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Validação e performance de novos métodos moleculares no diagnóstico da tuberculose resistente / Validation and performance of new molecular methods for the diagnosis of resistant tuberculosis

Maschmann, Raquel de Abreu January 2013 (has links)
Em todo o mundo, menos de 5% dos doentes com tuberculose (TB), sejam casos novos ou previamente tratados, tem a avaliação dos isolados quanto ao perfil de sensibilidade aos antibioticos. No Rio Grande do Sul, estado localizado no sul do Brasil, cerca de 4700 casos novos de TB são registrados a cada ano, com uma taxa de cura de 68,9%, e uma taxa de abandono de 7,5%. A identificação rápida da resistência às drogas, em isolados clínicos de M. tuberculosis é importante para o estabelecimento de uma quimioterapia eficaz bem como para evitar a propagação de cepas resistentes. Os objetivos deste estudo foram caracterizar os pacientes de TB com maior risco de possuir TB-­‐MDR, analisando o perfil de resistência às drogas dos isolados e o perfil epidemiológico desses pacientes. Além disso utilizou-­‐se as amostras clínicas para avaliar o teste comercial (GenoType® MTBDRplus) e para desenvolver e padronizar um novo teste (Detect-­‐TBMR) para detectar as mutações mais frequentes associadas a resistência à INH e RIF. Uma proporção significativamente maior (75% versus 20%, p = 0,009) de pacientes do gênero masculino foi encontrada entre os casos resistentes às drogas do que entre os casos suscetíveis. 43,8% dos pacientes demoraram mais de 30 dias para procurar assistência médica e no grupo TB MDR, 25% dos casos não tinha sido submetido a qualquer tratamento prévio anti-­‐TB. Em nossas amostras, encontramos uma proporção de 48,3% de TB-­‐ MDR. A família T foi a família de spoligotipo mais frequente. Comparado com o método da proporções, a sensibilidade e especificidade do ensaio MTBDRplus foram 82% e 94% para a resistência à RIF, 60% e 94% para resistência à INH. Comparado com sequenciamento, a sensibilidade e especificidade do ensaio MTBDRplus foi 92% e 97% para a resistência à RIF e 100% e 100% para a resistência à INH, respectivamente. Para detectar resistência à RIF e INH, o ensaio Detect-­‐TBMDR mostrou sensibilidade e especificidade de 79,3% e 77,0% e 100% e 65%, respectivamente, em comparação com o método da proporções. Comparado com o sequenciamento, a sensibilidade e especificidade do ensaio Detect-­‐TBMDR foi de 81,2% e 94,7% e 100% e 96,2%, para detectar e resistência à RIF e INH, respectivamente. Ainda existem discordâncias entre o método das proporções e a abordagem molecular, particularmente em relação a resistência à INH. Contudo, estes métodos são muito importantes para o manejo mais rápido e correto dos pacientes, auxiliando na escolha do melhor esquema terapêutico. / In most parts of the world, less than 5% of new and previously treated tuberculosis (TB) patients are tested for multidrug resistance (MDR) TB. In Rio Grande do Sul state, the southern most Brazilian state; approximately 4700 new cases of TB are recorded each year, with a cure rate of 68.9%, and a noncompliance rate of 7.5%. Rapid identification of drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis is important to facilitate rapid and adequate chemotherapy of TB, and to prevent the spread of resistant strains. The aim of this study was to characterize TB patients at higher risk of having MDR-TB, to analyze the drug resistance and epidemiological profile of these patients. Use the clinical samples to assess the commercial test (GenoType® MTBDRplus) and develop and standardize a new test (Detect-MDRTB) for detecting the most frequent mutations associated with resistance to INH and RIF. A significantly higher proportion (75% versus 20%, p = 0.009) of males were found among drug-resistant cases than drug susceptible cases. 43.8% of patients took longer than 30 days to seek medical care and in the MDR group 25% of the cases did not undergo any previous anti-TB treatment. In our samples we found a proportion of 48.3% of MDR-TB. The T family was the most frequent spoligotype family. Compared with the proportion method, the sensitivity and specificity of the MTBDRplus assay were 82% and 94% for RIF-resistance, 60% and 94% for INH resistance. Compared with sequencing, the sensitivity and specificity of the MTBDRplus assay were 92% and 97% for RIF-resistance, 100% and 100% for INHresistance. To detect RIF and INH-resistance, the Detect-TBMDR assay showed a sensitivity and specificity of 79.3% and 77.0%, and 100% and 65%, respectively, compared to proportion method. When compared with sequencing, Detect-TBMDR assay, to detect RIF and INH-resistance, showed a sensitivity and specificity of 81.2% and 94.7% and to 100% and 96.2%, respectively. Discordances still exist between the proportion method and molecular approach, particularly regarding INH-resistance. However, these methods are very important for the management faster and correct patient, helping to choose the best treatment regimen.
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Role and mechanism of action of human immunoregulatory iNKT cells in Leishmania infection: new approaches for vaccination?

