En los últimos años se ha descrito la desregulación de la síntesis proteica en muchas enfermedades, esto ha incrementado la investigación de nuevos mecanismos que controlan la expresión génica, en particular a nivel del inicio de la traducción. La mayor enfermedad con alteraciones en la traducción de mRNAs es el cáncer, donde se han encontrado desregulados varios factores implicados en el inicio de la traducción, incluyendo el eFI4E, eIF4G y 4E-BPs. Hipotetizamos que la regulación del inicio de la traducción es importante para la respuesta y la resistencia al estrés celular que ocurre durante el desarrollo del tumor. Nuestro estudio se centra en el factor de inicio de la traducción eIF4E (y su proteína de unión 4E-T) en cáncer de mama, donde se ha observado que elevados niveles de eIF4E se encuentran asociados con la malignidad y un peor pronóstico. La fosforilación de la serina 209 de eFI4E parece ser esencial para las propiedades tumorigénicas de eIF4E. Hemos analizado el rol de la fosforilación de eIF4E en diferentes líneas celulares tumorales bajo diferentes situaciones de estrés como el tratamiento con arsénico (estrés oxidativo), la deprivación de nutrientes y el tratamiento con drogas quimioterapéuticas (cisplatino). Mediante la utilización de un mutante hipofosforilado y un mutante fosfomimético de eIF4E, observamos que la fosforilación de eIF4E aumentaba la resistencia celular tras una situación de estrés, así como inhibía la apoptosis, correlacionándose con un aumento de ciertas proteínas relacionadas con la proliferación, como es el caso de Ciclina D1, y un incremento de proteínas antiapoptóticas, como es el caso de Mcl-1. El tratamiento con arsénico conduce a un bloqueo mayor de la traducción de proteínas en células que expresan el mutante fosfomimético, una vez regresado a las condiciones normales la sobreexpresión de este mutante permite una recuperación más rápida de la síntesis de proteínas normal. La sobreexpresión del mutante fosfomimético conduce a la formación de unos cuerpos citoplasmáticos que colocalizan con la proteína 4E-T. Este complejo peIF4E/4E-T también interacciona con las proteínas Ago2 y HuR. La inhibición de la expresión de 4E-T, HuR y/o Ago2, inhibe la recuperación celular, tras determinadas situaciones de estrés, mediada por peIF4E. Debido que la interacción de eIF4E con 4E-T parece ser esencial para la función de la fosforialción de eIF4E en respuesta a estrés, especulamos que este factor también juega un papel importante en el proceso tumorigénico. En efecto, la sobreexpresión de 4E-T incrementa los niveles de N-cadherina y de las metaloproteinasas -3 y -9. A parte se observa un incremento de la migración e invasión al sobreexpresar 4E-T; por el contrario, observamos una disminución de la invasión y migración al inhibir la expresión de 4E-T o al utilizar el mutante de 4E-T incapaz de unirse a eIF4E o, cuando inhibimos la fosforilación de eIF4E. Estos resultados nos indican que la interacción peIF4E/4E-T regula la invasión y la migración celular. Finalmente, realizamos unas inmunohistoquímicas de 77 tumores de mama. Se encontraron altos niveles de eIF4E y peIF4E, los cuales se correlacionaban con el tamaño del tumor. En el caso de 4E-T, este correlacionaba con altos niveles de N-cadherina, tal y como observamos in vitro al sobreexpresar 4E-T. En conclusión, hemos identificado el complejo peIF4E/4E-T como un complejo regulador de la resistencia a estrés y de la invasión y migración celular. El estudio de este complejo ofrece nuevas oportunidades terapéuticas contra el cáncer. / Deregulated protein synthesis has been described in many diseases in recent years, stimulating further research into the mechanisms that control gene expression, in particular at the level of translational initiation. A major disease with alterations to RNA translation is cancer, in which deregulated expression of many initiation factors including eIF4E, eIF4G and 4E-BPs, is frequently observed. We hypothesized that regulation of translational initiation is also important for the response and resistance to cellular stress that occur during tumor development. Our study focused on the translation initiation factor eIF4E (and its binding partner 4E-T) in breast cancer, where high levels of eIF4E are associated with malignancy and poor prognosis. Phosphorylation of Ser 209 appears to be essential for the tumourigenic properties of eIF4E. We therefore analyzed the role of eIF4E phosphorylation in different tumor cell lines, in particular the cellular response to different stress inducers such as arsenite (oxidative), nutrient deprivation, and chemotherapeutic drugs (cisplatin). Using phospho-dead and phosphomimetic mutants of eIF4E, we observe that phosphorylated eIF4E increase the cellular resistance to stress and inhibit apoptosis, correlating with an increase of some proteins related to proliferation, such as Cyclin D1, and an increased expression of anti-apoptotic proteins including Mcl-1. Arsenite treatment lead to a greater immediate block of translation in cells expressing the phosphomimetic mutant, but this appeared to allow for a faster recovery to normal protein synthesis upon returning the cells to normal conditions. Overexpression of the phosphomimetic mutant led to de novo formation of unique cytoplasmic bodies which co-localized with 4E-T protein. This peIF4E/4E-T complex also appeared to interact with Ago2 and HuR. The downregulation of 4E-T, HuR or/and Ago2, inhibited peIF4E-mediated cellular recovery after some stress situations. As the eIF4E interaction partner 4E-T appeared to be essential for the phospho-specific function of eIF4E in response to stress, we speculated that this factor also may play a central role in the tumourigenic process. Indeed, overexpression of 4E-T increased the levels of N-cadherin and matrix metalloproteinase -3 and -9. We also observed an increase in the migration and invasion capacity of these cells, In contrast, decreased invasion was observed when knocking down 4E-T expression, or when using a mutant of 4E-T unable to bind eIF4E, or when we inhibited the phosphorylation of eIF4E. These results indicate that the interaction peIF4E/4E-T regulate cellular invasion and migration. Finally, we performed an immunohistochemistry study of 77 breast tumors. High levels of eIF4E and phospho eIF4E correlated with the size of the tumor, whereas high levels of 4E-T correlated with increased N-cadherin expression as observed after 4E-T overexpression in vitro. In conclusion, we have identified the peIF4E/4E-T complex as a regulator of malignant features including cellular resistance to stress and a higher invasive capacity. Further elucidation of this complex is warranted and provides new therapeutic opportunities against cancer.

