Myelin ist eine Membran von entscheidender Bedeutung. In Nervensystem von Wirbeltieren isoliert es die Axone und fördert so die schnelle Weiterleitung von Nervenimpulsen. Um als Isolator zu wirken, muss sich Myelin zu einer stabilen, Lipid-reichen Struktur zusammenlagern. Während die biochemische Zusammensetzung von Myelin gut beschrieben ist, sind Mechanismen, welche diese einzigartige Zusammensetzung regulieren, schlecht verstanden. In dieser Arbeit zeigen wir, dass Oligodendrozyten eine Art molekulares Sieb verwenden, um Membranproteine aus kompakten Myelin-Domain herrauszufiltern. Das Myelin Basische Protein (MBP) bildet eine Größen-abhängige Barriere und kontrolliert den Zugang von Proteinen in das kompakten Myelin, basierend auf der Größe ihrer zytoplasmatischen Domänen. Nur Proteine mit einer cytosolischen Domäne von weniger als 30 Aminosäuren können diese die Permeabilitätsbarriere überwinden. Im Hinblick auf den zugrundeliegenden Mechanismus zeigen wir, dass MBP nach Bindung an die innere Membran der Myelin-Doppelschicht mit sich selbst assoziiert und eine Phasentrennung auftritt. Diese Selbstorganisation erfordert hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Phenylalanin-Reste von MBP. Ein Ersetzen der Phenylalanin-Reste durch Serine hemmt die Selbst-Assoziation der MBP-Moleküle, ohne jedoch die Membranbindung zu beeinflussen. Wir zeigen weiter, dass die Selbst-Assoziation der MBP-Moleküle während der Entwicklung für die Verdrängung von sperrigen Proteinen aus den kompakten Myelin-Membranen benötigt wird. Dieses System könnte sich in Oligodendrozyten entwickelt haben, um eine anisotrope Membran-Organisation zu bilden, welche den Aufbau der der isolierenden, lipidreichen Membranen ermöglicht.

Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden Blutgefäßen, ist ein essentieller Prozess bei der Embryonalentwicklung, Wundheilung und Reproduktion. Dieser Prozess wird von Wachstumsfaktoren wie z. B. dem vascular endothelial growth factor (VEGF) und Zelladhäsionsmolekülen wie den Integrinen beeinflusst. Die Integrine avb3, avb5 und a5b1, sind in der Tumorangiogenese involviert, wobei die während des Tumorwachstums neu gebildeten Blutgefäße den Zugang einzelner Tumorzellen zum Blutgefäßsystem erleichtern. Zwar liegen Integrine auch auf Zellen in gesundem Gewebe vor, allerdings sind die Integrine avb3 und a5b1 besonders auf der Oberfläche aktivierter Endothelzellen und auf Tumorzellen verstärkt präsentiert. Dennoch gibt es noch immer kontroverse Ergebnisse bezüglich ihrer Rolle als pro- oder antiangiogene Moleküle. Zur Untersuchung der Funktionsweise der Integrine avb3, avb5 und a5b1 in der Tumorangiogenese wurden in dieser Arbeit intrazelluläre Antikörper, sogenannte Intra(dia)bodies, verwendet, um die Integrine innerhalb der Zelle zurückzuhalten und damit einen phänotypischen Knockout zu erzielen. Damit die Intra(dia)bodies in die Zellen gelangen konnten, wurden adenovirale Vektoren als Transfervehikel eingesetzt. In der vorliegenden Arbeit konnte mit Hilfe von Intra(dia)bodies, sowohl bei humanen Nabelschnurendothelzellen (HUVEC), als auch bei humanen Melanomzellen (M21), ein phänotypischer Knockout von avb3 erzielt werden, sowie ein gleichzeitiger Knockout/Knockdown von avb3/a5b1. Es konnte bei beiden Zelllinien gezeigt werden, dass dies eine verminderte Oberflächenpräsentation von avb5 und der b1-Untereinheit zur Folge hat. Die Endothelzellen waren durch den Verlust der genannten Integrine weder in der Lage, die Matrixmoleküle Fibronektin und Vitronektin zu binden, noch war es ihnen möglich, weiter zu proliferieren. Zudem konnten sich diese Endothelzellen in vitro nicht mehr dreidimensional anordnen und kapillarähnliche Strukturen bilden. Die Proliferation der Melanomzellen in vitro hingegen war trotz verminderter Adhäsion an die Matrixmoleküle Fibronektin und Vitronektin nicht beeinträchtigt. Zusätzlich zeigten die Melanomzellen in dem durchgeführten CAM-Assay, dass sie den Verlust der Integrine weitestgehend tolerieren können. Das Tumorwachstum war durch die fehlenden Integrine unbeeinflusst, wohingegen der phänotypische Knockout von avb3 zu einer beeinträchtigten Angiogenese führte. Um das Wirkungsspektrum zur Untersuchung der Integrine in der Angiogenese zu erweitern, konnten in dieser Arbeit erstmals bindende Fab-Fragmente gegen das Integrin avb5 selektiert werden. Diese können, nach Umwandlung in scFvs und genauerer Charakterisierung, als Intrabodies oder Intradiabodies verwendet werden.