Teixeira, Lúcia de Fátima Moreira 11 October 2011 (has links)
Doutoramento em Ciências Farmacêuticas / PhD in Pharmaceutical Sciences
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Caracterização biofísico-química da enzima Orotato Fosforibosiltransferase (OPRT, EC 2.4.2.10) de Mycobacterium tuberculosis H37Rv: modelo para o desenvolvimento de novas drogas anti-tuberculose

Andrade, Ardala Elisa Breda January 2011 (has links)
Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431159-Texto+Completo-0.pdf: 8354772 bytes, checksum: 8abf5160038abef327a3d35aa522175e (MD5) Previous issue date: 2011 / Tuberculosis is a chronic infectious disease mainly caused by Mycobacterium tuberculosis that requires urgent new efforts towards its treatment and cure face the emergence of drug-resistant strains, its world spreading, the increasing number of infected patients among immune compromised populations, and the large number of latent infected individuals that are reservoir to the disease. Nucleotides metabolism pathways provide promising molecular targets for the development of novel drugs against active tuberculosis and might also target its latent forms. The orotate phosphoribosyltransferase (OPRT) enzyme of the de novo pyrimidine synthesis pathway catalyzes the reversible phosphoribosyl transfer from 5'-phospho-α-D-ribose 1'-diphosphate (PRPP) to orotic acid (OA), forming orotidine 5’-monophosphate (OMP), precursor of remaining pyrimidine nucleotides. This work describes cloning, amplification and characterization of M. tuberculosis H37Rv pyrE gene as encoding a functional OPRT, its apparent and true kinetic constants for forward and reverse reactions, product inhibition profile, and kinetic mechanism assignment as Mono-Iso Ordered Bi Bi, not previously described for an enzyme member of type I phosphoribosyltransferase family. Thermodynamic constants and discrimination profile allowed natural enzyme’s substrates binding patterns identification. Characterization of the reaction catalyzed by mycobacterial OPRT is essential to structure-based drug development, aiming to advance towards tuberculosis control. Resulting data from enzyme’s characterization were the starting point for OPRT specific inhibitors planning, selection and testing.A starting compound was identified as promising lead molecule, with values in nanomolar range, and was further submitted to several chemical replacement experiments, leading to a derived molecule with lower inhibitory constants and improved thermodynamic discrimination profile. Both compounds identified were characterized as competitive and uncompetitive inhibitors towards OPRT substrates OA and PRPP, respectively. Advantage of M. tuberculosis unique kinetic mechanism among homologues OPRTs was taken in order to plan a specific molecule that might trap the enzyme in a noncatalytic ternary complex E ∙ PRPP ∙ I, both inhibiting pyrimidine synthesis and sequestering PRPP from cellular pool, thereby affecting other metabolic pathways. M. tuberculosis OPRT characterization and results on primary inhibitors identification are crucial step towards a potential novel drug development for tuberculosis treatment and prophylaxis. Results from this work are believed to enhance the understanding of mycobacterial nucleotide metabolism and provide pertinent data to advance towards specific molecular targets inhibitors development, aiming tuberculosis control. / A tuberculose é uma doença infecciosa crônica, causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, e requer novas iniciativas urgentes para o seu tratamento e cura em decorrência do surgimento de cepas resistentes a drogas, sua abrangência global, e o significativo aumento de pessoas infectadas entre pacientes imunodeprimidos; além do grande número de pessoas infectadas com a forma latente da tuberculose, que atuam como reservatório da doença. As enzimas que constituem as vias de metabolismo de nucleotídeos são alvos promissores para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da tuberculose, tanto na sua forma ativa quanto latente. A enzima orotato fosforibosiltransferase (OPRT), pertencente à via de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina, catalisa a transferência reversível do grupamento fosforibosil da molécula de 5’-fosfo-α-Dribose 1’-difosfato (PRPP) para o ácido orótico (OA), formando orotidina 5’- monofosfato (OMP), molécula precursora dos demais nucleotídeo de pirimidina. Este trabalho descreve a clonagem, amplificação e caracterização do produto do gene pyrE de M. tuberculosis H37Rv como uma enzima OPRT funcional; a determinação de suas constantes cinéticas aparentes e verdadeiras para as reações direta e inversa; ensaio de inibição pelos produtos; e a determinação do mecanismo cinético da reação como sendo Mono-Iso Ordenado Bi Bi, mecanismo que até então não havia sido descrito para uma enzima pertencente à família das fosforibosiltransferases do tipo I. As constantes termodinâmicas e o perfil de discriminação termodinâmica permitiram a identificação dos modos de interação dos substratos naturais da enzima com seu sítio de ligação.A caracterização da reação catalisada pela enzima OPRT micobacteriana é uma etapa essencial para o desenvolvimento de novas drogas de ação específica que permitam o melhor controle da tuberculose. Os dados resultantes da caracterização da enzima foram utilizados como ponto de partida para o planejamento, seleção e teste de inibidores seletivos contra a OPRT de M. tuberculosis. Um composto inicial, com valores de na faixa de concentração de nanomolar, foi identificado como potencial composto líder, sendo submetido a diferentes protocolos de derivatizaçao química, permitindo a obtenção de uma molécula derivada com valores de constantes inibitórias e perfil de discriminação termodinâmica aprimorados. Estes dois compostos foram caracterizados como inibidores competitivos e incompetitivos em relação aos substratos naturais da OPRT, OA e PRPP, respectivamente; onde o conhecimento do singular mecanismo cinético de reação da enzima de M. tuberculosis foi utilizado para o planejamento de moléculas capazes de formar um complexo ternário não catalítico (E ∙ PRPP ∙ I), inibindo a síntese de nucleotídeos de pirimidina e sequestrando moléculas de PRPP do meio celular, afetando ainda, outros processos metabólicos essenciais. Os resultados deste trabalho colaboram ainda para uma melhor compreensão do metabolismo de nucleotídeos de micobactérias e fornecem informações relevantes para o avanço do desenvolvimento de inibidores de ação seletiva sobre alvos moleculares específicos para o tratamento e profilaxia da tuberculose.