El cáncer de próstata (CP) es una de las mayores causas de muerte entre los hombres de los países desarrollados. Sin embargo, los actuales métodos de diagnóstico presentan una elevada tasa de falsos positivos debido a su baja especificidad, lo que conlleva un elevado número de biopsias de próstata (BPs) practicadas innecesariamente. Además, en muchas BPs, alguna patología no cancerosa de la próstata es hallada. Una patología benigna particularmente relevante en la clínica es la Neoplasia Intraepitelial Prostática de Alto Grado (HGPIN), reconocida como el precursor más probable del CP. Cuando se descubre en una BP, se asocia con una mayor probabilidad de existencia de un CP no detectado. Por ello, estos pacientes son seguidos clínicamente durante años, incluyendo la realización de múltiples BPs de repetición. Sin embargo, sólo en una pequeña parte de los pacientes un CP será finalmente encontrado. En resumen, la gran mayoría de las BPs practicadas actualmente son innecesarias, constituyendo una molestia para el paciente y un gran gasto económico para el sistema de salud. En los últimos años se ha hecho un gran esfuerzo en la identificación de nuevos biomarcadores para el CP, con el objetivo de mejorar la situación actual. Gracias a la ubicación de la próstata en el cuerpo, en contacto directo con la uretra, células descamadas y productos secretados, incluyendo exosomas, se pueden encontrar en la orina. El objetivo principal de esta tesis es la identificación de nuevos biomarcadores en orina, con el fin de desarrollar un método no invasivo para el diagnóstico precoz y correcto de CP, tanto en pacientes referidos para una primera BP como en pacientes previamente diagnosticados con HGPIN. Los exosomas han sido propuestos como una potencial nueva fuente de biomarcadores, ya que contienen moléculas que representan sus tejidos de origen. Con el fin de identificar nuevos biomarcadores CP en exosomas urinarios, en primer lugar hemos establecido un método de aislamiento de vesículas fiable, tras lo que las vesículas obtenidas fueron caracterizadas por microscopía electrónica, Western blot y nanoparticle tracking analysis. A continuación, se realizó una fase de descubrimiento mediante LC-MS/MS label-free (n = 24). El análisis de los datos se llevó a cabo mediante medición de las intensidades iónicas, aplicando varios enfoques estadísticos con el fin de aumentar la fiabilidad de los resultados. Una vez obtenida una lista de biomarcadores candidatos, éstos fueron validados siguiendo un enfoque de la proteómica dirigida (Selected Reaction Monitoring, SRM). Finalmente, se ha identificado un perfil de 15 biomarcadores expresados diferencialmente en CP. Dos de estas proteínas, que corresponden a una subunidad alfa y una beta de integrina, fueron seleccionadas para una caracterización adicional usando modelos in vitro, debido a su interés biológico. Esta caracterización demostró la localización intracelular de estos biomarcadores en endosomas tardíos. En el contexto de las BPs de repetición por diagnóstico de HGPIN, hemos investigado una serie de biomarcadores de CP basados en ARN del sedimento urinario. Como resultado, hemos descrito tres modelos multiplex con diferentes combinaciones de los genes CDH1, PSMA, PSGR y KLK3. Todos estos modelos superan a los métodos actualmente utilizados para la detección del CP en hombres con HGPIN, y su uso en la clínica podría potencialmente ahorrar una gran cantidad de BPs de repetición innecesarias. En el futuro, los resultados derivados de este estudio podrían mejorar la actual detección del CP, distinguiendo un CP agresivo de aquel clínicamente insignificante y otras condiciones benignas y, por lo tanto, evitando el sobrediagnóstico y sobretratamiento relacionados con esta enfermedad. / Prostate cancer (PCa) is one of the leading causes of death among men in the developed countries. Nevertheless, current methods of diagnosis for PCa have a high rate of false positive results due to a low specificity and, therefore, to many unnecessary prostatic biopsies (PBs). Moreover, in many PBs a non-cancerous pathology of the prostate is found. A particularly clinically relevant benign condition is High Grade Intraepithelial Neoplasia (HGPIN), recognized as the most probable precursor to PCa. When found in PB, it is associated with an increased probability of the existence of an undetected PCa. For this reason, its encounter in a first PB guarantees an intensive surveillance over the years, including multiple repeat PBs. However, only in a small part of these patients an aggressive form of PCa will be eventually found. In summary, the great majority of the PBs practiced nowadays are unnecessary, causing pointless discomfort to the patient and extra expenses to the health care system. In the last years, a lot of effort has been put into the identification of new biomarkers for PCa that would improve the current situation. Because of the location of the prostate in the body, in direct contact with the urethra, desquamated cells and secreted products, including exosomes, can be detected in urine. The main aim of this thesis is the identification of new biomarkers for PCa in urine, in order to develop a non-invasive method for the early and accurate diagnosis of PCa, both in a first PB setting and in patients already diagnosed with HGPIN. Exosomes have been proposed as a potential new source for biomarkers, since they contain molecules representing their tissues of origin. In order to identify new PCa biomarkers in urinary exosomes, we have first established a reliable vesicles isolation method, and then the obtained vesicles were characterized by electronic microscopy, Western blot, and nanoparticle tracking analysis. Next, we carried out a discovery phase by label-free LC-MS/MS (n=24). Analysis of the data was carried out measuring the ion peak intensities and applying several different statistic approaches, in order to increase the reliability of the results. Once we had a list of biomarker candidates, these were validated following a targeted proteomics approach (Selected Reaction Monitoring, SRM). Finally, we have identified a profile of 15 differentially expressed protein biomarkers for PCa. Two of these validated proteins, corresponding to one alpha and one beta integrin subunits, were selected for further characterization using in vitro models, based on biological interest. This characterization proved the intracellular location of these protein biomarkers in late endosomes. In the context of repeat PBs due to a previous diagnosis of HGPIN, we have assayed a set of known RNA-based PCa biomarkers from urine sediment. As a result, we have described a set of three multiplex models with different combinations of the genes CDH1, PSMA, PSGR and KLK3. All these models outperform the currently existent methods for the detection of PCa in men with HGPIN, and their use in clinical practice could potentially save a high number of unnecessary repeat PBs. In the future, the results derived from this study could improve current PCa detection, distinguishing aggressive from clinically insignificant PCa and other benign conditions and, therefore, avoiding PCa related over-diagnosis and over-treatment.

Los carotenoides son pigmentos de naturaleza isoprenoide presentes en todo tipo de organismos fotosintéticos y en algunos no fotosintéticos. En plantas, los carotenoides se sintetizan en todo tipo de plastos y se encuentran en grandes cantidades en cloroplastos (donde desempeñan una función esencial para la planta de fotoprotección) y cromoplastos de flores y frutos. Por el contrario, en los plastos de tejidos no fotosintéticos como aquellos de plantas crecidas en la oscuridad (etioplastos) y leucoplastos (raíces y pétalos de Arabidopsis) las cantidades de pigmentos son mucho menores y se desconoce parcialmente la función que desempeñan.Los carotenoides han sido ampliamente utilizados en la industria farmacéutica y alimenticia por sus propiedades colorantes y antioxidantes. Hasta el momento los carotenoides se obtienen mediante síntesis química o extracción a partir de microorganismos y plantas. No obstante, recientemente se ha desarrollado un creciente interés por la producción biotecnológica de estos compuestos. Pese a los numerosos avances realizados en este campo, diversos factores limitantes han de resolverse: i) la capacidad de almacenamiento ii) la disponibilidad limitada de precursores de naturaleza isoprenoide y iii) el escaso conocimiento de los mecanismos que regulan su biosíntesis. En este marco, el principal objetivo de este trabajo de tesis ha sido profundizar en nuestro conocimiento de la carotenogénesis en bacterias y plantas.1. Estudio de la influencia de la capacidad de almacenamiento y el aporte de precursores en la producción de carotenoides en "Escherichia coli".La primera aproximación llevada a cabo fue la expresión de genes procedentes de la cianobacteria carotenogénica "Synechocystis" en células de "Escherichia coli" transformadas genéticamente para la producción de licopeno. Aunque "Escherichia coli" no es una bacteria carotenogénica, la transformación de estas células con los enzimas apropiados para la biosíntesis de carotenoides procedentes de bacterias carotenogénicas permite la producción de diversos pigmentos en "E. coli". Este estudio reveló que la producción de licopeno no mejoraba al sobreexpresar una proteína de unión a carotenoides, la orange carotenoid protein (OCP). Es más, células transformadas con una genoteca de "Synechocystis" demostraron que la producción de licopeno mejoraba únicamente al aumentar la disponibilidad de precursores de naturaleza isoprenoide como resultado de interferir con el metabolismo celular. Los carotenoides se sintetizan mayoritariamente a partir de precursores isoprenoides generados por la vía del metilertitritol 5-fosfato (MEP), sirviendo de precursores también para multitud de metabolitos generados en la planta. Por ello nuestro siguiente objetivo consistió en intentar incrementar la disponibilidad de precursores y ver su influencia en la producción de carotenoides en "E. coli". Esto se realizó mediante la activación de la vía endógena de las células (la vía del MEP) y mediante la introducción de una vía foránea (la vía del mevalonato, MVA). En ambos casos se observó que el incremento de la disponibilidad de precursores mejoraba la producción de licopeno en células de "E. coli". 