Pas de résumé / Pas de résumé

Pas de résumé / Chronic Kidney Disease (CKD) and its progression has become an important public health issue owing to its strong links to cardiovascular morbidity and mortality. To understand molecular pathways implicated the process of CKD progression is several-fold useful. It can enable drug development inhibiting identified pathways. It provides us with potentially measurable molecules for patient categorisation and treatment. In this translational medicine project, we move from the bench, understanding the role played by signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) to the bedside, measuring and identifying urinary molecules in patients all in the context of CKD progression. Thus we identified potential downstream effectors of STAT3 in CKD progression: lipocalin 2, TIMP1 and PDGFB. To achieve this we combined an approach of in vivo, in silico and in vitro methods. We observed on immunohistochemistry the activation (phosphorylation) specifically of tubular STAT3, in mice sensitive to subtotal nephrectomy (Nx) prior to their development of fibrosis and confirmed that genetic deletion of STAT3 in the tubules protected the mice kidneys. Exploiting microarray data, from remnant kidneys of mice with different susceptibilities to Nx, and combining this with in silico data of potential STAT3 DNA binding sites (DBS) provided genes differentially regulated by STAT3. In the upregulated genes, in which the DBS were conserved in 4 or more species, we identified and confirmed on RT-PCR (both in the remnant kidneys and in a mouse cell line and independently in IMCD3 cells), genes regulated by deletion of STAT3. We specifically studied secreted factors along the hypothesis of a crosstalk between renal tubular cells with activated STAT3 inducing secreted factors to activate nearby resident fibroblasts to secrete collagen and thus induce fibrosis. In parallel, we examined molecules known to be involved in the pathological processes of CKD progression. We rigorously validated the use of 16 commercialised ELISA kits in the urine following strict industry criteria and excluded 14 failing to meet the criteria in a pilot study of 75 subjects. We next took advantage of a well-characterised cohort of 229 patients with CKD with different rates of progression, as determined by serially measured glomerular filtration rates (mGFRs). We measured by the validated ELISA kits the molecules in the urine collected at baseline visit. We identified a combination of urinary biomarkers that can predict fast progression (i.e. degradation in mGFR at > 10% baseline mGFR/ year) after taking into account demographic risk factors for progression and albuminuria. The three biomarkers identified were EGF, MCP1 and TGF-α.

Huntingtin interacting protein-1 (HIP1) et Huntingtin interacting protein-1-related (HIPIR) ont été identifiées comme des protéines intervenant dans l'endocytose médiée par les vésicules de clathrine par leurs interactions avec d'autres protéines endocytaires. Pour mieux comprendre les rôles attribués à HIP1/R dans cette machinerie, nous avons procédé à l'identification de nouveaux partenaires d'interaction. Au cours de notre étude, nous avons identifié HSC70 (Heat-shock Cognate Protein70) comme un nouveau partenaire pour les domaines TALIN des deux protéines par des essais de pull-down et analyse par spectrométrie de masse. Au cours de cette étude nous avons identifié également que l'association d'HSC70 avec le domaine TALIN d'HIPIR, compromet sa sédimentation avec les filaments d'actine. HIPIR est une composante du manteau de clathrine, son interaction avec HSC70 l'a impliquée dans le démantèlement des vésicules. Dans cette étude, nous avons vérifié l'intervention d'HIPIR dans le démantèlement de la clathrine suite à son interaction avec HSC70 et la relation de ce mécanisme avec la perte d'interaction avec l'actine.