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Estudo sobre moléculas com atividade hemoglobinolítica em Angiostrongylus costaricensis e Angiostrongylus cantonensis

Ramos, Raquel Rocha January 2009 (has links)
Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000411825-Texto+Completo-0.pdf: 1068093 bytes, checksum: 29a9720f1c8599bf5e5b990d17e4dcb6 (MD5) Previous issue date: 2009 / The two main species in the genus Angiostrongylus that cause human disease are A. cantonensis and A. costaricensis. These parasites have different tissue tropism, A. cantonesis is neurotropic and causes eosinophilic meningoencephalitis, A. costaricensis is located in the mesentery causing abdominal angiostrongyliasis. Immunological tests currently used for angiostrongyliasis diagnosis are limited by low especificity. Otherwise, specialized functional proteins, such as enzymes, may lead to more specific reactivity. The aim of the present work is to identify hemoglobinotytic activity in A. cantonensis. Digestive organs from the female worms were homogenized in lyses buffer. The protein extract (AcPE) was incubated whit bovine hemoglobin (BHh) at different pH range. Zymography assay was carried out by copolimerized SDS-PAGE with either 0. 4% BHb or 0. 1% gelatin. Hemoglobin degradation was well demonstrated at an extensive pH range, from 3. 0 to 7. 0. No degradation bands were detected by zymography either with gelatin or hemoglobin as substrate. These limited data from zymography and those from pH titration may suggest that AcPE contains not a single component but a low abundance enzyme complex. The identification, characterization and clonning of molecules with hemoglobinolytic activity stays as a prioritary aim. / Angiostrongylus costaricensis e A. cantonensis são as principais espécies patogênicas para o homem no gênero Angiostrongylus. Esses parasitos tem tropismo tecidual diferentes, A. cantonensis é um parasito neurotrópico que causa a angiostrongilíase meningoencefálica e A. costaricensis localiza-se no mesentério sendo o agente etiológico da angiostrongilíase abdominal. Os testes imunológicos utilizados ultimamente para o diagnóstico das Angiostrongilíases são limitados pela baixa especificidade. Entretanto, proteínas funcionais especializadas, tais como enzimas, podem ser fontes de reatividade imunológica específica. O objetivo do presente trabalho é identificar atividade hemoglobinolítica nesses parasitos. Tubos digestivos de fêmeas foram homogeneizadas em tampão de lise. As proteínas do extrato (ExAca) foram incubadas com hemoglobina bovina (HbB) em diferentes pHs. Zimografia foi realizado em géis copolimerizados com 0,4% gelatina ou 0,1% BHb. Degradação da hemoglobina foi bem demonstrada em uma ampla faixa de pH, de 3,0 para 7,0. Não foram detectadas bandas de degradação na zimografia com gelatina ou hemoglobina como substrato. Os dados limitados da zimografia e os resultados de atividade hemoglobinolítica, com ou sem a titulação de pH, pode sugerir um complexo de proteases em pequena quantidade. Exploração de diversas estratégias de concentração do extrato protéico, sem perda da atividade da enzima, constitue a perspectiva desse trabalho, visando à identificação, caracterização e produção em larga escala de moléculas com atividade hemoglobinolítica.