2. Estudio de la carotenogénesis y la función fisiológica de los carotenoides en tejidos no fotosintéticos de "Arabidopsis thaliana".En "Arabidopsis thaliana", la biosíntesis de carotenoides está fuertemente activada cuando las plantas pasan de germinar en la oscuridad (escotomorfogénesis) a un metabolismo con luz (fotomorfogénesis). En concreto observamos que la desrepresión de la fotomorfogénesis producía un aumento de la síntesis de carotenoides lo cual parece facilitar la adaptación de las plantas a un metabolismo fotosintético ya que ayuda a incrementar la producción de clorofilas. El aumento de la producción de carotenoides que conlleva la desrepresión de la fotomorfogénesis se debe mayoritariamente a un aumento de la expresión y consecuentemente de la actividad del principal enzima carotenogénico, la fitoeno sintasa (PSY). Ésta, además de controlar la producción de carotenoides en etioplastos puede regular el aporte de precursores de naturaleza isoprenoide procedentes de la vía del MEP. En concreto observamos que un aumento de la actividad de PSY provoca una acumulación post-transcripcional del enzima clave en la regulación de la vía del MEP, el enzima desoxixilulosa 5-fosfato sintasa (DXS). En otros tejidos no fotosintéticos de Arabidopsis como pétalos y raíces observamos que la expresión de PSY se localizaba en los haces vasculares. En leucoplastos de raíces, los carotenoides se requieren para la producción de los precursores de importantes hormonas como ácido abscísico (ABA, que controla diversas respuestas de la planta frente a condiciones de estrés abiótico) y estrigolactonas. En concreto se observó que en plántulas sometidas a estrés salino, PSY se induce únicamente en la raíz para producir ABA y estrigolactonas, que a su vez controlan la expresión de dicho gen. En conclusión podríamos decir que la regulación de la expresión de PSY en Arabdiopsis permite a la planta incrementar los niveles de carotenoides en respuesta a estímulos externos como luz o estrés abiótico. / "Carotenoid biosynthesis in Escherichia coli and in no-photosynthetic tisúes of Arabidopsis thaliana".TEXT:Carotenoids are isoprenoid pigments synthesized by all photosynthetic organism and some non-photosynthetic bacteria and fungi. In plants, these isoprenoids are synthesized in all types of plastids and they serve as precursors of important growth regulators such as absicsic acid (ABA) and strigolactones (both involved in the response to developmental and environmental cues). Besides their antioxidant properties and their use as nutraceuticals, carotenoids have an important industrial value due to their aromatic and colorant properties. Most commercial carotenoids are obtained by chemical synthesis or extraction from natural sources. However, several biotechnological approaches have engineered microorganisms and plants for increased carotenoids levels. However, for metabolic engineering become to a mature technology, several advances in our knowledge are still needed: i) to improve pigment storage capacity in vivo, ii) to overcome the limitation of precursor abundance and iii) to get new insights in the regulation of carotenoid biosynthesis. In our work, we mainly focused on the study of the influence of storage capacity and precursor abundance in carotenoid biosynthesis in engineered E. coli cells for lycopene production. In our study, we demonstrated that lycopene accumulation did not increase by the expression of an orange carotenoid protein (OCP), a carotenoid binding protein whereas the increase of precursor supply resulted in an enhanced carotenoid accumulation. Hence, activation of endogenous (methylerythritol 4-phosphate, MEP) or exogenous (mevalonate, MVA) pathways resulted in an increased lycopene accumulation, suggesting a limiting role of precursors supply for carotenoid production in engineered E. coli cells. On the other hand, in Arabidospsis thaliana, carotenoid biosynthesis is strongly up-regulated when dark-germinated seedlings (skotomorphogenic) emerge form the soil and light de-repress photomorphogenesis. We found that carotenogenesis was also activated when photomorphogenesis is de-repressed even in darkness. Moreover, an enhancement in the carotenoid biosynthetic rate was the result of an up-regulation of the expression of phytoene synthase (PSY), the first carotenogenic enzyme and its concomitant activity. Moreover, PSY controls isoprenoid precursor supply by triggering a post-transcriptional accumulation of the key enzyme of the MEP pathway, deoxyxylulose 5-phosphate synthase (DXS). In root leucoplast, PSY expression was mainly found in bundle vessels probably to ensure a sufficient carotenoid supply for the synthesis of carotenoid-derived root hormones such as ABA or strigolactones. Under salt-stress conditions, we observed a root specific induction of PSY expression to produce ABA and strigolactones, which in turn are addressed to regulate PSY expression specifically in Arabidopsis roots.

Els isoprenoides constitueixen una vasta família de compostos naturals que duen a terme una amplia varietat de funcions, moltes d’elles essencials, en els tres dominis de la vida. No obstant tots ells deriven d’una única molècula comú, el IPP (i el seu isòmer DMAPP) que es produeix a través de dues possibles rutes biosintètiques, la via del MEP i la via del MVA. La via MEP és la predominant en eubacteris mentre que la del MVA ho és en arqueobacteris, fongs i animals. En plantes coexisteixen les dues vies de forma compartimentalitzada. Aquesta distribució diferencial de les dues vies ha convertit la via MEP en una nova i prometedora diana per al disseny de nous antibiòtics (amb la FSM, un inhibidor específic de l’enzim DXR de la via MEP com a màxim exponent), molt necessaris en l’actualitat com a conseqüència de l’emergent resistència que han desenvolupat un gran nombre de microorganismes patògens a les drogues desenvolupades fins al moment. No obstant, tot i que el caràcter essencial dels isoprenoides fa que la seva síntesi es mantingui en tots els éssers vius la enorme plasticitat gènica, que es concentra especialment en bacteris, ha donat lloc a l’adopció d’estratègies alternatives tant a nivell d’enzims com metabòlits. Els carotenoides conformen una subfamília dintre dels isoprenoides de compostos derivats de la molècula parental de 40 carbonis, el fitoe, amb funcions que comprenen tant el metabolisme primari com el secundari. Es sintetitzen principalment en els plastidis de les plantes però també són produïts per alguns bacteris no fotosintètics i fongs. La seva creixent aplicació en la indústria ha fet molt atractiva l’aplicació de la biotecnologia per a la producció d’aquests compostos però per poder afrontar amb garanties aquest repte cal conèixer a fons els mecanismes que regulen a tots nivells la seva producció. Al llarg d’aquest treball s’ha combinat l’estudi dels aspectes bàsics i aplicats de la síntesi d’isoprenoides amb especial èmfasi en el paper de la via del MEP i la biosíntesi de carotenoides per proposar i avaluar estratègies de millora de la seva producció tant en bacteris com en plantes. El treball ha permès testar l’us d’enzims bifuncionals per millorar simultaniàment dos passos catalítics de la ruta carotenogènica tant en sistemes bacterians com en plantes. Es va analitzar l’efecte de la fusió de LCYE i LCYB (ε-ciclasa i β-ciclasa respectivament) en expressar-la en un sistema model carotenogènic de E.coli o en plantes transgèniques d’Arabidopsis thaliana obtenint-se resultats positius en el primer cas però no en el segon. Aquesta diferència posa de manifest la major complexitat dels sistemes vegetals. En aquesta línia es va explorar el possible paper addicional de la regulació post-transcripcional en el control del flux de la via