HIP1R (Huntingtin interacting protein 1-related) a des rôles dans l'endocytose médiée par la clathrine, l'apoptose et la mitose. Elle induit l'assemblage de la clathrine, régule la polymérisation de l'actine, contribue au clivage de la caspase-9 et aide l'ancrage des chromosomes sur les microtubules lors de la métaphase. Les domaines protéiques responsables de ces contributions et les facteurs permettant à HIP1R de changer de rôle ne sont pas encore bien connus. Nous avons utilisé la technique du knock-down et nous avons réintroduit des versions mutées ou tronquées d'HIP1R pour caractériser ses rôles en modifiant ses liaisons avec ses partenaires. Les résultats indiqueraient qu'HIP1R participe principalement à l'internalisation des plaques de clathrine et qu'HIP1R n'induit pas l'activation de la caspase-3. Finalement, nous avons montré que la liaison d'HIP1R avec la clathrine lui confère son rôle lors de la mitose lui permettant ainsi de se localiser sur les microtubules pendant la métaphase.

L'isocaryophyllène, un sesquiterpène d'origine végétale, s'est révélé toxique contre plusieurs lignées de cellules cancéreuses tout en étant significativement moins toxique envers les cellules saines. Cette molécule pourrait, par conséquent, être éventuellement intégrée à un traitement anticancéreux. Toutefois, son mécanisme d'action est inconnu. Le projet rapporté dans le présent mémoire a pour but de caractériser le mécanisme d'action de l'isocary ophyllène. Pour atteindre cet objectif, les effets de l'isocary ophyllène sur une lignée de cellules tumorigènes, les cellules L-929 (fibrosarcomes murins), ont été étudiés. L'administration d'isocaryophyllène à ces cellules s'est accompagnée d'une génération d'espèces oxygénées réactives (ROS). Une peroxydation des lipides membranaires et une perméabilisation de la membrane plasmique ont aussi été observées. La protection des membranes plasmiques avec un antioxydant liposoluble, l'a-tocophérol, a diminué la cytotoxicité de l'isocaryophyllène. À l'inverse, la protection avec un antioxydant hydrosoluble, le trolox, s'est révélé sans effet. Aucune implication du glutathion (GSH) et de la chaîne de transport des électrons n'a été observée dans le processus. Toutefois, certains indices permettraient d'envisager la possibilité que l'isocaryophyllène est oxydé par l'anion superoxyde pour former un époxyde. Cet époxyde pourrait avoir un rôle dans la toxicité de la molécule.

Pas de résumé / No abstract

Le pancréas est une glande amphicrine composée de cellules exocrines et de cellules endocrines. Parmi les cellules endocrines, organisées en îlot de Langerhans, les cellules ß sécrétrices d’insuline en réponse à des stimuli précis, sont essentielles pour l’homéostasie du glucose. Des perturbations tant au niveau qualitatif qu’au niveau quantitatif sont responsables de différentes pathologies telles les diabètes ou certaines formes de tumeurs endocrines. De récentes publications suggèrent que l’état de différenciation de la cellule ß pancréatique mature n’est pas immuable et montrent que le maintien d’un phénotype mature de la cellule est un processus dynamique. Différents modèles de souris mutantes (avec perte ou gain d’un facteur de transcription) montrent une perte de l’identité de la cellule ß. Cette plasticité altère la synthèse, le stockage et la sécrétion d’insuline. En plus de la perte d’identité, caractérisée par la diminution de l’expression de marqueurs de la cellule ß (MAFA, NKX6-1), les cellules ré-expriment des marqueurs de progéniteurs (NGN3, SOX9) : on parle de dédifférenciation. Cette dédifférenciation serait un mécanisme clé dans la diminution de la masse de cellules ß fonctionnelles au cours du diabète de type 2. Le but de ma thèse a été d’étudier le rôle du facteur