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Um estudo do efeito da flexibilidade explícita da enzima InhA de M. tuberculosis na docagem molecular dos inibidores etionamida, triclosano e isoniazida-pentacionoferrato II

Cohen, Elisângela Machado Leal January 2010 (has links)
Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000424566-Texto+Completo-0.pdf: 2168714 bytes, checksum: 2f865a2656e725b28201a2b328378a5c (MD5) Previous issue date: 2010 / Molecular docking is one of the main stages of Rational Drug Design (RDD). This is a method that provides a better orientation and conformation in which a molecule will bind to another to form a stable complex. Most docking algorithms consider flexible ligands, due to their usually small size. On the other hand, because the receptor is generally a molecule consisting of a larger number of atoms, it is treated as rigid. However, protein molecules are naturally flexible, and to consider such flexibility throughout the docking process is still not an easy task. The motivation for developing this work came from the need to perform molecular docking simulations in a more realistic manner, considering the dynamics and plasticity of a receptor molecule. Among the various ways to consider the receptor flexibility, our approach was to use a molecular dynamics simulation (MD) to generate the different conformations of the receptor. In this study we have investigated the effect of the explicit flexibility of the InhA enzyme of Mycobacterium tuberculosis by performing molecular docking simulations in each of the different conformations of the enzyme (wild-type, and I16T and I21V mutants), produced by MD, with the inhibitors ethionamide (ETH), triclosan (TCL) and isoniazid-pentacyanoferrate II (PIF).With the flexible model of the receptor, the experiments produced a series of snapshots of InhA inhibitors used in this study, showing different modes of ligand binding, which could not be evaluated using a single conformation of the crystal structure (PDB ID: 1ENY). Our analysis showed that for the InhA-ETH complex, only 5 residues interacted with the ligand in the crystal structure, whereas 80 residues along the trajectory made contacts with the ETH in the flexible model. Similarly, for the InhA-TCL complex only 2 residues of the crystal structure interacted with the ligand, while in the flexible receptor model, we found 46 residues interacting with the TCL. Finally, for the complex InhA-PIF, we found that 2 residues of the receptor interacted with the ligand in the crystal structure, and on the other hand, 35 residues interacted with PIF in the flexible model. This suggests that the flexible receptor model can accommodate a more diverse set of conformations of the ligand. When considering the plasticity of the receptor to perform a docking simulation, it means that the amino acid residues, loops and turns of the receptor can move slightly in different directions, allowing the ligand to explore spaces in the binding site that would have not been possible before. We believe that this work is helping to build knowlege of the importance of receptor flexibility in molecular docking process, and paves the way for further investigation. / A docagem molecular é uma das principais etapas do processo de Rational Drug Design (RDD). Este é um método que prevê a melhor orientação e conformação na qual uma molécula se ligará à outra, de modo a formar um complexo estável. Os algoritmos de docagem atuais consideram o ligante flexível, devido ao seu tamanho geralmente pequeno. Já o receptor, por ser uma molécula composta por um número maior de átomos, é tratado como rígido. Porém, proteínas são moléculas naturalmente flexíveis, e considerar esta flexibilidade durante um processo de docagem ainda não é uma tarefa fácil. A motivação para desenvolver este trabalho surgiu da necessidade de realizar simulações de docagem molecular mais realísticas, que considerem a dinâmica e a plasticidade de uma molécula receptora. Dentre as diversas formas de considerar a flexibilidade do receptor, usamos uma simulação de dinâmica molecular (DM) para gerar as diferentes conformações do receptor. Investigamos o efeito da flexibilidade explícita da enzima InhA de Mycobacterium tuberculosis através da realização de simulações de docagem molecular em cada uma das diferentes conformações da mesma (tipo selvagem e mutantes I16T e I21V) obtidas por DM, com os inibidores etionamida (ETH), triclosan (TCL) e isoniazidapentacianoferrato II (PIF). Com o modelo flexível do receptor, os experimentos produziram um conjunto de snapshots dos inibidores da InhA utilizados neste estudo, mostrando diferentes modos de ligação do ligante, que não poderiam ser avaliados com base em uma única conformação da estrutura cristalina (PDB ID: 1ENY). Nossa análise revelou que para o complexo InhA-ETH, apenas 5 resíduos interagiram com o ligante, na estrutura cristalina, enquanto que 80 resíduos ao longo da trajetória fizeram contatos com a ETH no modelo flexível. Para o complexo InhATCL apenas 2 resíduos da estrutura cristalina interagem com o ligante, e no modelo de receptor flexível, encontramos 46 resíduos interagindo com o TCL. Finalmente, para o complexo InhAPIF, verificamos que 2 resíduos do receptor interagiram com o ligante na estrutura cristalina, enquanto que para o modelo flexível encontramos 35 resíduos interagindo com PIF. Isto sugere que o modelo de receptor flexível pode acomodar um conjunto mais diversificado de conformações do ligante. Considerar a plasticidade do receptor ao realizarmos uma simulação de docagem significa que os resíduos de aminoácidos, alças e voltas do receptor, podem mover-se ligeiramente em diferentes direções permitindo que o ligante possa então explorar espaços no sítio de ligação que antes não seria possível. Acreditamos que este trabalho está ajudando a construir o conhecimento sobre a importância da flexibilidade do receptor no processo de docagem molecular, e possibilita uma investigação mais aprofundada no futuro.