del MEP utilitzant un mutant (rif18) obtingut en base a un escrutini de resistència a la inhibició per FSM. L’estudi va posar de manifest un nivell de regulació com a resultat de la integració i coordinació de la ruta MEP amb la resta del metabolisme de la planta especialment els metabolismes del sucre i de les hormones. Paral.lelament es va avaluar el paper que juguen individualment cada un dels enzims de la via MEP en el control del flux de la via en sistemes bacterians. L’estudi de la sobreexpressió de cada un dels gens en un sistema model carotenogènic de E.coli va posar de manifest el paper clau de DXS i la participació en menor mesura de DXR i HDR, resultats similars als descrits en Arabidopsis. Però, encara més important, va demostrar que uns nivells moderats de sobrexpressió dels enzims clau produeixen millors resultats en l’acumulació de productes finals. Complementariàment es va estudiar en profunditat el paper de HDS tant en bacteris com en plantes ja que havia estat descrit préviament com un possible punt de regulació diferencial entre els dos sistemes en base a les diferències observades en alineaments de seqüència. En cap dels dos casos un increment de l’activitat d’aquest enzim millorava l’acumulació de productes finals. Els dos passos identificats com a claus en la ruta MEP (DXS i DXR) es van escollir com a objectius sobre els que, aprofitant la plasticitat gènica i metabòlica dels bacteris, cercar noves activitats alternatives. Per DXS es van identificar dues proteïnes de E.coli (E1-PDH i DHBPS) que en patir mutacions puntuals adquirien la capacitat de complementar la deficiència de DXS. Per identificar activitats alternatives a DXR es va analitzar la presència d’homòlegs pels 7 gens de la via MEP en els genomes seqüenciats de microorganismes. Es va identificar un grup en els que hi eren presents tots ells excepte DXR. Utilitzant el genoma de Brucella abortus es va identificar una proteïna sense homologia amb DXR (DRL) capaç de suplir-ne l’absència i que defineix una nova família de proteïnes la funció de les quals era desconeguda. La seva caracterització va mostrar que catalitza la mateixa reacció amb propietats cinètiques similars a les descrites per DXR però amb diferències significatives, com una menor eficiència catalítica o una menor sensibilitat a la inhibició per FSM. L’estudi filogènetic de la família va posar de manifest l’existència de DRL vertaderes (amb activitat DXR) que s’agrupaven en un mateix clade filogenètic i DRL falses definint a l’hora tres classes de proteïnes. La cristal.lització i resolució de l’estructura tridimensional de la proteïna DRL de Brucella abortus va permetre un estudi estructural comparatiu observant-se diferències significatives respecte DXR especialment en el reordenament del centre actiu. A partir d’aquestes diferències es va hipotetitzar, en base a modelitzacions in silico, la possibilitat d’inhibir diferencialment els dos enzims. Aquesta possibilitat es va confirmar en estudis d’inhibició in vitro amb les proteïnes DXR de E.coli, i DRL de B.abortus recombinants purificades. Els α-fenil derivats de la FSM mostraven una capacitat d’inhibició de DXR en l’ordre nanomolar mentre que no mostraven cap efecte sobre DRL a concentracions de fins a 1 mM obrint la porta al disseny de nous antibiòtics de gran especificitat. / ISOPRENOIDS BIOSYNTHESIS IN BACTERIA AND PLANTS Isoprenoids are a vast family of natural compounds that perform a wide variety of biological functions, many of which are essential. However, they all derived from the universal intermediates IPP and its isomer DMAPP. Their biosynthesis occurs through two possible biosynthetic routes, the MEP and the MVA pathways. The MEP pathway is the exclusive source of IPP and DMAPP in eubacteria whereas the MVA pathway provides these precursors in archaea, fungi and animals. In plants, both pathways coexist in different subcelullar compartments. This distribution of isoprenoid biosynthetic pathways among the kingdoms has turned the MEP pathway into a promising new target for the design of new antibiotics (with FSM, a specific inhibitor of the enzyme DXR, as the main representative). Although isoprenoids are essential in all free-living organisms, tremendous plasticity among bacteria has led to the evolution of alternative biochemical strategies to produce these universal precursors. Carotenoids comprise a subfamily of C40 isoprenoid end products derived from a molecule of phytoene with functions in both primary and secondary metabolism. These are synthesized primarily in the plastids of plants but are also produced by some photosynthetic bacteria, fungi, and rarely in insects. The increasing use of carotenoids in the food, cosmetics and pharmaceutical industries as pigments, fragrances and nutraceuticals has galvanized their production through biotechnological applications. We have combined the study of basic and applied aspects of isoprenoid biosynthesis focusing on the role of the MEP pathway and carotenoid biosynthesis to suggest and evaluate strategies for improving their production in bacteria and plants. To this end, we have exploited the metabolic plasticity of bacteria to provide new biotechnological tools for carotenoid production. In the study, the use of bifunctional enzymes was tested to simultaneously improve two catalytic steps. As a proof of concept we analyzed the effect of chimeric LCYE-LCYB (ε-cyclase and β-cyclase, respectively) in a carotenogenic E. coli model system or in transgenic plants of Arabidopsis thaliana. The difference in the results highlights the major complexity of plant systems. In this direction, we studied the possible role of additional post-transcriptional regulation controlling the flow of the MEP pathway by using a mutant (rif18) isolated from a FSM-resistance screening. The study showed a higher level of regulation as a consequence of the integration and coordination with other metabolic pathways of the plant, especially the metabolism of sugars and hormones. We also evaluated the role of each of the individual enzymes of the MEP pathway in controlling the pathway flux in bacterial systems. Overexpresion of each individual gene in a carotenogenic E. coli model system highlighted the key role of DXS and to a lesser extent of the participation for DXR and HDR in driving flux through this pathway, in agreement with previous reports for Arabidopsis. Even more importantly, these results demonstrate that adjusted levels of overexpresion of the key enzymes produce better results in the accumulation of end products, the most relevant parameter for evaluating biotechnological strategies. Additionally, we further studied the role of HDS both in bacteria and plants. This enzyme had been previously postulated to have different regulatory roles in the two systems based on protein alignments. In both cases, an increase in enzyme activity does not affect the accumulation of end products. The identified key steps in the MEP pathway (DXS and DXR) were chosen as targets to search for new alternative activities taking advantage of the genetic and metabolic plasticity of bacteria. Two E.coli proteins which underwent change-of-function mutations in dxs or dxr deficient strains and acquired DXS activity were identified (DHBPS and PDH-E1). An alternative activity to DXR was identified by analyzing the sequenced genomes available from bacteria. A small group of microorganism contains homologous genes for all MEP pathway but DXR. Using the genome of Brucella abortus, a separate protein with no apparent homology to DXR (thereafter named DXR-like, or DRL) was identified. DRL defines a new family of proteins that catalyzes the first committed step of the MEP pathway. Characterization of the protein showed that it catalyzes the same reaction with similar kinetic properties as DXR albeit with significant differences in catalytic efficiency and lower sensitivity to inhibition by FSM. Phylogenetic and complementation studies of the family revealed the existence of true DRL (with DXR activity) grouped in the same phylogenetic clade. Crystallization and structural resolution of DRL from Brucella abortus allowed a comparative study. Significant differences to DXR were observed, in particular in the arrangement of the active site. Based on those differences and in silico modeling, the possibility to selectively inhibit either enzyme was hypothesized. In vitro inhibition studies using purified recombinant E. coli DXR and B.abortus DRL demonstrates that α-phenyl derivatives of FSM inhibit DXR in the nanomolar range while show no significant effect on DRL at a concentrations up to 1 mM. Those results open the door for the design of new highly specific antibiotics. The first tests in biotechnological applications comparing the ability of the three alternative proteins to replace the original DXS or DXR activities showed no improvement in performance. However, these proteins should be considered starting materials to continue the optimization of the new catalytic functions acquired using directed enzyme evolution methods in the laboratory.

