines during DNM exposure. Additionally, the NADH/NAD+, AcCoA/CoA, adenylate (AEC), uricilate (UEC) and guanylate (GEC) energy charge ratios were always higher in L1210R than in L1210. Interestingly, CBMC-6 cells presented an intermediate behaviour between the other two due to the presence of the P-gp. In Chapter 3, the metabolome analysis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in rat livers was carried out with more than 70 metabolites being identified and quantified by LC/MS. The metabolic pattern showed clear differences between healthy and NALFD-livers attending to the diet and as assessed by classical biomarkers. Interestingly, the metabolic alteration included not only redox molecules (GSH, GSSG, NAD(P)(H)), as expected, but also other metabolites such as L-carnitine, CoA and amino acids. In Chapter 4, the long-term exposure of E. coli to osmotic stress has been studied from a metabolic point of view, where it was seen that intracellular metabolic levels were highly dependent on the NaCl concentration in the medium. The results obtained pointed to clear alterations in several metabolites, such as intracellular amino acids, nucleotides, redox coenzymes, acetyl phosphate and CoA derivatives. Moreover, the depletion of extracellular amino acids was measured when NaCl was added. These metabolic data were combined with the transcriptomic profile using integration pathway-based analysis, highlighting the main pathways affected, namely, GSH metabolism, glycolysis/gluconeogenesis, amino acid biosynthesis/degradation, purine metabolism, phosphorylative oxidation, and the TCA cycle/glyoxylate shunt. In addition, metabolic flux analysis pointed out a fermentation pattern that depended on the NaCl concentration. In Chapter 5, metabolome analysis was carried out to shed light on the role of the only known deacetylase of E.coli (CobB) in acetate-feeding chemostats. Moreover, transcriptomic analysis was performed and both data sets were integrated by using pathway-based analysis. The results showed the main effects were in both the sulfur and nitrogen pathways, including CoA, taurine, pyrimidines and several amino acid metabolisms, suggested that nitrogen metabolism is directly or indirectly regulated by protein acetylation. To conclude, metabolome analysis can be used in conjuction with other techniques such as transcriptomics, fluxomics or classical experiments. The quantification of redox cofactors, nucleotides, coenzymes and amino acids is highly important for the understanding of the whole metabolic state in biological systems being key metabolites GSH, ATP, AcCoA, CoA and some amino acids since at least one of them has resulted altered in any of the situations described along Chapters 2 to 5. Surprisingly, GSH, AcCoA, CoA and also NAD(P)H concentrations could be altered during the extraction process therefore the use of an appropriate extraction protocol has been proved to be essential.

Tesis por compendio de publicaciones / Zinnia elegans constituye uno de los sistemas modelos más útiles para estudiar la diferenciación en el xilema que incluye la síntesis de la pared celular secundaria, la lignificación de la pared celular, y la muerte celular programada. Además, el cultivo de células del mesófilo de Z. elegans in vitro también se ha utilizado como sistema modelo ya que la diferenciación de las células del mesófilo en traqueidas permite estudiar de manera sencilla la bioquímica y la fisiología de la xilogénesis alejados de la complejidad que imponen los tejidos vegetales. Por otra parte, Z. elegans ha resultado ser una excelente planta modelo para estudiar la implicación de las peroxidasas en la lignificación de la pared celular. Esto es debido a la simplicidad y dualidad del patrón de lignificación mostrado en los tallos e hipocotilos de esta planta y a la naturaleza básica de esta isoenzima de peroxidasa. Sin embargo, esta proteína no solo se expresa en hipocotilos y en tallos sino también en células que se encuentran en diferenciación en traqueidas. Por lo tanto, esta peroxidasa no solo cumple todos los requerimientos catalíticos impuestos para ser la candidata idónea implicada en la lignificación cumpliendo con todas las restricciones impuestas por