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A enzima 2-trans-enoil-ACP (CoA) redutase de mycobacterium tuberculosis: estudos de ligação e inibição por um complexo inorgânico derivado da isoniazida

Vasconcelos, Igor Bordin January 2007 (has links)
Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:33Z (GMT). No. of bitstreams: 3 000399964-Texto+Completo+Parte+A-0.pdf: 18391919 bytes, checksum: af1c2f20c95ef9a171c3d3fc299fe1e4 (MD5) 000399964-Texto+Completo+Parte+B-1.pdf: 11500816 bytes, checksum: 2d0b16c2a821b4adbb77c7b4d4f28602 (MD5) 000399964-Texto+Completo+Parte+C-2.pdf: 17810555 bytes, checksum: f216fc25091f70f4980a1f7a25ffde6b (MD5) Previous issue date: 2007 / Tuberculosis (TB) remains the leading cause of mortality due to a single bacterial pathogen, Mycobacterium tuberculosis. The reemergence of tuberculosis as a potential public health threat, the high susceptibility of human immunodeficiency virus-infected persons to the disease, the proliferation of multi-drug-resistant strains (MDR-TB) and, more recently, of extensively drug resistant isolates (XDR-TB) have created a need for the development of new antimycobacterial agents. There is an ongoing need for innovation in proposing new structural scaffolds for chemotherapeutic agent development to control TB. Mycolic acids, the hallmark of mycobacteria, are high-molecular-weight α-alkyl, β-hidroxy fatty acids, which appear mostly as bound esters in the mycobacterial envelope. Isoniazid (INH) is the most prescribed chemotherapeutic agent for active TB and prophylaxis and requires activation by the catalase-peroxidase activity of KatG. The product of the M. tuberculosis inhA structural gene (InhA) has been shown to be the primary target for INH. InhA was identified as an NADH-dependent enoyl-ACP reductase specific for long chain enoyl thioesters. InhA is a member of the mycobacterial Type II fatty acid biosynthesis system, which elongates acyl fatty acid precursors of mycolic acids. The main focus of our contribution is on data describing the mode of action of an inorganic complex, pentacyano (isoniazid) ferrateII that requires no KatG-activation and is an in vitro slow-onset inhibitor of WT and INH-resistant M. tuberculosis enoyl reductases. This inorganic complex represents a new class of lead compounds to the development of anti-tubercular agents aiming the inhibition of a validated target. We also describe the recent developments in the search for inorganic complexes with anti-tubercular activity. / A tuberculose (TB) continua sendo a principal causa de mortalidade devido a um único patógeno bacteriano, Mycobacterium tuberculosis. A reemergência da tuberculose como uma ameaça potencial à saúde pública, a alta suscetibilidade de pessoas infectadas com o vírus da imunodeficiência humana à doença, a proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB) e, mais recentemente, de cepas extensivamente resistentes às drogas (XDR-TB) criaram a necessidade do desenvolvimento de novos agentes antimicobacterianos. Existe uma necessidade contínua de inovação em propor novas estruturas para o desenvolvimento de agentes quimioterápicos para o controle da TB. Os ácidos micólicos, característicos de micobactérias, são ácidos graxos α-alquil, β-hidróxi de alto peso molecular que aparecem, principalmente, como ésteres ligados ao envelope micobacteriano. A isoniazida (INH) é o agente quimioterápico mais prescrito para a TB ativa e para a profilaxia e necessita de ativação pela atividade de catalase-peroxidase da KatG. O produto do gene estrutural M. tuberculosis inhA (InhA) demonstrou ser o alvo primário da INH. A InhA foi identificada como uma enoil-ACP redutase dependente de NADH, possuindo especificidade por enoil tioésteres de cadeia longa. InhA é um membro do sistema de biossíntese de ácidos graxos micobacterianos do tipo II que elonga ácidos graxos acilados, precursores dos ácidos micólicos. O foco principal de nossa contribuição são dados descrevendo o modo de ação de um complexo inorgânico, pentaciano (isoniazida) ferrato II que não necessita de ativação pela KatG. Ademais é um inibidor do tipo ligação lenta da enoil redutase WT e resistente à INH de M. tuberculosis. Este complexo inorgânico representa uma nova classe de compostos líderes para o desenvolvimento de agentes antituberculose objetivando a inibição de um alvo validado.Nós também descrevemos os avanços recentes na busca por complexos inorgânicos com atividade antituberculose.