La inmovilización de enzimas es de gran interés por razones económicas,prácticas e incluso ética. Se han sintetizado derivados totalmente cinamoilados de distintos polialcoholes, monosacáridos, derivados de estos últimos con grupos reactivos previamente seleccionados, derivados de oligosacáridos,polisacáridos, así como derivados preparados con diferentes grado de cinamoilación dependiendo del ensayo a realizar. Estos soprotes, sólos o mezclados entre ellos, se irradiaron con luz ultravioleta hasta obtener el soporte final utilizado para la inmovilización de diferentes enzimas. Los soportes se analizaron mediante espectroscopía de UV-visible, resonancia magnéticanuclear de protón y carbono-13, "DEPT", COSY, correlación C-H, espectroscopía de infrarrojo, espectrometría de masas, FAB+ y análisis térmico diferencial (DSC). Se optimizó la preparación de las extensiones de soportes de inmovilización,así como eligió bolas de vidrio de 3 mm de diámetro para su disposición. Principalmente, los trabajos se realizaron con la enzima HRPc inmovilizada mediante adsorción física, enlace covalente y atrapamiento. Se optimizó además el sistema de lavado de los inmovilizados preparados en función de la enzima ensayada, permitiendo caracterizar la retención de la enzima sobre el soporte de inmovilización mediante interacciones hidrofóbicas. Se estableció las mejores condiciones para la inmovilización de HRPc: pH y tiempo de inmovilización, concentración de enzima, concentración y número de capas de soporte, así como el tiempo de irradiación, que se consideró determinante para los resultados finales obtenidos. Como resultados, se pudo obtener una clasificación de los soportes en función de la actividad retenida en ellos, dependiendo de su naturaleza química, se ensayó el efecto inactivador de la temperatura, realizándose un estudio completo de la cinética que tiene lugar para los derivados totalmente. / Several crosslinking photopolymers were prepared and used as immobilization supports: totally and partially cinnamoylated derivatives of polyalcohols, monosaccharides, oligosaccharides and polysaccharides. We analyse the supports by UV–visible spectroscopy, 1H NMR, 13C NMR, "DEPT", COSY, C-H correlation, FT-IR, mass spectrometry, FAB+ and Differential Thermal Analysis (DSC). A film of prepolymer was formed onto glass beads (3mm diameter). The polymerization and cross-linking was carried out by irradiation in the ultraviolet region to obtain the final supports to immobilize enzymes. Immobilization of HRPc involves a process of physical adsorption and intense hydrophobic interactions. HRPc concentration, support concentration, immobilization time, pH, irradiation time and chemical nature of the immobilization supports on the retained enzymatic activity, was studied. Moreover, the thermal stability of immobilized HRPc onto glass beads covered with totally cinnamoylated derivatives of D-sorbitol (SOTCN), D-glucosone (GSOCN), ethyl-D-glucopyranoside (EGSCN) and inuline (INCN) was studied. and for H2O2 and ABTS, were calculated. We study the inactivation by hydrogen peroxide of immobilized HRPc, and the stability and durability of immobilized HRPc during storage in distilled water. Using HRPc immobilized onto glass beads coated with totally cinnamoylated derivatives of D-glucosone and sucrose, chitosan (coagulant) and different initial phenol concentrations, a reduction of more than 70% of the initial phenol concentration was obtained. The supports initially prepared were modified to make them suitable to immobilize -galactosidase

En este trabajo se recogen los resultados obtenidos en el estudio de la producción extracelular de la lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) expresada en la levadura metilotrófica Pichia pastoris bajo el PAOX1, utilizando una estrategia de alimentación con sustratos mixtos en la etapa de inducción para cultivos semicontinuos, con el fin de evaluar la viabilidad del uso del glicerol crudo como cosustrato en la producción de la lipasa para su posterior uso en la producción enzimática de biodiesel. En primer lugar se consideró la valorización del glicerol crudo obtenido a partir de aceites vegetales naturales y reciclados en la producción de biodiesel como una fuente de carbono para el crecimiento celular y la producción de la ROL. Se concluyó que en los procesos fermentativos con P. pastoris la utilización de glicerol crudo permite el crecimiento de la levadura y además no se evidencia un efecto negativo al utilizar glicerol crudo proveniente de la producción de biodiesel, en términos de rendimiento y velocidad específica de crecimiento. El sistema de expresión de la ROL en P. pastoris utilizando el PAOX1 depende de la utilización del metanol como sustrato inductor. En este trabajo se probaron diversas estrategias de adición de sustratos mixtos en cultivos semicontinuos para evaluar la producción de la proteína recombinante bajo este sistema de expresión. En primera instancia se llevó a cabo una alimentación mixta adicionando pulsos de metanol y alimentación exponencial con un cosustrato (glicerol). En el ensayo inicial, se alimentó con metanol como única fuente utilizando pulsos de metanol. Los resultados muestran que la estrategia de adición de metanol como único sustrato cada 12 horas mediante pulsos, resulta negativo tanto para el crecimiento como para la producción del producto heterólogo. En ensayos posteriores se realizaron cultivos en semicontinuo con una estrategia de alimentación mixta utilizando dos velocidades específicas de crecimiento con adición exponencial preprogramada de glicerol (0.1 y 0.02 h-1) y pulsos de metanol a dos concentraciones (10 y 5 g/L) adicionados a diferentes periodos de tiempo (1, 2, 6, y 12 h). Al utilizar una μ de glicerol de 0.1 h-1 el consumo de metanol se ve afectado, evidenciándose una clara represión del PAOX1. La concentración de los pulsos de metanol y su frecuencia tienen una influencia significativa en la producción del producto heterólogo. Posteriormente, se realizó una alimentación manteniendo fija la concentración de metanol (1.5 y 2 g/L) y el cosustrato siguiendo una alimentación preprogramada para una velocidad específica de crecimiento constante (0.02 h-1 y 0.05 h-1), Los resultados obtenidos mostraron que la producción de ROL en P. pastoris no es comparable entre las cepas Mut+ y Muts, aunque se empleen estrategias de cultivo similares. La presencia del glicerol como cosustrato no mejora la producción, ni la velocidad específica de producción. En las últimas estrategias, se planteó la utilización de sustratos mixtos en una alimentación exponencial preprogramada de glicerol a 0.02 y 0.04 h-1 con metanol para una velocidad específica de crecimiento de 0.02 h-1, y se realizó una comparación utilizando como cosustrato sorbitol a una velocidad de crecimiento de 0.02 h-1 con metanol para la misma velocidad específica de crecimiento. Se observa que el comportamiento de la cepa con sustratos mixtos glicerol y sorbitol a nivel de rendimiento Yp/x y productividad volumétrica presenta un comportamiento parecido al reportado cuando se utiliza metanol como única fuente de carbono. Los resultados de la velocidad específica de consumo de metanol son iguales cuando se utiliza metanol como única fuente de carbono y cuando se utiliza sorbitol como cosustrato, lo que muestra que el sorbitol no ejerce acciones represoras sobre el promotor PAOX1, contrario a lo observado cuando se utiliza glicerol como cosustrato donde el consumo de metanol disminuye 2.6 veces; mostrándose que, a pesar de encontrarse en condiciones limitantes el glicerol reprime al promotor PAOX1. Al utilizar glicerol y metanol como cosustratos se observa un aumento significativo de la actividad proteolítica independientemente de la velocidad específica de crecimiento sobre glicerol, lo que no se observó al utilizar sorbitol como cosustrato. Los niveles de biomasa alcanzados en los cultivos con glicerol como cosustrato son mayores que los alcanzados con sorbitol, por lo que puede ser que haya un mayor efecto de lisis celular en los cultivos con glicerol de forma que se recuperan más contaminantes en el producto final, sobre todo en etapas avanzadas del cultivo, ocasionando una disminución en la actividad específica de la proteína recombinante. / In this work the results obtained in the study of the production of extracellular lipase of Rhizopus oryzae (ROL) expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under the PAOX1, using a strategy of feeding mixed substrates in the induction stage in semi-continuous cultures are shown. Firstly, the valorization of crude glycerol obtained from natural and recycled vegetable oils in the biodiesel production as a carbon source for cell growth and production of ROL was evaluated. It was concluded that in fermentation processes with P. pastoris using crude glycerol allows the growth of yeast and no negative effect is observed in terms of yield and specific growth rate. The ROL expression system in P. pastoris using the PAOX1 depends on the use of methanol as the inductor substrate. In this work various strategies are tested to evaluate the use of mixed substrates for the production of recombinant protein under this expression system. Preliminarly, it is carried out by adding pulses of methanol and following an exponential feeding of the co-substrate (glycerol). The results show that the strategy of adding methanol pulses as the sole substrate every 12 hours is negative for both, cell growth and production of heterologous product. In subsequent fermentations, semi-continuous cultures using two specific growth rates with preprogrammed exponential addition of glycerol (0.1 and 0.02 h-1) and methanol pulses at two concentrations (10 and 5 g/L) added at different time periods (1, 2, 6, and 12 h) were performed 0.1 h-1 glycerolmethanol consumption is affected, showing a clear repression of PAOX1. The concentration of the methanol pulses and its frequency has a significant influence on the production of the heterologous product. Subsequently, a different strategy was performed by maintaining the methanol concentration (1.5 and 2 g/L) and the co-substrate following a preprogrammed feeding with constant specific growth rate (0.02 h-1 and 0.05 h-1) The results have shown that the production of ROL in P. pastoris is not comparable between the Mut+ and Muts similar strains though cultivation strategies are employed. The presence of glycerol as co-substrate production does not improve the production, and the specific production rate. Finally, the use of mixed substrates was carried out using combined preset exponential feeding of glycerol (0.02 h-1 and 0.04 h-1) with methanol addition for a specific growth rate of 0.02 h-1. A comparison was made with the use of sorbitol as co-substrate at specific growth rate of 0.02 h-1 with methanol addition to let the same specific growth rate. It is noted the the values of Yp/x and volumetric productivity when glycerol and sorbitol are used as mixed substrates are very similar than reported when methanol is used as sole carbon source. The results of the specific rate of methanol consumption are equivalent when methanol is used as sole carbon source and when sorbitol is used as co-substrate, which shows that the sorbitol do not exerts repressive action on the PAOX1 promoter, contrary to what was observed when using glycerol as co-substrate where methanol consumption decreases 2.6 times; stating that, despite being in limiting conditions glycerol PAOX1 represses the promoter. Additionally, by using methanol and glycerol as co-substrates a significant increase in the proteolytic activity regardless of the specific growth rate of glycerol is observed. However, this fact was not observed when using sorbitol as co-substrate. Biomass levels achieved in cultures with glycerol as co-substrate are greater than those obtained with sorbitol, which might led to a greater cell lyses process and so, more contaminants in the final product, specially in later culture steps, causing a decrease in the specific activity of the recombinant protein.