la etapa de acoplamiento oxidativo de los alcoholes hidroxicinamilicos y polimerización, sino también debido a que su expresión es inherente en la lignificación. De hecho, su naturaleza básica no es excepcional ya que las peroxidasas básicas se expresan diferencialmente durante la lignificación en otros sistemas modelo, mostrando propiedades bioquímicas inusuales y exclusivas tales como la oxidación de las unidades siringilo. Esta Tesis se ha centrado en la realización de las actividades que conducen a un mejor entendimiento de la lignificación en Zinnia, comenzando con el estudio del patrón de lignificación, cómo se sucede este proceso, y la implicación de la peroxidasa, demostrando sus propiedades catalíticas inusuales y cómo esta enzima es regulada por el óxido nítrico (NO) y el H2O2. En relación a la producción de NO y H2O2 en los haces vasculares, utilizando la microscopía confocal láser de barrido, se observó un gradiente espacial de producción de NO inversamente relacionado con el grado de diferenciación del xilema ya que las células del xilema jóvenes, en diferenciación manifestaron una mayor capacidad para producir NO que las células del xilema completamente maduras y diferenciadas. Estos resultados demuestran la fuerte relación entre la producción de NO y la muerte celular programada que se produce durante la diferenciación del xilema y que precede a la lignificación de la pared celular. Además, la producción de NO en los cultivos celulares de mesófilo de Z. elegans que se diferencian a traqueidas, las células del mesófilo mantienen la misma propiedad mostrada por las células del xilema en diferenciación ya que la señal fluorescente se detectó, principalmente, en las células predeterminadas y en las que se encontraban en diferenciación. Por el contrario, las células aisladas del mesófilo que no habían adquirido la capacidad para diferenciarse a traqueidas, manifestaban unos niveles muy débiles de la señal fluorescente que contrastaba con la producción elevada mostrada por las células predeterminadas para diferenciarse a traqueidas. Por otra parte, mediante la utilización conjunta de técnicas de microscopía óptica y electrónica, se realizó un estudio detallado de los sitios de producción de H2O2 en el xilema en lignificación, comprobándose que en las células del xilema en diferenciación y en las células del parénquima adyacentes se localizaba la producción de H2O2 sugiriendo que estas células podrían ser las responsables de la producción de H2O2 que, posteriormente, difunde de célula a célula, a través del espacio intercelular hacia las células del xilema en diferenciación para que tenga lugar la biosíntesis de ligninas en la pared celular secundaria. Una evidencia adicional que apoyó la hipótesis planteada se obtuvo mediante la localización del H2O2 en los cultivos celulares de mesófilo de Z. elegans en diferenciación a elementos traqueales. Utilizando este sistema modelo junto con la microscopía confocal láser y el diacetato de diclorofluoresceína como sonda fluorescente, la producción de H2O2 se localizó mayoritariamente en las células del mesófilo predeterminadas para diferenciarse, detectándose un bajo nivel de H2O2 en las traqueidas completamente diferenciadas. / Zinnia elegans constitutes one of the most useful model systems for studying xylem differentiation, which simultaneously involves secondary cell wall synthesis, cell wall lignification, and programmed cell death. Likewise, the in vitro culture system of Z. elegans has been the best characterized since the differentiation of mesophyll cells into tracheary elements allows study the biochemistry and physiology of xylogenesis free from the complexity that heterogeneous plant tissues impose. Moreover, Z. elegans has resulted in an excellent plant model to study the involvement of peroxidases in cell wall lignification. This has been due to the simplicity and duality of the lignification pattern shown by the stems and hypocotyls, and to the basic nature of the peroxidase isoenzyme. This protein is expressed not only in hypocotyls and stems but also in mesophyll cells transdifferentiating into tracheary elements. Therefore, not only does this peroxidase fulfil all the catalytic requirements to be