de transcription SOX9 dans le contexte de la perte d’identité de la cellule ß humaine. SOX9 est exprimé dans les progéniteurs multipotents pancréatiques et joue plusieurs rôles cruciaux au cours du développement de l’organe. Bien qu’un rôle important de SOX9 fut attribué au cours de l’organogénèse du pancréas, il y a de plus en plus de données suggérant qu’il a des rôles additionnels dans le pancréas matures qui semble aussi importants que son rôle au cours du développement. C’est le cas notamment des cellules formant les canaux pancréatiques. D’un autre côté, pour les cellules endocrines, et plus particulièrement les cellules ß, SOX9, normalement absent de la cellule ß saine, est ré-exprimé dans ces cellules dans des conditions pathologiques (diabètes, tumeurs neuroendocrines du pancréas). Une expression ectopique de SOX9 dans les cellules ß induit un phénotype diabétique. Alors qu’il y a de plus en plus d’observation de l’expression de SOX9 dans la cellule ß, il y a très peu de connaissance sur les mécanismes moléculaires et les cibles de ce facteur de transcription dans les cellules ß humaines. Dans un premier temps, nous avons disséqué différents mécanismes impliqués dans l’induction de l’expression de SOX9. Pour cela, nous avons développé des conditions mimant des contextes pathologiques (diabètes, tumeurs neuroendocrines du pancréas VHL) en utilisant les cellules ß humaines EndoCßH1, récemment développées au sein du laboratoire. Dans un deuxième temps, nous avons développé des outils moléculaires afin d’identifier les cibles de SOX9 dans la cellule ß humaine (dominant positif, dominant négatif). Pour finir, nous avons analysé les cibles potentielles de SOX9 dans différentes conditions pathologiques. / No abstract

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie multisystémique dominante qui représente la myopathie la plus fréquente chez l’adulte. Le muscle squelettique est particulièrement affecté : il s’atrophie et perd 1 à 3 % de sa force maximale par année. Les interventions cliniques sont sécuritaires en DM1 et certaines études rapportent même des augmentations de force musculaire. Toutefois, les dosages optimaux et les mécanismes physiologiques expliquant ces gains demeurent inconnus. Afin d’élucider ces questions, ce mémoire se divise en deux volets. Le premier volet (objectif 1) présente une revue systématique de type scoping review, qui résume les connaissances portant sur l’effet des interventions cliniques sur le muscle squelettique chez les personnes affectées par la DM1 et qui identifie les manques d’évidences scientifiques à ce sujet. Le second volet (objectif 2) étudie l’effet de l’exercice excentrique aigu sur les voies de signalisation de synthèse et de dégradation protéique dans le muscle squelettique. Pour ce second volet, 10 hommes atteints de DM1 ont accepté de participer à une séance unique d’exercice excentrique et de subir une biopsie musculaire avant et après l’exercice. La revue systématique rapporte que des gains de force sont possibles chez des individus atteints de DM1, cependant les résultats rapportés sont très hétérogènes. De plus, il existe de grandes lacunes au sujet de la compréhension des mécanismes physiologiques sous-jacents. Les résultats obtenus dans la réalisation du second volet de ce mémoire démontrent également une grande hétérogénéité dans les réponses observées chez les patients atteints de DM1. Par contre, ceux-ci suggèrent que, malgré le défaut génétique, les mécanismes impliqués dans l’hypertrophie semblent similaires à ceux rapportés chez le sujet sain. L’ensemble de ces connaissances aidera à guider les professionnels de la santé dans la prescription d’exercice à cette population dans le but d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes.