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Clonagem, expressão, purificação e caracterização da enzima citidina monofosfato quinase de Mycobacterium tuberculosis

Thum, Caroline January 2008 (has links)
Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000407067-Texto+Completo-0.pdf: 3459051 bytes, checksum: d1b647d03a940c703ad0b5b801bad1d2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis, remains the leading cause of mortality due to a bacterial pathogen. The proliferation rate of multidrugand extensively drug-resistant strains of M. tuberculosis is increasing worldwide. There is a continuous requirement for studies on mycobacterial metabolism to identify promising targets for the development of new anti-TB agents. In bacteria, pyrimidine nucleotide interconversion pathways are important in a number of essential processes, including DNA, RNA, and phospholipid biosynthesis. The gene (cmk, Rv1712) encoding cytidine monophosphate kinase (CMK) enzyme has been proposed by sequence homology to be present in the genome of M. tuberculosis. Here we describe PCR amplification and cloning of cmk gene, expression and purification of its product to homogeneity, and N-terminal sequencing and mass spectrometry analyses of the recombinant protein. Results of steady-state kinetics showed that M. tuberculosis cmk gene encodes a monomeric CMK that phosphorylates preferentially CMP and dCMP, and that UMP is a poor substrate. These results reinforce the presence of a nucleoside monosphosphate kinase specific for UMP in M. tuberculosis. Double-reciprocal plots of steady-state kinetic results were consistent with ternary complex formation and sequential mechanism for M. tuberculosis CMK reaction. A plausible role for CMK in M. tuberculosis is discussed. / A tuberculose (TB), doença infecto contagiosa, causada pelo Mycobacterium tuberculosis, é a maior causa de morte por agente infeccioso do mundo. O aumento da incidência de cepas multi-resistentes (MDR-TB) e extensivamente resistentes (XDR-TB) tem contribuído para o aumento do número de mortes. Por este motivo, há a necessidade de estudos para identificarmos, no metabolismo da micobactéria, possíveis alvos para o desenvolvimento de drogas capazes de combater estas novas cepas. Em bactérias, as rotas de interconversão de nucleotídeos pirimidínicos são importantes em inúmeros processos essenciais, incluindo a biosíntese de DNA, RNA e fosfolipídios. O gene (cmk, Rv1712) que codifica a enzima citidina monofosfato quinase (CMK) foi descrito, por homologia de seqüência, no genoma de M. tuberculosis. Neste trabalho o gene cmk foi amplificado por PCR e clonado em vetor de expressão. A proteína CMK foi expressa em grande escala e purificada. O produto homogêneo desta purificação sofreu seqüenciamento N-terminal e espectrometria de massa. Os resultados da cinética em estado estacionário mostraram que o gene cmk de M. tuberculosis codifica a proteína monomérica CMK, que fosforila preferencialmente CMP e dCMP, e que UMP é um substrato pobre. Estes resultados reforçam a presença de uma nucleotídeo monofosfato quinase específica para UMP em M. tuberculosis. Os parâmetros cinéticos fornecidos pelo ensaio e análise dos gráficos de duplo-recíproco mostraram que a enzima forma um complexo ternário e que seu mecanismo é seqüencial. Um possível papel para a enzima CMK é discutido.
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Caracterização parcial do elemento CCR em Staphylococcus aureus resistentes à meticilina isolados no sul do Brasil

Sturmer, Fabiana de Cássia Romanha January 2008 (has links)
Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000406669-Texto+Completo-0.pdf: 310441 bytes, checksum: d1c730c8194f34c27f407777f4296a87 (MD5) Previous issue date: 2008 / Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are important agents of nosocomial infection, to which considerable difficulty has been faced in order to obtain efficient antimicrobials. Methicillin resistance is codified by the gene mecA, which is located in a mobile genetic element named staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec). SCCmec also contains the ccr gene complex (ccrA and ccrB or ccrC), and the region J, which contains the genes responsible by the resistance against non beta-lactamic drugs. Five types of SCCmec have been described, being types I, II, and III the most common in nosocomial infections, while types IV and V are, usually, associated to community-acquired infections. In this sense, this study had the aim to characterize phenotypically and genotypically the methicillin resistance and phenotypically the vancomycin resistance of S. aureus isolates, as well as the associated ccr subtypes. Forty isolates from the “Serviço de Microbiologia do Laboratório de Análises Clínicas (LABIMED/Hospital de Caridade Astrogildo de Azevedo – Santa Maria/RS)” were evaluated. The minimum inhibitory concentrations to oxacillin and vancomycin were determined by agar dilution method. The detection of mecA and the ccr alotypes were performed by polymerase chain reaction (PCR). All isolates tested were considered resistant to oxacillin. No isolate were considered resistant to vancomycin, but 25% (10/40) presented intermediary resistance to vancomycin. The gene mecA was detected in all isolates. ccrAB1 was detected in nine isolates (22. 5%) and ccrAB3 in 23 (57. 5%). Eight isolates were characterized as non-ccrAB1 and non-ccrAB3. The proportion of ccrAB3, which is associated to SCCmec type III, suggests that the Brazilian epidemic clone (BEC) may also be present in the hospitals of Rio Grande do Sul State (Brazil).Considering that no ccr characterization was reported with in S. aureus isolates from this region of Brazil, this study may significantly contribute to the understanding of the MRSA dynamics in South America. / Os Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) encontram-se entre os principais agentes de infecção hospitalar, para os quais há grande dificuldade em se obter antimicrobianos para o seu controle. A resistência à meticilina é codificada pelo gene mecA, que está localizado em um elemento genético móvel denominado “staphylococcal cassette chromosome mec” (SCCmec). O SCCmec também possui o complexo gênico ccr (ccrA e ccrB ou ccrC) e a região J, que contém genes que conferem resistência a drogas não beta-lactâmicas. São conhecidos cinco tipos de SCCmec, os tipos I, II e III predominantes em infecções nosocomiais, enquanto os tipos IV e V são, mais comumente, associados a infecções adquiridas na comunidade. Neste contexto, este estudo se propôs a realizar a caracterização fenotípica e genotípica da resistência à meticilina de isolados de S. aureus e fenotípica da resistência à vancomicina, bem como a determinação dos subtipos de ccr associados. Para tanto, foram avaliadas 40 amostras de S. aureus obtidas no Serviço de Microbiologia do Laboratório de Análises Clínicas (LABIMED/Hospital de Caridade Astrogildo de Azevedo – Santa Maria/RS).A concentração inibitória mínima às drogas oxacilina e vancomicina foi determinada pelo método de diluição em agar. A detecção de mecA e dos alótipos de ccr foi realizada através da reação em cadeia da polimerase (PCR). Todos os isolados testados foram considerados resistentes à oxacilina. Nenhum dos isolados foi classificado como resistente à vancomicina; no entanto, 25% (10/40) dos isolados apresentaram resistência intermediária à vancomicina. O gene mecA foi detectado em todos os isolados. O ccrAB1 foi detectado em nove isolados (22,5%) e o ccrAB3 em 23 (57,5%). Oito isolados foram caracterizados como não ccrAB1 e não ccrAB3. A proporção de alótipos ccrAB3, associado a SCCmec tipo III, sugere que o clone epidêmico brasileiro (BEC) também possa estar presente nos hospitais do Estado do Rio Grande do Sul (Brasil). Considerando que a caracterização do ccr nunca havia sido relatada a partir de isolados desta região do Brasil, este trabalho pode contribuir para o estudo da dinâmica do MRSA na América do Sul.