involved in lignification overcoming all restrictions imposed by the polymerization step, but also its expression is inherent in lignification. In fact, its basic nature is not exceptional since basic peroxidases are differentially expressed during lignification in other model systems, showing unusual and unique biochemical properties such as oxidation of syringyl moieties. This Thesis has focused on the experiments which led to a better understanding of the lignification process in Zinnia, starting with the basic knowledge about its lignin pattern, how lignification takes place, and the involvement of the basic peroxidase in the lignification process, demonstrating its unusual catalytic properties, and how this enzyme is regulated by nitric oxide and H2O2. In relation to the production of NO in the vascular bundles using confocal laser scanning microscopy, a spatial NO gradient inversely related to the degree of xylem differentiation was observed since differentiating xylem cells clearly manifest a higher capacity for NO production than differentiated xylem cells. In addition, the NO production in cultured mesophyll cells which are trans-differentiating in tracheary elements maintain the same property shown by differentiating xylem from the Z. elegans vascular bundles since the fluorescent probe was mainly observed in pro-differentiating thin-walled and differentiating (secondary cell wall forming) tracheary elements. By the contrary, mesophyll cells which have not acquired competence for trans-differentiation showed only background levels of triazolofluorescein green fluorescence. These results confirm that NO formation by tracheary elements is directly related to the early processes of xylem differentiation, which takes place immediately before the late processes of secondary cell wall formation and cell autolysis. On the other hand, a study of both localization and production of H2O2 in the lignifying xylem by the joint use of optical and electronic microscopy and 2,7-dichlorofluorescein diacetate and CeCl3 assays was carried out. Thus, H2O2 production was observed in thin-walled cells surround thick-walled xylem vessels and in the xylem parenchyma cells intercalated between xylem vessels suggesting that these cells could be responsible of H2O2 production and a degree of cell to cell cooperation is produced during lignin biosynthesis. Further evidence that supports this hypothesis was obtained by studying the production and localization of H2O2 during the differentiation of Z. elegans mesophyll cells into tracheary elements. Using this model system and confocal laser scanning microscopy and 2,7-dichlorofluorescein diacetate as fluorescent probe, H2O2 was mainly produced by both differentiating tracheary and parenchyma-like elements being the non-lignifying parenchyma-like cells the main H2O2 source and detecting a low level of H2O2 in the totally differentiated tracheary elements.

El plegament de la cromatina a l’interior dels cromosomes metafàsics segueix sent un dels problemes més difícils de resoldre de la biologia estructural. La majoria dels models de plegament més acceptats, que presenten la fibra de cromatina com a unitat bàsica, van ser proposats en condicions de molt baixa força iònica. Mitjançant múltiples tècniques microscòpiques, es va observar que els cromosomes metafàsics contenen un nou element bàsic de plegament: la placa de cromatina. Com a objectiu general, el treball experimental realitzat en aquesta tesi pretén ampliar el coneixement sobre l’estructura interna dels cromosomes metafàsics utilitzant condicions iòniques properes a les observades a la metafase. En primer lloc, s’ha estudiat l’estructura dels cromosomes dins les cèl·lules mitjançant microscòpia de polarització. Per altra banda, s’ha realitzat un ampli estudi de la capacitat d’autoassociació de fragments de cromatina de cromosomes metafàsics de cèl·lules humanes en condicions properes a la metafase. Mitjançant microscòpia de polarització, s’ha vist que els cromosomes metafàsics en medi aquós dins els sacs cel·lulars, són estructures òpticament isotròpiques. L’isotropia observada permet concloure que els cromosomes metafàsics no estan formats per piles paral·leles de nucleosomes. Aquesta