LAT1, also named SLC7A5, is a human plasma membrane transporter covalently associated with the glycoprotein CD98 (SLC3A2). It catalyses the uptake of several essential amino acids, including leucine, thereby contributing to the activation of the mTORC1 (mechanistic Target of Rapamycin Complex 1) kinase complex. This control of mTORC1 by LAT1 is notably important for the rapid proliferation of tumour cells. Moreover, LAT1 overexpression has been observed in numerous cancers, and is often associated with a poor prognosis. Despite the importance of LAT1 in normal and tumour cells, the mechanisms controlling the intracellular traffic of this transporter, and particularly its endocytosis, are still poorly known.Many plasma membrane transporters are downregulated by endocytosis, in response to various signals. In yeast, endocytosis of plasma membrane permeases is triggered by their ubiquitylation mediated by the ubiquitin ligase Rsp5, acting in association with adaptors of the α-arrestin family. Ubiquitin also plays an important role in endocytosis of many human transporters. The main objective of this thesis work was to characterize the mechanisms mediating endocytosis of LAT1 in HeLa tumour cells.In the first part of this work, we studied the effect of FTY720, an analog of sphingoid bases with antitumor properties, on a HeLa T-Rex stable cell line expressing a LAT1-GFP construct. We also analysed the effect of FTY720 on several yeast plasma membrane permeases. Our results show that FTY720 induces a loss of activity and the endocytosis of permeases in yeast and of LAT1 in HeLa cells. Yeast permease internalization is associated with their ubiquitylation by the Rsp5 ubiquitin ligase. Moreover, FTY720 decreases TORC1/mTORC1 activity. Based on these results, we propose a model for the effect of FTY720 in yeast: this drug, by decreasing the activity of numerous nutrient transporters, leads to TORC1 inhibition. This loss of TORC1 activity promotes, via a still unknown mechanism, the Rsp5-dependent ubiquitylation and endocytosis of permeases. A similar mechanism could be responsible for FTY720-induced endocytosis of LAT1 in HeLa cells.In the second part of this work, we further investigated the mechanisms involved in LAT1 endocytosis. We found that LAT1 is internalized and degraded upon activation of protein kinase C (PKC) by the phorbol ester PMA. This treatment also elicited the ubiquitylation of LAT1 via the Nedd4-2 ubiquitin ligase. Finally, we identified the lysines 19, 25 and 30 in the N-terminal tail of LAT1 as the major sites of its ubiquitylation in response to PMA, and we showed that these lysines are important for PMA-induced downregulation. Future work will determine the importance of this control mechanism of LAT1 in the context of normal and tumour cells. / Ce travail porte sur l’étude du transporteur d’acides aminés humain LAT1, également appelé SLC7A5. LAT1, situé à la membrane plasmique où il est associé à la protéine CD98 (SLC3A2), est le transporteur principal de leucine dans les cellules et joue un rôle central dans l’activation de mTORC1 par cet acide aminé. Ce transporteur est surexprimé dans les cellules de nombreuses tumeurs, dans lesquelles il est souvent associé à un mauvais pronostic. Le trafic intracellulaire de LAT1 et, en particulier, son endocytose sont très peu connus. Mon travail de thèse a eu pour but d’étudier l’endocytose de LAT1 et les facteurs impliqués dans ce mécanisme. Dans la première partie de cette recherche, nous avons étudié l’effet du FTY720, un analogue de bases sphingoïdes, sur une lignée stable de cellules HeLa TRex exprimant LAT1-GFP, et nous l’avons comparé à son effet dans la levure. Nous avons observé que ce composé induisait une diminution de l’activité et l’endocytose de nombreux transporteurs de nutriments chez la levure ainsi que de LAT1 dans les cellules HeLa. De plus, l’internalisation des perméases de levure en réponse au FTY720 est associée à leur ubiquitylation, via l’ubiquitine ligase Rsp5. Nous avons également montré que ce composé diminue l’activité du complexe kinase TOR1/mTOR1. Ces différents résultats nous ont amené à l’hypothèse suivante :le FTY720, en induisant une perte d’activité de nombreux transporteurs de nutriments chez la levure, inhibe TORC1. Cette perte d’activité de