En l'anomenada societat de la informació, les dades representen unes parts estructurals clau en la generació del coneixement. De la mateixa manera, la Bioinformàtica depèn en darrer terme d'una adequada gestió i processament de les dades que s'originen de les anàlisis tant tradicionals com d'alt rendiment. Com a objectiu principal d'aquesta tesi, s'han compilat diferents aproximacions pràctiques per a la manipulació de les dades de seqüenciació de proteïnes i les anàlisis resultants que s'hi apliquen. En tot cas, com a pas preliminar, eines i algorismes bioinformàtics preexistents s'han adaptat abans al paradigma de la informació actual, bàsicament centrat en el World Wide Web. Després d'una pertinent adaptació d'aquestes aplicacions (en aquest document: ProtLoc, TransMem, TranScout i Bypass), esdevé possible encarar el processament massiu de dades proteiques que s'han originat dels darrers projectes de seqüenciació de genomes. Els resultats d'aquestes anàlisis es fan disponibles per a la comunitat científica d'arreu del món mitjançant bases de dades biològiques basades en el web, de ple accés i d'ús amigable. Com exemples, es presenten dos casos: TrSDB, un compendi de factors de transcripció coneguts i putatius de diferents organismes models, i ArchDB, una base de dades web estructural de llaços de proteïnes. Com a pas posterior, a partir del programa Bypass —una eina basada en lògica difusa per a la reanotació i avaluació d'alineaments proteics obtinguts amb cerca per homologia— s'implementa un entorn complet d'anotació i gestió de seqüències. Com a punt fort, el sistema també és suficientment flexible i modular per a permetre l'entrada de diferents tipus de dades (p. ex., Gene Ontology) o comunicar-se amb altres aplicacions ja existents i potencialment futures. De forma paral·lela, i aprofitant l'explosió de dades crues de seqüenciació i la curació de les bases de dades, es presenta una caracterització bioinformàtica d'una nova família de metal·locarboxipeptidases. Mitjançant aproximacions computacionals, va ser possible plantejar unes primeres hipòtesis per a l'activitat enzimàtica i la història filogenètica d'aquest grup de proteïnes. Notablement, llur identificació pot representar un enfocament esperançador per a tractar processos biològics com ara la malària o desordres neuronals, on aquestes molècules s'hi troben implicades estretament. / En la llamada sociedad de la información, los datos representan unas partes estructurales clave en la generación del conocimiento. Del mismo modo, la Bioinformática depende en último término de una adecuada gestión y procesado de los datos que se originan de los análisis tanto tradicionales como de alto rendimiento.

Como objetivo principal de esta tesis, se han compilado diferentes aproximaciones prácticas para la manipulación de los datos de secuenciación de proteínas y los análisis resultantes que se aplican. En todo caso, como paso preliminar, herramientas y algoritmos bioinformáticos preexistentes se han adaptado antes al paradigma de la información actual, básicamente centrado en el World Wide Web. Después de una pertinente adaptación de estas aplicaciones (en este documento: ProtLoc, TransMem, TranScout y Bypass), se hace posible encarar el procesamiento masivo de datos proteicos que se han originado de los últimos proyectos de secuenciación de genomas. 
Los resultados de estos análisis se hacen disponibles para la comunidad científica mundial mediante bases de datos biológicas basadas en el web, de pleno acceso y de uso amigable. Como ejemplos, se presentan dos casos: TrSDB, un compendio de factores de transcripción conocidos y putativos de diferentes organismos modelos, y ArchDB, una base de datos web estructural de lazos de proteínas.
Como paso posterior, a partir del programa Bypass —una herramienta basada en lógica difusa para la reanotación y evaluación de alineamientos proteicos obtenidos a partir de búsqueda por homología— se implementa un entorno completo de anotación y gestión de secuencias. Como punto fuerte, el sistema también es suficientemente flexible y modular para permitir la entrada de diferentes tipos de datos (p. ej., Gene Ontology) o comunicarse con otras aplicaciones ya existentes y potencialmente futuras.

De forma paralela, y aprovechando la explosión de datos crudos de secuenciación y la curación de las bases de datos, se presenta una caracterización bioinformática de una nueva familia de metalocarboxipeptidasas. Mediante aproximaciones computacionales, fue posible plantear unas primeras hipótesis para la actividad enzimática y la historia filogenética de este grupo de proteínas. Notablemente, su identificación puede representar un enfoque esperanzador para tratar procesos biológicos como por ejemplo la malaria o desórdenes neuronales, donde estas moléculas se encuentran implicadas estrechamente. / In the so-called Information society, data represent a key structural parts of knowledge generation. Likewise, present-day Bioinformatics ultimately relies on the proper management and processing of data originated from both traditional and high-throughput biological analyses. As a primary aim of this thesis, different practical approaches for the handling of raw protein sequence data and their applied resulting Bioinformatics analyses are compiled. Nonetheless, as a preliminary step, pre-existing Bioinformatics tools and algorithms are adapted to the characteristics of current informational paradigm, basically revolving around the World Wide Web. After a proper adaptation of those applications (in this document: ProtLoc, TransMem, TranScout and Bypass), it becomes possible to face the massive processing of protein data originating from the last genome sequencing projects. The outcomes of these analyses are made available for the world-wide scientific community in the form of user-friendly and fully accessible web-based biological databases. As examples, two cases are presented: TrSDB, a compendium of well-known and putative transcription factors from different model organisms, and ArchDB, a structural web database of protein loops. As a further step, starting from Bypass program —a fuzzy-logic based tool for the re-annotation and evaluation of protein homology search alignments—, a complete annotation and sequence management framework is deployed. As as strong point, the system is also flexible and modular enough for allowing the input of different data (e. g. Gene Ontology) or cross-communicate with other future and existing applications. Parallely to this, and also taking advantage of the explosion of raw sequence data and database curation, a Bioinformatics characterization of a new metallacarboxypeptidase family is introduced. By using computational means, it was possible to present a first hypotheses for the enzymatic activity and phylogenetical history of these group of proteins. Notably, their actual identification may represent an enlightening focus for dealing with biological processes such as malaria or neurodegenerative disorders, where these molecules are intimately linked.