possibilitat no exclou però l’associació de les cares laterals dels nucleosomes, que podrien donar lloc a piles amb diferents orientacions. Els resultats obtinguts mitjançant microscòpia electrònica de transmissió de fragments de cromatina obtinguts per digestió amb nucleasa micrococal de cromosomes metafàsics de cèl·lules humanes, mostren que únicament adopten una conformació estesa quan la concentració iònica del medi és molt baixa (10 mM Pipes, 10 mM EDTA). En condicions iòniques properes a la metafase (10 mM Pipes, 120 mM K+, 20 mM Na+, 17 mM Mg2+), els fragments de cromatina obtinguts tenen la capacitat intrínseca de formar estructures laminars per autoassociació. A més, no s’observen fibres de cromatina. Les plaques formades per autoassociació presenten les mateixes característiques que les emanades directament de cromosomes metafàsics: són estructures compactes, de superfície llisa i multilaminars. L’alçada de les plaques formades per autoassociació de fragments de cromatina metafàsica determinada a partir de mostres platinades unidireccionalment és de 6.8 ± 1.0 nm per làmina. Aquest valor coincideix amb l’alçada de les plaques emanades de cromosomes parcialment desnaturalitzants, observades al grup. L’aparició d’estructures laminars de gruix superior en mostres sotmeses a incubacions llargues a 25 i 37ºC, indica l’elevada tendència de les làmines de cromatina d’apilar-se i formar estructures multilaminars. Els cossos circulars compactes de 30 nm observats als voltants de les plaques obtingudes, sumat a la presència d’altres estructures circulars més petites sobre les plaques, suggereix que els cossos de 30 nm són estructures intermediàries durant el procés de formació de plaques. Tenint en compte que l’alçada d’un nucleosoma és de 11 nm i que no hi ha evidències que suggereixin una col·locació en columnes dels nucleosomes a les plaques, els resultats indiquen que els nucleosomes es distribueixen de forma parcialment inclinada a l’interior de les plaques. A partir dels resultats obtinguts, es pot suggerir que els nucleosomes a les plaques estan orientats irregularment. La interdigitació entre les làmines successives permet la interacció entre les cares laterals dels nucleosomes i dóna estabilitat a les plaques. La tendència a l’autoassociació de fragments de cromatina metafàsica per formar estructures multilaminars molt estables, suggereix que les cromàtides contenen cromatina plegada en una forma laminar al seu interior. / The three-dimensional organization of the chromatin filament in metaphase chromosomes is one of the most challenging problems of structural biology. The most accepted structural models for chromatin organization in the metaphase chromosome are those that present the chromatin fibber as a basic unit. However, they were proposed by the use of low ionic strength buffers. Through the use of several microscopy techniques, it was observed that metaphase chromosomes were built by a new structural element: the chromatin plate. The main goal of this thesis was to gain further insight on internal structure of metaphase chromosomes under metaphase ionic conditions. Firstly, it was analysed the entire chromosome structure within the cell using polarizing microscopy; and secondly, it was analysed the assembly process of digested chromatin fragments from human metaphase chromosomes under metaphase ionic conditions. Through the use of polarizing microscopy, it was observed that metaphase chromosomes in aqueous solutions under different ionic conditions are optically isotropic. These results exclude the possibility that nucleosomes are oriented regularly forming parallel columns inside metaphase chromosomes. Despite of this, it does not exclude the face-to-face and lateral side-by-side interactions of different nucleosomes, that can already generate columns with several orientations. The results obtained in the self-assembly process of chromatin fragments obtained after the digestion of micrococcal nuclease of human metaphase chromosomes observed with transmission electron microscopy, showed that they appear to be in an extended conformation just under low ionic strength condition (10 mM Pipes, 10 mM EDTA). When fragments are treated under