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Ocorrência de trialelia no lócus da tireóide peroxidase (TPO): estudo de caso familial

Picanço, Juliane Bentes January 2010 (has links)
Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000423608-Texto+Completo-0.pdf: 504079 bytes, checksum: fc36e6004509d573c3484797487fe665 (MD5) Previous issue date: 2010 / Alleles at the TPOX STR locus have different numbers of a four-nucleotide repeat motif arranged in tandem. Although tri-allelic genotypes are generally rare, the TPOX tri-allelic pattern has a higher frequency, varying widely among populations. Despite this, there are few accurate reports to disclose the nature of the TPOX third allele. In this work we present data obtained from 45 individuals belonging to the same family, in which there are cases of tri-allelic TPOX genotypes. The studied subjects were apparently healthy with a normal biological development. We noticed six tri-allelic cases in this family, and all of them were women. In this genealogy the tri-allelic cases were 8; 10; 11 probably due to three copies of the TPOX STR sequence in all cells (Type 2 tri-allelic pattern). Karyotype analysis showed no occurrence of partial 2p trisomy. It was observed that both the alleles 8 and 11 were able to segregate independently. We suggested that allele 10 is the extra allele and its insertion took place far from the main TPOX locus. This was the first study that included a pedigree analysis in order to understand the nature TPOX tri-allelic pattern. / Os alelos encontrados no lócus TPOX têm diferentes números de arranjos de repetições de tetranucleotídeo dispostos em tandem. Embora os genótipos trialélicos sejam geralmente raros, as altas freqüências alélicas do genótipo TPOX variam de população para população. Apesar de uma freqüência considerável de trialelia no lócus da TPOX, existem poucos relatos precisos para identificar e/ou divulgar a natureza do alelo terceiro. Neste trabalho nós apresentamos dados obtidos de 45 indivíduos de uma mesma família, onde houve casos de trialelia no lócus TPOX. Observamos que entre os 45 indivíduos estudados todos se mostraram aparentemente saudáveis, com um desenvolvimento biológico normal. Constatamos seis casos de trialelia do TPOX nesta família, todos eles presentes em indivíduos do sexo feminino. Na genealogia estudada, o padrão tri-alélico foi devido à existência de três cópias da seqüência STR que é positiva para o anelamento com os primers desenhados para reconhecer o lócus TPOX. Identificou-se como uma trialelia do Tipo 2, a qual está presente em todas as células do indivíduo, e não em apenas um sub-grupo celular. Pela análise de cariótipo, descartou-se a ocorrência de trissomia parcial 2p. Todos os genótipos tri-alélicos foram compostos pelos alelos 8, 10 e 11. Foi observado que tanto o alelo 8 como o alelo 11 foram capazes de segregar independentemente. Nós sugerimos que o alelo 10 é o alelo extra e que sua inserção não está em desequilíbrio de ligação com o lócus da TPOX. Esse foi o primeiro estudo que incluiu uma análise de pedigree com a finalidade de entender a natureza de casos de trialelia do lócus TPOX.