TORC1 activerait, via un mécanisme encore inconnu, l’ubiquitylation et l’endocytose Rsp5-dépendante des perméases. Un mécanisme similaire pourrait être responsable de l’endocytose de LAT1 dans les cellules HeLa.Dans une seconde partie, nous avons étudié les facteurs impliqués dans l’endocytose de LAT1 en réponse à un second composé, le PMA, un activateur de la PKC. Nous avons montré que ce composé induit l’internalisation et l’ubiquitylation de LAT1 via l’activation de la PKC. Nous avons trouvé que cette modification dépend de l’ubiquitine ligase Nedd4-2. De plus, les lysines 19, 25 et 30 semblent être les cibles principales de l’ubiquitine ligase. En effet, une diminution importante de l’ubiquitylation et de la localisation intracellulaire de LAT1 en réponse au PMA est observée dans un mutant LAT1K19R,K25R,K30R. D’autres études seront nécessaires pour évaluer l’importance de ce mécanisme de régulation de LAT1 dans les cellules saines et cancéreuses. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) correspond à une dilatation progressive de l’aorte dont la complication principale, et potentiellement mortelle, est la rupture. La physiopathologie de l’AAA est complexe mais elle comporte une destruction des fibres élastiques liée à l’activité des métalloprotéinases (MMPs) matricielles, une apoptose des cellules musculaires lisses et une infiltration inflammatoire chronique. Actuellement, il n’existe aucun traitement pharmacologique permettant de limiter la progression et la rupture de l’AAA. Les fibroblastes gingivaux (FGs) sont des cellules multipotentes anti-inflammatoires qui permettent une réparation parfaite de la gencive sans cicatrice ni fibrose. Ces propriétés font des FGs un candidat potentiel pour une approche de thérapie cellulaire de l’AAA. Les FGs murins cultivés in vitro produisent une grande quantité de TIMP 1, un inhibiteur des MMPs. Lorsque les FGs sont implantés autour de l’aorte, ils survivent, prolifèrent et s’organisent en une épaisse couche cellulaire au niveau de l’adventice. In vivo, les FGs produisent au niveau de la paroi aortique de l’IL-10, du TGF-β, du collagène et du TIMP-1. Parallèlement les FGs inhibent l’activité protéolytique de la MMP-9. Dans un modèle d’AAA induit par l’élastase, les FGs inhibent la dégradation de l’élastine, l’infiltration macrophagique et lymphocytaire ainsi que la croissance des AAA. L’invalidation génétique de TIMP-1 dans les FG abolit leur effet protecteur sur le remodelage aortique et la formation des AAA. Dans un second modèle d’AAA induit par l’infusion d’angiotensine II et l’injection d’anticorps neutralisant anti-TGF-β, les FGs limitent localement le développement de la maladie vasculaire et préviennent la rupture de l’aorte abdominale. L’ensemble de ces données expérimentales suggère qu’une approche de thérapie cellulaire utilisant les FG pourrait permettre de ralentir la croissance de l’AAA et in fine sa rupture. / Abdominal aortic aneurysm (AAA), frequently diagnosed in old patients, is characterized by chronic inflammation, vascular cell apoptosis and metalloproteinases-mediated extracellular matrix destruction. Depiste improvement in the understanding of the pathophysiology of the aortic aneurysm disease, no pharmacological treatment is available to limit dilatation and/or rupture. In the study reported here, we tested whether periadventitial allograft of GF prevented abdominal aortic aneurysmal growth and rupture in mice and investigated the mechanisms of vascular protection. In vitro, mouse GF proliferated and produced large amounts of anti-inflammatory cytokines and Timp-1, an inhibitor of metalloproteinases. When layed down in the periadventitial abdominal aorta, we documented that GF survived in vivo, proliferated and organized as a thick layer. Furthermore, GF locally produced Il-10, TGF-β and Timp-1. In an elastase-induced AAA, GF prevented both macrophage and lymphocyte infiltration, elastin degradation and aneurysm growth. Specific invalidation of Timp-1 in GF abolished the beneficial effect of cell therapy. In an Angiotensin II/anti-TGF-β model of AAA, GF cell therapy limited AAA development and prevented abdominal rupture. Gingival fibroblast is a promising cell therapy approach to inhibit aneurysmal progression and rupture through the local production of Timp-1.