L´estudi portat a terme en la tesi doctoral tracta sobre la relació estructura/funció de metalülocarboxipeptidases humanes, també anomenades carboxipeptidases (CPs). El treball realitzat s´ha dividit en dues parts diferenciades: una primera centrada en estudis funcionals i una segona part que conté estudis estructurals.Algunes CPs se sintetitzen en forma inactiva: les procarboxipeptidases (PCPs), les quals presenten segments d´activació d´una longitud de 91-96 residus, els quals han d´ésser separats del domini enzimàtic mitjançant un atac proteolític per part d´una proteasa activant. En la primera part d´aquest treball, l´optimització de sistemes d´expressió heteròloga i purificació per a la PCPA1 i PCPB humanes ha permès l´obtenció de quantitats suficients de proteïna per a realitzar un estudi detallat dels seus mecanismes d´activació. Així mateix, s´ha aplicat el mateix sistema d´expressió i purificació al mutant D255K de la PCPB humana.En contrast amb el que s´havia determinat per a la PCPA1 porcina, la PCPA1 humana presenta un mecanisme d´activació més semblant al de les formes B i A2: calen unes condicions d´activació suaus i se segueix una cinètica d´activació monotònica, en què el segment pro del proenzim no presenta activitat inhibidora sobre la carboxipeptidasa generada, essent el tall tríptic primari suficient per alliberar-lo de l´enzim.L´estudi comparatiu dels processos d´activació de la PCPB humana tipus salvatge i del seu mutant amb especificitat reversa D255K demostra la participació de la CPB en el processament del seu segment pro. D´altra banda, la generació d´una nova diana tríptica sobre Arg93A durant el procés d´activació del mutant pot indicar que la introducció de la mutació provoca una distorsió de les interaccions entre el segment pro i el domini enzimàtic.La segona part del treball es centra en estudis estructurals. D´una banda, s´ha resolt l´estructura de la PCPB humana, la qual és molt semblant a la d´altres PCPs prèviament estudiades i s´observa que la zona més variable és la regió de connexió entre el domini d´activació globular i el domini enzimàtic. Pel que fa a l´arquitectura del centre actiu, s´observen conformacions alternatives en certs residus del centre actiu. La resolució de l´estructura tridimensional de la PCPB humana, junt amb la d´altres estructures de PCPs prèviament obtingudes, ha permès l´obtenció d´un model acurat de la TAFI, un proenzim d´elevada rellevància biomèdica. L´estudi d´aquest model i l´anàlisi del seu perfil d´energia pseudopotencial permet l´elaboració d´una hipòtesi per explicar la inestabilitat conformacional intrínseca de la seva forma activa. D´altra banda, s´han modelat les estructures de tres nous membres de la família de les metalülocarboxipeptidases, els quals han estat identificats mitjançant cerques en la base de dades del genoma humà. D´acord amb la predicció de les seves especificitats els enzims s´han anomenat CPA5, CPA6 i CPO.La PCPA5 presenta major similülitud amb la PCPA1 i PCPA2 pancreàtiques. L´anàlisi de la butxaca d´especificitat indica que la l´enzim actiu mostra especificitat tipus A, amb una possible preferència per a residus C-terminals alifàtics petits.El model de la PCPA6 presenta una estructura més semblant a la PCPB, però l´especificitat predita per a l´enzim actiu és de tipus A. Les substitucions en la seva butxaca d´especificitat indiquen que la CPA6 podria presentar major eficiència en el processament de residus C-terminals hidrofòbics grans.Per a la CPO només s´ha modelat el domini enzimàtic, ja que els possibles exons codificants de la regió N-terminal no van poder ser identificats. La CPO presenta una estructura semblant a la de la CPB, però una sèrie de substitucions en la seva butxaca especificitat indiquen que presenta una nova especificitat no descrita fins ara per a residus C-terminals àcids. / This doctoral thesis focuses on the structure/function relationship of human metallocarboxypeptidases, also known as carboxypeptidases (CPs). This work has been devided into two different parts: the first part is about functional studies and the second comprises structural studies.Some CPs are synthesized as inactive precursosrs named procarboxypeptidases (PCPs), which contain long activation segments (91-96 residues) that are cleaved as a result of limited proteolysis through the action of a protease, such as trypsin. In the first part of this work, optimization of an efficient recombinant expression system and purification for human PCPA1 and PCPB allowed a detailed characterization of their tryptic activation processes.Previous detailed studies on the tryptic activation mechanism of the porcine proenzymes showed that the proteolytic processing of PCPB to a mature enzyme is a much faster process than that of PCPA1, the former following a monotonic curve and the latter a biphasic curve, as a result of the activation segment of porcine PCPA1 being a powerful competitive inhibitor of the enzyme moiety. The study reported here shows that, while human PCPB follows the general behaviour described above, this is not the case for human PCPA1 whose proteolytic processing, in terms of activation conditions, velocity of the process and shape of the activation curve, ressembles that of PCPB, as happens in the activation process of PCPA2.A reversed-specificity mutant of human PCPB, named D255K, was expressed and purified in the same manner as the wild-type form in order to study the effect of this point mutation on the tryptic activation process of PCPB. These studies demonstrate the involvement of the generated CPB in the trimming of the severed pro-segment.The second part is concerned with structural studies. On the one hand, the three-dimensional structure of human pancreatic PCPB has been solved, which is similar to previously reported PCPs structures, also in that the most variable region is the connecting segment that links both globular moieties. However, the empty active site shows subtle differences in some of the key residues for substrate binding. On the basis of this structure and others previously reported, a three-dimensional model of human TAFI, a protein of biomedical interest, has been built in order to generate a structure that may help us to understand its behaviour and also as a basis for the design of drugs to modulate its biological activity. The analysis of this model and its pseudo-potential energy profile allows us to propose an explanation for the intrinsic conformational instability of its active enzyme. On the other hand, amino acid homology searches of the human genome were performed and revealed three members of the metallocarboxypeptidase family. According to their predicted specificities these enzymes were named CPA5, CPA6 and CPO. Modelling analysis shows the overall structure of these proteins to be very similar to that of other members of the family of metallocarboxypeptidases. The active sites of CPA5 and CPA6 are predicted to cleave substrates with C-terminal hydrophobic residues, as do CPA1 and CPA2. CPO, is predicted to cleave substrates with C-terminal acidic residues, a unique activity among human CPs.