Zusammenfassung Da die meisten Fälle männlicher Unfruchtbarkeit immer noch idiopatisch bleiben, könnte eine Untersuchung der Mechanismen, in denen Gene der Spermatogenese-Kontrolle involviert sind, helfen, die Gründe besser zu verstehen. Diese Arbeit besteht aus zwei Teilen die zwei verschiedene Aspekte humaner Fertilitätsforschung betreffen. Das erste Projekt betrifft die Analyse des coiled coil domain containing 33 (CCDC33) Proteins und seiner Rolle als peroxisomal testis specific 1 (PXT1) Interaktionspartner. Im zweite Projekt haben wir die Ursache männlicher Unfruchtbarkeit in Mäusen mit multiplen knockouts bestimmt und den Phänotyp anlaysiert. Folgende Gene wurden ausgeknocked: Tnp2, Hist1h1t, Theg, Acr, Creb3l4 and Tex22. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Domänen, die bei der CCDC33 und PXT1-Interaktion beteilgt sind, identifiziert. Die Interaktion dieser beiden Proteine wurde duch Kaczmarek identifiziert (Kaczmarek, 2009). Wir zeigten, dass nicht die coiled coil Domänen für die Interaktion mit PXT1 verantwortlich sind, sondern eine Aminosäuresequenz welche der Sequenz in Leucin-reichen Domänen ähnlich ist. Durch induzierte Mutagenese in der PXT1-Sequenz haben wir Aminosäuresequenzen identifiziert, die für die Interaktion von PXT1 und CCDC33 bedeutend sind. PXT1 ist ein erstes peroxisomales Protein das eine funktionale BH3-ähnliche Domäne enthält, die dafür bekannt ist Apoptose zu induzieren. Aufgrund von Experimenten mit Co-transfizieretn HeLa Zellen konnten wir eine Co-Lokalisation von CCDC33 und PXT1 im Zytoplasma nachweisen. Zudem zeigten Zellen mit Co-Lokalisation beider Proteine eine Reduktion der Apoptoserate im Vergleich zu Zellen die nur mit dem PXT1-Konstrukt transfiziert waren. Dieser Befund könnte suggerieren, dass die physikalische Bindung beider Proteine die PXT1-induzierte Apoptose verhindert. Durch Western Blot und immunhistochemische Experimente konnten wir zeigen, dass das CCDC33 Protein in den Hoden während der Spermatogenese ab dem Spermatocyten- Stadium lokalisiert ist. Sowohl die Interaktion von CCDC33 und PXT1 als auch das Expressionsmuster beider Gene implizieren, dass Ccdc33 in der Kontrolle der Spermatogenese involiert sein könnte. Wir postulieren, dass CCDC33 ein neues peroxisomales Protein sein könnte, welches Apoptose während der Spermatogenes reguliert. Jedoch sind weitere Untersuchungen, u.a. die Analyse von CCDC33 knockout Maus-Modellen, nötig, um feststellen zu können ob Ccdc33 für die männliche Fertilität essentiell ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Analyse von knockout Mäuselinien, in denen 6 keimzellspezifische Gene funktionsunfähig