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Avaliação da toxicidade induzida pela exposição à microcistina-LR sobre as neurotransmissões colinérgica e purinérgica em Zebrafish (Danio rerio)

Kist, Luiza Wilges January 2012 (has links)
Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000442001-Texto+Completo-0.pdf: 1823261 bytes, checksum: 10761416aa58c3d7680e6ff4e42ce20f (MD5) Previous issue date: 2012 / Microcystins (MCs) constitute a family of cyanobacterial toxins, with more than 80 variants. These toxins are able to induce hepatotoxicity in several organisms, mainly through the inhibition of protein phosphatases PP1 and PP2A and oxidative stress generation. Recent evidence shows that MCs can either accumulate in brain or alter behavior patterns of fish species. Thus, this thesis aimed to study the effects of MC-LR (with the variable amino acids leucine (L) and arginine (R)) exposure on biochemical parameters in zebrafish, emphasizing the cholinergic and purinergic signaling, as well as to evaluate the behavioral patterns and whole-body cortisol levels. In vivo studies showed that 100 μg/L MC-LR for 24 h led to a significant increase in the AChE activity (27%) when zebrafish were exposed to the toxin dissolved in water, but did not cause any significant changes when injected intraperitoneally. In addition, semiquantitative RT-PCR analysis demonstrated that 100 μg/L MC-LR exposure also increased ache mRNA levels in zebrafish brain. The in vitro assays did not reveal any significant changes in AChE activity. We also assessed behavioral patterns and whole-body cortisol levels of adult zebrafish exposed to cell culture of the microcystin-producing cyanobacterium Microcystis aeruginosa. MC-LR exposure (100 μg/L) decreased by 63% the distance traveled and increased threefold the immobility time when compared to the control group. Interestingly, no significant alterations in the number of line crossings were found at the same MC-LR concentration and time of exposure. When animals were exposed to 50 and 100 μg/L, MC-LR promoted a significant increase (around 93%) in the time spent in the bottom portion of the tank, suggesting an anxiogenic effect. In addition, the results also showed that none of the MC-LR concentrations tested promoted significant alterations in absolute turn angle, path efficiency, social behavior, or whole-body cortisol level. Moreover, we evaluated the acute effects of different concentrations of MC-LR on NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and 5'- nucleotidase in adult zebrafish (Danio rerio) brain membranes. The results have shown no significant changes in ATP, ADP and AMP hydrolysis in zebrafish brain membranes. MC-LR in vitro also did not alter ATP, ADP and AMP hydrolysis in the concentrations tested. These findings show that acute exposure to MC-LR did not modulate ectonucleotidases activity in the tested conditions. Taken together these findings provide the first evidence that brain AChE is another potential target for MCs and that MC-LR exposure significantly impairs animal`s exploratory performance. Nevertheless, further studies including long-time exposure should be performed in order to achieve a better understanding about MCLR toxicity mechanisms in the central nervous system. / Microcistinas (MCs) constituem uma família de toxinas, com mais de 80 variantes. Estas toxinas são capazes de induzir hepatotoxicidade em diversos organismos, principalmente através da inibição das fosfatases PP1 e PP2A e geração de estresse oxidativo. Evidências recentes mostram que MCs podem acumular no cérebro e alterar padrões comportamentais em diferentes espécies de peixes. Portanto, a presente tese teve por objetivo estudar os efeitos da exposição à MC-LR (com os aminoácidos variáveis leucina (L) e arginina (R)) sobre parâmetros bioquímicos em zebrafish, enfatizando os sistemas colinérgicos e purinérgicos, bem como, avaliar padrões comportamentais e níveis de cortisol corporal. Resultados do estudo in vivo mostraram que a exposição a 100 μg/L de MC-LR durante 24 h causaram um aumento significativo na atividade da AChE (27%) quando zebrafish foi exposto à toxina dissolvida em água; porém, a toxina não causou mudanças significativas quando injetada intraperitonealmente. Além disso, a análise semiquantitativa de RT-PCR demonstrou que a exposição à 100 μg/L de MC-LR também aumentou os níveis de RNAm da ache em cérebro de zebrafish. Os ensaios in vitro não revelaram nenhuma alteração significativa na atividade da AChE. Nós também avaliamos padrões comportamentais e níveis de cortisol corporal de zebrafish adultos expostos à cultura de células de Microcystis aeruginosa produtoras de MC-LR. A exposição à MC-LR (100 μg/L) diminuiu em 63% a distância viajada e aumentou três vezes o tempo de imobilidade quando comparado ao grupo controle. Interessantemente, não houve alteração no número de linhas cruzadas na mesma concentração e tempo de exposição à MC-LR. Quando animais foram expostos a 50 e 100 μg/L, a MCLR promoveu um aumento significante (aproximadamente 93%) no tempo gasto na porção inferior do aquário teste, sugerindo um efeito ansiogênico. Adicionalmente, os resultados também mostraram que nenhuma das concentrações de MC-LR testadas promoveu alterações significativas nas mudanças de ângulo, eficiência de rota e interação social ou, no nível de cortisol corporal total. Além disso, também foi avaliado o efeito de diferentes concentrações de MC-LR na atividade das NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase) e 5’nucleotidase em membranas cerebrais de zebrafish (Danio rerio) adultos. Os resultados mostraram que não houve alteração nas hidrólises de ATP, ADP e AMP. Nos experimentos in vitro também não houve alteração nas hidrólises dos nucleotídeos nas concentrações testadas. Estes achados mostram que exposição aguda à MC-LR não modulou a atividade das ectonucleotidases nas condições testadas. Ademais, fornecem a primeira evidência que a AChE cerebral é um outro alvo potencial das MCs e que exposição à MC-LR prejudica significativamente a performance exploratória do animal. Estudos futuros incluindo exposição de longo prazo dever ser feitos para um melhor entendimento dos mecanismos de toxicidade das MCs no Sistema Nervoso Central.

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