Las hidrolasas son enzimas que catalizan la ruptura del enlace amida o peptódico, y por lo tanto son denominadas también proteasas o peptidasas. Las proteasas constituyen cerca del 2 % del genoma humano, lo que representa unos 600 productos génicos. De acuerdo con el residuo catalóticamente activo, existen seis grandes grupos de peptidasas. En este trabajo nos centraremos en la familia M14 de peptidasas, también denominadas metalocarboxipeptidasas (CPs) debido a que su actividad catalótica reside en el ion zinc presente en el sitio activo de la enzima. En el genoma humano, se han identificado al menos 26 genes que codifican carboxipeptidasas. Las peptidasas de la familia M14 que actúan en el tracto gastrointestinal son las principales metaloproteasas responsables de la obtención de aminoácidos libres de la proteína de la dieta. En otros compartimientos corporales, las CPs pueden llevar a cabo tareas especializadas y altamente reguladas como ser la maduración de neuropéptidos, citokinas y hormonas peptódicas. En algunos casos, una actividad catalótica fuera de control puede conducir a enfermedades. Cada vez existe una mayor evidencia experimental que demuestra la actividad carboxipeptidasa en procesos como la pancreatitis aguda, la diabetes, la inflamación, la fibrinólisis y el cáncer. A pesar de ciertos avances en algunos aspectos, la actividad específica de las CPs es pobremente conocida. Además, las carboxipeptidasas son blancos terapéuticos interesantes para el desarrollo de fármacos, y por lo tanto se ha decidido emplear una aproximación multi-disciplinaria para la identificación y caracterización de nuevas moléculas de bajo peso molecular capaces de interferir la actividad carboxipeptidasa. Así, en este trabajo se han combinado modernas herramientas computacionales, screening in vitro, modelado molecular y cristalografía de rayos X con el fin de obtener nuevas entidades quφmicas como base para el desarrollo de fármacos. Con base en herramientas computacionales, aplicando el método de Optimal Docking Areaö, se han caracterizado sitios de unión proteína-proteína y proteína-ligando en la superficie de las peptidasas de la familia M14. A partir de aquí, se identificó una nueva clase de compuestos químicos capaces de explotar las diferencias existentes entre enzimas de la familia por unión a regiones hidrofóbicas. Otros inhibidores fueron identificados mediante un screening in silico de grandes colecciones de compuestos. Ensayos in vitro demostraron que los compuestos líderes inhibieron de manera potente a las carboxipeptidasas blanco con otras características interesantes como la posibilidad de coordinación del ion zinc catalítico por intermedio de un anillo oxadiazol. A través de una colaboración con el Departamento de Química Orgánica se obtuvieron y caracterizaron nuevos compuestos químicos con conectividades atómicas novedosas que, inesperadamente, demostraron ser potentes inhibidores de carboxipeptidasas. Una clase adicional de molécula de bajo peso molecular caracterizada corresponde a inhibidores que se unen covalentemente al enzima blanco. En este caso, se logró obtener la estructura tridimensional del complejo a resolución atómica mediante cristalografφa de rayos X, lo que ha permitido el dise±o basado en la estructura de una nueva generación de compuestos. Basados en otros datos de cristalografía de rayos X y análisis computacional, se ha revisado y ampliado el mecanismo de acción catalítica de las peptidasas de la familia M14 a partir de una nueva forma cristalina de CPB a alta resolución. En conjunto, nuestro trabajo ha permitido la obtención de nuevas moléculas líderes de bajo peso molecular que podrían servir como base para futuros desarrollos en el diseño de fármacos y agentes de diagnóstico o imaginería dirigidos a metalocarboxipeptidasas fisiológicamente activas. / Hydrolases are enzymes catalyzing the breakdown of the amide or peptide bond, and are therefore called proteases or peptidases as well. In the human genome, proteases made up about 2% of the genome, or about 600 gene products. There are six major groups of peptidases according to the catalytic residue. In our work we focused on the M14 family of peptidases, also called metallocarboxypeptidases (CPs) because of their catalytic activity hinges on the zinc ion present in the active site of the enzyme. In the human genome there are identified at least 26 genes encoding for CPs. M14 peptidases in the gastrointestinal tract are the main metalloproteases responsible of the liberation of free aminoacids from the protein content of the diet. In other compartments of the body, CPs may perform specialized and tightly controlled tasks such as neuropeptide, cytokine and hormone maturation. In some instances an imbalance in their activity leads to disease states in man. Increasing evidence shows carboxypeptidase involvement in acute pancreatitis, diabetes, inflammation, fibrinolysis and cancer. Although some aspects have become clearer, much of their activity remain poorly understood. Besides, carboxypeptidases are interesting targets for drug development, and therefore we pursued a multidisciplinary approach to identify and characterize novel small molecular weight compounds able to interfere carboxypeptidase activity. In this work we combined modern computational tools, in vitro screening, molecular modelling and X-ray crystallography to obtain new chemical entities useful as scaffolds for drug design. Based on a bioinformatics tools, the Optimal Docking Area method, we identified protein-protein and protein-ligand binding sites over the surface of M14 peptidases. This knowledge was employed to find out a new class of small molecular weight inhibitors which exploit the differential binding provided by hydrophobic patches. A further class of inhibitors was identified from in silico screening of collections of compounds. In vitro analysis revealed that the leads were potent inhibitors against the target proteases with interesting features like an oxadiazole zinc-chelating moiety. Compounds obtained from the Organic Chemistry Department were also screened, and unexpectedly, afforded some good inhibitors with unprecedented atomic bonding. One further class involved inhibitors that attach covalently to the target enzyme. In this case the structure of the complex obtained at high resolution by X-ray crystallography allowed the structure-guided design of new generation of compounds. The catalytic mechanism of M14 peptidases was also revisited based on our crystallographic and computational analysis of a new CPB crystal form at high resolution. Overall, our study provided new lead small molecular weight inhibitors which can be the foundation for further developments in the design of drugs and bioimaging or diagnostic agents targeted to physiologically-relevant metallocarboxypeptidases.

L'obesitat incrementa les possibilitats de patir altres malalties com la diabetis mellitus tipus 2 (DM2), la dislipèmia, la hipertensió, entre d'altres. Per tal de poder avançar en noves dianes terapèutiques que millorin aquestes malalties és necessari conèixer millor la biologia del teixit adipós i els seus components. El teixit adipós blanc, a més a més d'emmagatzemar la major part de les reserves energètiques, és capaç de tenir activitat metabòlica i endocrina. Cal tenir en compte que un adequat metabolisme lipídic en l'adipòcit és clau també per aconseguir un equilibri en l'homeòstasi del metabolisme glucídic en l'ésser humà. En aquest treball hem analitzat el paper de dues proteïnes implicades en la lipòlisi del teixit adipós, d'una banda el canal de glicerol aquaporina 7 (AQP7) i per altra l'adipoquina glicoproteïna Zinc-α 2 (ZAG), en el context de l'obesitat, la síndrome metabòlica i la DM2.Així, en aquesta tesi doctoral, hem pogut arribar a les següents conclusions:1. L'expressió del canal de glicerol AQP7, en teixit adipós, es troba disminuïda en pacients afectes d'obesitat mòrbida.2. La DM2 no sembla afectar l'expressió d'aquesta aquagliceroporina en el teixit adipós.3. Ambdues aquagliceroporines, AQP7 (al teixit adipós) i AQP9 (al teixit hepàtic) mantenen un estreta relació en pacients obesos mòrbids.4. La glicoproteïna Zinc-α 2 (ZAG) sembla tenir un paper rellevant en l'homeòstasi del teixit adipós amb un fort lligam amb altres adipoquines, especialment l'adiponectina. / Obesity increases the chances to suffer from other diseases such as type 2 diabetes mellitus (T2DM), hyperlipidemia, hypertension, and others. In order to get into new therapeutic targets to improve these conditions, a best knowledge of the biology of adipose tissue and its components is needed. In addition to storing the most of energy reserves, white adipose tissue is able to have metabolic and endocrine activity. It is necessary to consider that an appropriate lipid metabolism in the adipocyte is also essential to achieve a balance in the homeostasis of glucose metabolism in humans. In this study we have examined the role of two proteins involved in adipose tissue lipolysis, first glycerol channel aquaporin 7 (AQP7) and on the other hand adipokine Zinc-α 2 glycoprotein (ZAG), in the context of obesity, metabolic syndrome and T2DM. Thus, in this thesis, we have reached the following conclusions: 1. The glycerol's channel AQP7 expression, in adipose tissue, is decreased in patients with morbid obesity. 2. The DM2 does not appear to affect the expression of this aquaglyceroporin in adipose tissue. 3. Both aquaglyceroporins, AQP7 (in adipose tissue) and AQP9 (in liver tissue) have a close relationship in morbidly obese patients. 4. The Zinc-α 2 glycoprotein (ZAG) seems to play an important role in the homeostasis of adipose tissue with a strong bond with other adipokines, particularly adiponectin.