metaphase ionic conditions (10 mM Pipes, 120 mM K+, 20 mM Na+, 17 mM Mg2+), it was observed that chromatin filaments generate laminar structures. In addition, there is no presence of chromatin fibbers. Self assembled plates show the same structural properties than the ones that emanate directly from metaphase chromosomes (i.e., flat and smooth surface, well-defined edges, stacking of several layers). Furthermore, the height of the plates obtained by self-assembly determined in unidirectional shadowing experiments is 6.8 ± 1.0 nm. This value is equal to the height of the plates emanated from partially denatured chromosomes, which was observed previously in our group. The presence of thick plates in the experiments performed at 25 and 37ºC indicate that the self assembled plates can be formed by stacked layers. Circular structures of 30 nm were observed surrounding the plates but also closely associated with them. Their presence suggested that these structures are intermediates of the plate generation process. Taking into account that the nucleosome height is 11 nm and that there are no evidences that suggest the presence of nucleosome columns inside the plates, results indicate that nucleosomes are slightly inclined in the chromatin plates. In conclusion, the results obtained in this thesis suggest that there is an irregular orientation of the nucleosomes inside the chromatin plates. The interdigitation of adjacent layers allows face-to-face and lateral side-by-side interactions between nucleosomes of successive layers, which confers stability and compactness to the laminar structure. The metaphase chromatin tendency to generate multilayered stable structures after a self-assembly process suggests that chromatids are composed of chromatin folded in a laminar way

La incidència d’infeccions gonocòciques i pneumocòciques roman alta en països en vies de desenvolupament i està augmentant a moltes parts del món. La necessitat de tractaments per a l’individu i per al control de la malaltia a nivel comunitàri és punyent però escollir el tractament adequat ha esdevingut complex com a conseqüència de la capacitat de Neisseria gonorrhoeae i Streptococcus pneumoniae de desenvolupar resistència envers antibiòtics. Aquesta tesi de doctorat investiga mecanismes relacionats amb la transferència genética horitzontal i amb l’arrest del creixement a N. gonorrhoeae and S. pneumoniae. La primera part de la tesi està dedicada a l’estudi de la transformació natural a N. gonorrhoeae i descriu els procediments que han portat a l’expressió, purificació i caracterització bioquímica de ComE, ComA i DprA, tres proteïnes que tenen un paper en la presa i el processament de DNA ambiental. La segona part de la tesi descriu la caracterització estructural mitjançant cristal·lografia de rajos X de RelBE2 de S. pneumoniae, un sistema toxina-antitoxina cromosòmic de tipus II que s’ha relacionat amb la moderació de la traducció i amb l’arrest del creixement en condicions d’escassetat de nutrients, i proposa un model per a la seva regulació. / The incidence of gonococcal and pneumococcal infections remains high in developing countries and is increasing in many parts of the world. The need not only for treatment of the individual but also for control of the diseases at a community level is acute but the selection of appropriate treatments has become a complicated issue by the ability of Neisseria gonorrhoeae and Streptococcus pneumoniae to develop resistance to antibiotics. This PhD thesis investigates mechanisms related to horizontal gene transfer and growth arrest in N. gonorrhoeae and S. pneumoniae. The first part of the thesis is devoted to the study of natural transformation in N. gonorrhoeae and describes the procedures that have lead to the expression, purification and biochemical characterization of ComE, ComA and DprA, three proteins involved in the uptake and processing of environmental DNA. The second part of the thesis describes the structural characterization by X-ray crystallography of S. pneumoniae RelBE2, a chromosomally-encoded type II toxin-antitoxin system that has been linked to translation moderation and growth arrest under starvation conditions, and proposes a model for its regulation.