gemacht wurden, beschrieben. In ca. 20% der Mäuse wurde Unfruchtbarkeit festgestellt. In beiden, männlichen fruchtbaren und unfruchtbaren 6xKO Mäusen, ist die Zahl an Spermatozoa mit abnormalen Kopf erhöht und Sperma-Motilität reduziert. Nach Kreuzung von weiblichen wildtyp Mäusen mit männlichen 6xKO Tieren, benötigte das Sperma bemerkenswert längere Zeit um die Oocyte zu befreuchten as im Vergleich zu WT Sperma. Die Unterschiede im Phänotyp der 6xKO Mäuse sind sowohl dem genetischen Hintergrund als auch der Inaktivierung der sechs keimzellspezifischen Gene zuzuschreiben. Um genauer zu untersuchen welche Gene bei der Unfruchhtbarkeit der 6xKO Mäuse involviert sein könnten haben wir ein Transkriptom Assay durchgeführt und die Genexpression in den Hoden von 5xKO Tieren, die fertil waren, mit der in 6xKO Mäusen, die infertil waren, verglichen. Wir haben ein neues Gen, 4933400A11Rik, identifiziert und charakterisiert, welches für die Unfruchtbarkeit männlicher 6xKO Mäuse verantwortlich sein könnte. In WT Mäusen ist 4933400A11Rik in den Keimzellen exprimiert. 4933400A11Rik mRNA wurde ab Tag 16 post partum, wenn primäre Spermatozyten produziert werden, bis zu den ausgewachsenen Spermien detektiert. Es ist jedoch nicht klar, ob die mRNA die in den Spermien entdeckt wurde ein Ergebniss der Expression von 4933400A11Rik sind, oder ob es sich dabei um restliche Moleküle handelt welche während der Spermatogenese nicht abgebaut wurden. 4933400A11RIK weist Sequenzähnlichkeiten zur Aktinfilament capping Proteinfamile auf. Wir zeigten, dass 4933400A11RIK mit F-Aktin capping Protein Untereinheit alpha-1 colokalisiert. Proteine dieser Familie sind bekannt dafür das Wachstum des Zytoskeletts durch Regulation der Aktinfilament-Reorganisation zu kontrollieren. Deregulation der Aktinzytoskelett-Reorganisation in Keimzellen könnte die zugrundeliegende Ursache der männlichen Unfruchtbarkeit in 6x KO Mäusen sein, denn 4933400A11Rik wird in den Hoden fertiler 6xKO Mäuse, aber nicht in den Hoden infertiler 6xKO Mäuse exprimiert. Um die Frage eindeutig zu beantworten, ob das Gen 4933400A11Rik die Fertilität beeinflusst, sollten 4933400A11Rik knockout Mäuse generiert und analysiert werden. Das ´Rescue-Experiment´ könnte ebenso die Involvierung dieses Gens bei männlichen Fertilität bestätigen. Zusammenfassend präsentiert diese Arbeit interessante Erkenntnisse über die potentielle Funktion von CCDC33 bei der Regulation der Spermatogenese. Außerdem zeigen wir kumulierte Effekte von 6 keimzellspezifischen Genen und einem neuen Gen, 4933400A11Rik, welches für die weitere Forschung männlicher Unfruchtbarkeit interessant sein könnte.