Los inhibidores de peptidasas representan un mecanismo fisiológico para la regulación de las enzimas proteolíticas. Mientras que mayoría de los inhibidores monodominio tienen un único sitio reactivo mediante el cual interaccionan con sus peptidasas dianas de un tipo catalítico específico, algunos de ellos inhiben dos moléculas de peptidasa simultáneamente, dando lugar a la formación de complejos ternarios. Para estudiar este tipo de inhibidores se analizó la función de uno de ellos, sermetstatina. Este inhibidor forma un dímero que une fuertemente serín peptidasas y metalopeptidasas. La estructura del dímero de inhibidor fue determinada revelando que sermetstatina presenta una conformación en α/β-sándwich alargado constituido por cinco hebras β antiparalelas conectadas entre sí (β3-β2-β1-β4-β5; conectividad -1, -1, +3, +1) que dan lugar a una hoja β girada ∼30o, en cuya cara cóncava se acomodan dos hélices α (α1 y α2) y una hélice 310. Además, las estructuras de los complejos heterotetraméricos de sermetstatina con la serín peptidasa subtilisina y la metalopeptidasa esnapalisina fueron también determinadas, mostrando que la inhibición ocurre a través de lazos reactivos distales independientes. La interacción entre subtilisina y sermetstatina se produce mediante el lazo reactivo 2, posicionado adecuadamente por su hélice de anclaje, y la hendidura del centro activo de la enzima. El lazo se inserta a modo de cuña mimetizando un substrato en conformación extendida y canónica en la hendidura del centro activo de la enzima, siguiendo el mecanismo estándar de inhibición. Por otro lado, la interacción entre esnapalisina y sermetstatina se produce mediante el extremo N-terminal, el lazo reactivo 1, la hélice α1 y la región Lβ4β5 del inhibidor; y la hendidura del centro activo de la enzima y exositios presentes en la superficie de la proteasa. Este modo de inhibición sigue un mecanismo novedoso en inhibidores de metalopeptidasas, siendo este una reminiscencia distante del modo inhibitorio de los TIMPs en su unión con MMPs así como del modo inhibitorio del inhibidor de serralisina sobre la metalopeptidasa serralisina. Estas estructuras y el modelo del complejo heterohexamérico proporcionan por primera vez una visión detallada del mecanismo molecular de la inhibición simultánea de peptidasas pertenecientes a dos clases mecanísticamente diferentes por un inhibidor monodominio. En resumen, en el presente trabajo se ha determinado que sermetstatina es un inhibidor de doble faz genuino monodominio que ha evolucionado a partir de inhibidores de serín peptidasas de la familia MEROPS I16 con un único sitio reactivo que siguen el mecanismo estándar de inhibición. Dicha evolución ha dado lugar a una proteína bifuncional capaz de inhibir simultáneamente diferentes serín peptidasas y una metalopeptidasa específica a través de dos sitios reactivos distales compatibles. / Protein inhibitors provide a physiological mechanism for the regulation of proteolytic enzymes. While most single-domain inhibitors have one reactive site with which they target peptidases of a specific catalytic class, selected specimens inhibit two peptidase molecules simultaneously, thus giving rise to ternary complexes. To study such inhibition, the function of one of these proteins, sermetstatin, was analyzed. This inhibitor strongly binds as a dimer to serine peptidases and a metallopeptidase. The structure of the isolated inhibitor dimer was determined revealing that sermetstatin is an elongated α/β-sandwich. It consists of a five-stranded antiparallel β-sheet (β3-β2-β1-β4-β5; connectivity -1,-1,+3,+1) twisted by ∼30o, whose concave face accommodates two α-helices (α1 and α2) and a 310-helix. In addition, the structures of the heterotetrameric complexes with the serine peptidase subtilisin and the metallopeptidase snapalysin were equally determined, showing that inhibition occurs through two independent distal reactive sites. The subtilisin-sermetstatin interaction is made by reactive-site loop 2, adequately positioned by its scaffold helix, and the active-site cleft of the enzyme. The loop is inserted wedge-like mimicking a substrate in extended, “canonical” conformation in the active-site cleft of the enzyme following the “standard mechanism”. On the other hand, the snapalysin-sermetstatin interaction involves the N-terminal tail, reactive site loop 1, helix α1 and Lβ4β5 of the inhibitor; and the active-site cleft of the enzyme and some exosites on the protease surface. This inhibition modus follows a novel mechanism for metallopeptidase inhibitors only distantly reminiscent of the inhibitory mode of tissue inhibitors of metalloproteinases on their target matrix metalloproteinases and of serralysin inhibitors on their cognate serralysin MPs. These structures and the derived model for the heterohexameric complex provide for the first time a detailed view of the molecular mechanism of simultaneous inhibition of proteinases belonging to two distinct mechanistic classes by a single-domain protein. In summary, it was determined that sermetstatin is a genuine Janus-faced single-domain inhibitor which has evolved from single-site standard-mechanism serine peptidase inhibitors of family I16 to give a protein capable of simultaneous inhibition of serine peptidase in general and a specific metallopeptidase through distinct but compatible sites.