Die Regulation des sekundären Metabolismus und der Entwicklung in Aspergillus nidulans sind zwei miteinander verbundene Prozesse. Ihre Regulation geschieht in Abhängigkeit von Licht. Die molekulare Grundlage dieser Verbindung ist ein Komplex bestehend aus den beiden Velvet-Proteinen VeA, VelB und der putativen Methyltransferase LaeA. Ein weiteres Protein der Velvet-Familie ist VosA, dass in Verbindung mit VelB eine essenzielle Rolle in der Sporogenese und Biosynthese von Trehalose spielt. Bisheriges Wissen über die generelle Funktion der einzelnen Proteine basiert überwiegend auf in vivo Analysen. Unbekannt hingegen ist die molekulare Funktionsweise sowie Struktur dieser Proteine. Zu diesem Zweck wurde in der vorliegenden Arbeit versucht dieses Defizit durch eine röntgenkristallographische Strukturanalyse der Proteine aufzuheben.

No description available.

No description available.

No description available.

Autophagie ist ein Degradationsprozess der streng reguliert ist und in welchem eine eukaryotische Zelle zelleigene Organellen und Proteine bei Nährstoffmangel abbaut. Außerdem konnte gezeigt werden, dass dieser Prozess auch in verschiedene Entwicklungsprozesse involviert ist. Die molekulare Entschlüsselung der Autophagie wurde hauptsächlich in der Bäckerhefe S. cerevisiae vorgenommen. Allerdings ist Beteiligung der Autophagie an Entwicklungsprozessen in multizellulären filamentösen Ascomyceten weitestgehend unbekannt. Die Fruchtkörperentwicklung von Pilzen ist ein komplex gestalteter Differenzierungsprozess der von einem zwei-dimensionalem Pilzgeflecht ausgeht das sich zu einem dreidimensionalem Perithezium entwickelt. Die Fruchtkörperentwicklung erfordert spezifische Umgebungsbedingungen und wird durch viele entwicklungsassoziierten Genen reguliert. In dieser Studie diente der Modellorganismus Sordaria macrospora zur Untersuchung des Einflusses der Autophagie auf die Fruchtkörperentwicklung. Der coprophytische filamentöse Ascomycet S. macrospora pflanzt sich lediglich sexuell fort, was ihn ideal für die Fragestellung dieser Arbeit macht. Für diese Arbeit wurden eine Reihe konservierter Autophagie bezogener Gene auserwählt. Folgende Gene die homolog zu denen anderer Ascomyceten sind wurden isoliert: Smvps34, Smvps15, Smatg8, Smatg4, und Smjlb1. Durch die Deletion dieser Gene sollte geklärt werden wie Autophagie in die Fruchtkörperentwicklung involviert ist. Die Deletion des Phospolipidkinase Gens Smvps34 und des Proteinkinase Gens Smvps15 führte zur Lethalität von S. macrospora was durch eine Auskeimungsuntersuchung belegt wurde. Die Deletion des Gens Smatg8, welches eine autophagosomale Strukturkomponente kodiert und des Gens Smatg4, das eine Cystein-Protease kodiert, die SmATG8 prozessiert, beeinträchtigte ebenfalls die Fruchtkörperentwicklung und das vegetative Wachstum. Durch Fluoreszenzmikroskopie konnte gezeigt werden, daß SmATG8 in Autophagosomen lokalisiert und SmATG4 vorwiegend im Zytoplasma lokalisiert ist. Die Prozessierung von SmATG8 durch SmATG4 wurde ebenfalls durch Fluoreszenzmikroskopie und Western-blot Analyse bestätigt. Die heterologe Expression von Smatg8 und Smatg4 in S. cerevisiae und der Ape1 Reifungsuntersuchung zeigte, das die cDNA von Smatg8 und Smatg4 den Deletionsphenotyp der jeweiligen Hefedeletionsmutanten aufheben konnte. Somit konnte die Konservierung dieser beiden Gene innerhalb der Ascomyceten gezeigt werden. Die Blockade der Fruchtköperentwicklung wurde durch die Deletion des bZIP Transkriptionsfaktor Gens Smjlb1 verursacht genauso wie die Beeinträchtigung des vegetativen Wachstums. SmJLB1 ist im Kern lokalisiert und durch qRT-PCR Experimente wurde gezeigt, dass die Autophagiegene Smatg8 und Smatg4 durch Smjlb1 reguliert werden. Dies läßt vermuten, dass Smjlb1 in den Prozess der Autophagie involviert ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass Autophagie und Fruchtkörperentwicklung des filamentösen Pilzes S. macrospora streng miteinander verknüpft sind.

No description available.

No description available.